茶树咖啡碱合成酶基因cDNA在烟草中的表达

为了在烟草中合成咖啡碱,将咖啡碱合成酶(Tea caffeine synthase,TCS)基因cDNA全序列克隆到双元载体pBI121中,通过农杆菌叶盘转化法将TCS基因成功转入烟草,结果得到72株转基因烟草植株。对其中3株转基因植株进行PCR检测和PCR-Southern检测,证实TCS基因已整合到基因组中;RT-PCR和Northern分析显示,TCS在这些植株中均能正常转录。用从转基因植株中提取的粗酶液进行体外酶促反应,能催化7-甲基黄嘌呤和可可碱向咖啡碱的转变,由此表明,转基因烟草植株中能产生具有正常生物学活性的TCS,但从3株转基因烟草中均未检测到咖啡碱。     

大豆促苗期根系发育相关基因Gmr937在烟草中的功能分析

将构建好的植物过表达载体pCAMBIA3301-Gmr937和RNAi表达载体pCAMBIA3301-RNAi-Gmr937,通过农杆菌介导的叶盘法将植物表达载体转入烟草。经PCR检测得到T1代过表达载体阳性植株13株,RANi表达阳性植株11株。对阳性植株进行荧光定量PCR,测定目的基因的表达量,结果表明Gmr937基因在转化烟草根、叶片中表达量最高,是未转化植株12倍,在茎中表达量最低,是对照7倍;在转干扰表达载体植株苗期根、叶中表达量是对照0.7倍,在茎中的表达量是对照0.85倍。以CaMV35s启动子为探针进行Southern杂交检测,结果表明转化的目标基因以单拷贝整合到受体烟草基因组中。测量适宜条件下培育的转基因烟草侧根总长度,结果表明超表达转基因植株的侧根平均总长度为117cm,比未转化烟草平均增加了8cm;RNAi干扰转基因植株侧根总长度平均为80cm,比对照组减少了11cm,说明Gmr937基因对烟草侧根的发育有促进作用。对干旱处理7d后的转基因烟草的抗旱生理生化指标进行测定,结果表明Gmr937基因在烟草中超表达提高了烟草植株的耐旱性。     

大豆查尔酮还原酶GmCHR基因的克隆及其在烟草中的表达

以大豆品种"吉农28"为材料,利用RT-PCR技术获得GmCHR基因序列,并选择其中918 bp的开放阅读框,以pBI121为基础载体,构建了由35S启动子驱动的GmCHR植物表达载体,转入烟草中并对17株抗卡那霉素的转基因烟草进行PCR、GUS染色、Southern杂交检测,对植株中GmCHR基因mRNA表达量进行荧光定量PCR检测,采用高效液相色谱技术测定转基因植株中查尔酮还原酶催化产物异甘草素的含量。结果表明:GmCHR基因成功整合到烟草基因组中并能够成功表达;在转基因植株中目的基因的mRNA均有表达,且不同植株间表达量存在差异;转化烟草叶部组织中异甘草素的平均含量为(7.528±0.018)μmol/g,而转空载体烟草中未检测出异甘草素。     

农杆菌介导法将pac1基因转入烟草的研究

以烟草叶片为外植体,利用农杆菌介导法首次将pac1基因转入吉林省主栽烟草品种吉烟9号、龙江911-21和云烟87中.经过卡那霉素抗性筛选,初步获得吉烟9号转化植株43株、龙江911-21转化植株61株、云烟87转化植株43株.经PCR检测,转化烟草吉烟9号的PCR阳性率为21/43,龙江911-21的PCR阳性率为32/61,云烟87的PCR阳性率为24/43.经PCR检测为阳性的植株均能扩增出与目的片断大小一致的特异性条带,初步表明pac1基因已经转到这些烟草基因组中.从PCR扩增稳定的转基因烟草中随机抽取5株,同时以非转基因烟草为对照,进行Southern Blot分析,结果表明目的基因pac1己经被成功地整合到烟草基因组中.     

hrpZPsg12转基因烟草及其抗性评价

【目的】将来源于大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)Psg12菌株的hrpZPsg12基因导入烟草"云烟87",对转化植株进行烟草普通花叶病毒(TMV)、烟草马铃薯Y病毒(PVY)和烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)的抗病性鉴定,为培育多抗烟草新品系奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法,将hrpZPsg12基因转入烟草"云烟87"中,对T0和T1代转基因植株进行PCR检测、Southern杂交,并对T1代转基因植株的抗病性进行评价。【结果】hrpZPsg12基因成功转入"云烟87"中,PCR检测表明共获得7株T0代阳性植株、35株T1代阳性植株。对T1代PCR阳性植株进行Southern检测,表明外源目的基因hrpZPsg12已经整合进烟草基因组中,并可在转基因后代植株中稳定遗传。抗病性测定表明,T1代转基因烟草对TMV和PVY表现高抗,对烟草野火病表现中抗。【结论】获得了高抗TMV和PVY及中抗烟草野火病菌的转hrpZPsg12基因植株20和15株。     

