CRISPR/Cas9基因编辑技术介导SST基因敲除细胞的制备

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备了SST基因敲除的细胞。在猪SST基因第一外显子区域设计2个向导RNA (sgRNA),用PX459构建成表达质粒,电转染猪胎儿的成纤维细胞,在48 h后用嘌呤霉素筛选细胞。通过PCR扩增、测序检测,在获得的13个克隆中,有2株细胞未检测到基因敲除,4株细胞发生单等位基因敲除,7株细胞为双等位基因删除。筛选到的纯合子单克隆细胞可用于制备SST基因删除猪。     

应用半乳糖表型差异高效筛选α-1,3半乳糖苷转移酶基因缺失的猪成纤维细胞

【目的】筛选α-1,3半乳糖苷转移酶(α1,3galactosyl transferase,GGTA1)基因缺失的猪成纤维细胞。【方法】用同源重组载体pBS-GGTA1-SKO和pBS-GGTA1-DKO电转染GGTA1单等位基因敲除(GGTA1+/-)的五指山小型猪胎儿成纤维细胞,利用磁激活细胞分选(MACS)、MACS联合流式细胞术(FACS)、TcdA联合FACS等3种方法进行细胞筛选;对MACS筛选获得的单细胞克隆进行PCR和FACS鉴定,对MACS联合FACS、TcdA联合FACS获得的细胞集落进行PCR鉴定。【结果】经MACS筛选获得了11个细胞克隆,经鉴定2个是GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为18.2%;MACS联合FACS筛选获得了3个细胞克隆,经鉴定无GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为0;TcdA联合FACS筛选获得了3个细胞克隆,经鉴定均为GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为100%。【结论】MACS法筛选和TcdA联合FACS法筛选这2种方法均可以高效筛选出GGTA1双等位基因缺失的猪成纤维细胞,可用于进一步制备供异种器官移植的基因修饰小型猪。     

利用CRISPR/Cas9系统构建猪PFKM基因定点突变细胞株

肌型磷酸果糖激酶(PFKM)是作用于果糖-6-磷酸生成果糖-1,6-双磷酸的关键调节酶,在机体葡萄糖代谢、肌肉发育等多个生物过程中起关键作用。根据猪PFKM序列结构特点设计sgRNA序列并构建CRISPR/Cas9基因敲除质粒。敲除质粒转染猪PK15细胞并经嘌呤霉素筛选,极限稀释法筛选出单细胞克隆,提取各个细胞克隆DNA,利用PCR扩增敲除区域序列,通过序列测定确定是否敲除成功,利用实时荧光定量PCR及Western blot分别检测PFKM mRNA及蛋白质表达水平。结果表明:转染CRISPR/Cas9基因敲除质粒筛选到的单细胞克隆中,有2株细胞PFKM基因序列发生基因突变,其中1个克隆为碱基插入,另1个为碱基插入、替换及缺失; qRT-PCR定量检测结果表明,筛选到1株细胞PFKM mRNA表达量下降89.41%,差异极显著。Western blot检测结果表明,与正常细胞组相比, 2组敲除细胞株中PFKM蛋白表达量分别下降78.77%、81.63%,差异显著。这一研究显示利用CRISPR/Cas9系统成功获得了2株PFKM基因敲除细胞株,为后续研究PFKM基因在猪肌肉发育、能量代谢及线粒体功能等方面的作用奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9技术构建猪的LDLR基因敲除细胞

利用CRISPR/Cas9系统构建猪的低密度脂蛋白受体基因LDLR敲除细胞：根据NCBI数据库猪LDLR基因(Gene ID为396801)序列设计sg RNA靶位点，构建敲除打靶载体，通过电转染猪胎儿成纤维细胞，经G418筛选获得细胞克隆，进行PCR扩增和T载体克隆测序，经序列比对计算基因敲除效率。结果表明，依照CRISPR/Cas9系统GN20GG法则，在LDLR基因第一外显子上设计1条sg RNA，测序结果显示靶序列已正确连接，转染、筛选后共获得30个单细胞克隆，23个测序成功，其中有7个细胞克隆为LDLR基因敲除细胞克隆，敲除效率为30.4%。     

白念珠菌CaFIG1基因缺失突变株的构建

[目的]研究Ca FIG1基因除参与有性生殖过程外,是否还参与细胞钙稳态等其他功能,对Ca FIG1进行基因敲除。[方法]采用2种方法分别敲除Ca FIG1的2个等位基因,一种通过PCR扩增HIS1敲除盒,另一种通过克隆的手段构建URA3敲除盒。[结果]从白念珠菌RM1000中成功敲除了Ca FIG1双等位基因。[结论]该敲除策略同样适用于其他基因的敲除,提高了基因敲除的效率。     

同源重组敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞的构建

 【目的】获得敲除肌肉生长抑制素（MSTN）基因的猪胎儿成纤维细胞。【方法】打靶载体的构建：以Neo为正筛选基因、HSV-tk为负筛选基因。在Neo的两侧分别插入同源长臂和同源短臂。同源长臂5 382 bp,包含MSTN基因的部分5′端,全部的exon1,intron1和exon2及大部分intron2;同源短臂844 bp,包含部分exon3及3′端的部分序列。取35 d胎龄的大白猪,用胰酶消化法,分离胎儿成纤维细胞并对其进行培养和建系。采用脂质体法将打靶载体导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用250 μg?ml-1 G418筛选7 d,再用200 μg?ml-1 G418+2μmol?L-1 GANC维持筛选。用RT-PCR法检测转染前转染后细胞MSTN基因表达量。【结果】成功构建了对猪MSTN基因部分intron2和exon3区域进行敲除的替代型打靶载体。共得到5个具有药物抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中一个细胞克隆发生了正确的同源重组。转染后细胞MSTN基因表达量明显降低。【结论】获得了敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞。     

猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。     

猪生长激素基因ApaⅠ酶切位点多态性分析

利用 PCR- RFL P技术 ,分析了大约克猪和长白猪 GH基因的 Apa 酶切位点多态性。结果表明 ,在p GH基因序列中共检测到 5种基因型和 4种等位基因 ;基因型频率和等位基因频率在 2个猪种间分布差异不显著。     

猪MSTN基因敲除载体的构建

MSTN基因在成年动物所有骨骼肌中都可检测到表达,其突变或缺失会导致肌肉量的增加。根据已知的MSTN序列设计引物,通过PCR的方法获得了同源臂序列,同源长臂5 382 bp,包括全部的外显子1、2,同源短臂844 bp,包括部分外显子3,在含有正负筛选标记基因的载体上插入上述2个同源臂,构建完成了替代型猪MSTN基因敲除的打靶载体——ploxpⅡ-MSTN,为后续获得MSTN基因缺失型细胞株奠定了试验基础。     

利用CRISPR/Cas9系统构建可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系

目的 将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。方法 分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1 μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行293FT细胞转染验证;构建含Sohlh1基因目标靶点的pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,进行慢病毒包装检测;利用包装病毒侵染稳转PCW-eSpCas9(1.1)的PFF细胞,3 μg/mL灭稻瘟菌素进行筛选,随后添加Dox诱导进行表达分析和敲除效率检测。结果 建立了受Dox调控可诱导eSpCas9(1.1)蛋白表达的PFF细胞系,不添加Dox,eSpCas9(1.1)蛋白不表达;293FT细胞表达绿色荧光,表明pLV-sgRNA-2A-GFP载体改造成功。3、4、6号Sohlh1基因靶点具有敲除活性,利用最优的2个靶点构建了pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,荧光表达显示载体慢病毒包装成功。构建稳转PCW-eSpCas9(1.1)和pLV-sgRNA-2A-GFP的PFF,经Dox诱导72 h后,Sohlh1基因的敲除效率为85%。结论 利用Tet-on系统和CRISPR/Cas9系统成功构建了可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系,为研究Sohlh1基因的功能以及制备条件性敲除Sohlh1基因去除生殖细胞的模型猪奠定了基础。