不同启动子在转基因烟草中抗番茄黄化曲叶病毒的研究

为了提高植物对番茄黄化曲叶病毒的抗性,利用CaMV35S启动子、棉花韧皮部特异启动子PGHNBS、拟南芥韧皮部特异启动子SUC2分别构建了含有不同启动子控制下的烟粉虱内GroEL基因的植物表达载体P-Gro-EL、P-PGHNBS-GroEL、P-SUC2-GroEL。通过农杆菌介导转化法,获得了一批抗卡那霉素的转化再生烟草植株。RT-PCR结果表明,3个启动子皆驱动GroEL基因在转基因烟草中表达。对转化再生烟草的一次病毒注射侵染结果显示,共有19株抗性烟草植株,其中,转P-GroEL载体的有7株,转P-PGHNBS-GroEL和P-SUC2-GroEL载体的各有6株;2次病毒注射侵染的结果显示,获得7株抗性烟草植株,它们是转P-GroEL载体的1株、转P-PGHNBS-GroEL和P-SUC2-GroEL载体的各3株。2次接种的试验结果表明,PGHNBS和SUC2转基因烟草植株的抗病效果均比CaMV35S转基因植株明显。证明利用韧皮部特异表达GroEL基因可以获得抗番茄黄化曲叶病毒的转基因植物。     

烟草和拟南芥表皮毛中特异表达iaaM后的遗传效应

利用色氨酸单加氧酶基因iaaM与拟南芥表皮毛特异表达GL2基因启动子重组后,构建了在植物表皮毛细胞中特异表达iaaM基因的重组基因载体;采用根癌农杆菌叶盘转化法将重组基因转化到烟草WS38(对照)中,筛选和鉴定出了6株转化烟草植株;将该重组基因以根癌农杆菌花序浸渍法转至拟南芥(Colombia ecotype,对照),筛选出9株拟南芥转化植株,并对稳定转化的转基因植株表皮毛进行观察。结果表明:转基因烟草表皮毛较对照植株显著增长,其长度最长为对照的2.2倍,但转基因拟南芥表皮毛长度与对照间无显著差异。对烟草幼叶进行生长素浓度检测,转iaaM基因烟草吲哚乙酸含量显著提高,说明iaaM在烟草表皮毛细胞中表达,使其合成和积累更多的生长素;转基因拟南芥和烟草表皮毛密度均较对照显著增加,证明植物表皮毛发育模式中GL2表达的特异性受细胞内生长素的影响。     

PCR检测转凝乳酶基因烟草的

利用转基因技术将凝乳酶基因转入烟草中表达的植物生物反应器策略具有十分重要的创新性和应用意义。本研究通过CTAB法提取转cym基因的烟草抗性再生植株的总DNA,并利用Primer软件,同PCR法对转基因烟草的抗性再生植株进行了检测,根据电泳检测结果初步确定在全部51株再生植株中共有17株阳性植株被检出,阳性率为33%。转基因阳性植株的确定为进一步研究凝乳酶基因的植物反应器研究奠定了基础。     

水曲柳FmSOC1基因烟草中遗传转化

为研究水曲柳SOC1基因对植物开花的调控功能,将水曲柳SOC1基因通过农杆菌介导法转入模式植物烟草中。利用PCR及Southern杂交法检测,结果有10株被确定为转基因植株。利用RT-PCR法对5株转基因烟草进一步分析表明,SOC1基因在3株烟草中表达。表型分析表明,转基因烟草植株生长较快,叶片窄小,开花时间提前。     

转基因烟草植株的检测

对采用叶盘法以质粒PBLGC为介导转化烟草的3个品种。经Kan抗性筛选获得的119株转化的烟草再生植株分别以启动子CaMV35S、几丁质酶基因和β—1，3-葡聚糖酶基因的引物进行PCR检测，分别获得91、72、47株阳性植株。其中，同时具有几丁质酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因的植株有36株。对部分转化植株进行PCR—Southern杂交实验的结果表明，外源基因的转化频率与植物品种、外源基因片段的大小有关。又对4株转基因植株后代(T1)进行了PCR、PCR—Southern杂交，结果发现，几丁质酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因已经稳定地遗传给后代，但二者的遗传传递率不同，β—1，3-葡聚糖酶基因似乎比几丁质酶基因更易于传递。另外，对转化植株T0代几丁质酶活力检测结果表明，转基因植株中几丁质酶活力显著增强，含有几丁质酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因的植株内切几丁质酶活力最强。     

大豆促苗期根系发育相关基因Gmr937在烟草中的功能分析

将构建好的植物过表达载体pCAMBIA3301-Gmr937和RNAi表达载体pCAMBIA3301-Gmr937-RNAi,通过农杆菌介导的叶盘法将植物表达载体转入烟草。经PCR检测得到T_1代过表达载体阳性植株13株,RNAi表达阳性植株11株。对阳性植株进行荧光定量PCR,测定目的基因的表达量。结果表明:正常条件下,Gmr937基因在转化烟草根、叶片中表达量较高,在茎中表达量较低;转干扰表达植株目的基因在根、叶片中表达量是对照0.8倍,在茎中的表达量是对照的0.85倍。干旱条件下,转Gmr937超表达载体烟草在叶片中表达量是对照组的14倍,在根中表达量是对照组的12倍;转Gmr937-RNAi载体在根、茎中表达量是对照组的0.8倍,在叶片中表达量是对照组的0.7倍。以CaMV35s启动子为探针进行Southern杂交检测,在适宜条件下,转化的目的基因以单拷贝整合到受体烟草基因组中。测量适宜条件下培育的转基因烟草侧根总长的结果表明,超表达转基因植株和RNAi干扰转基因植株的侧根平均总长均比干旱条件下长,且不同条件下超表达侧根总长都比对照长,说明Gmr937基因对烟草侧根的发育有促进作用。对干旱处理7 d后的转基因烟草的抗旱生理生化指标进行测定,结果表明Gmr937基因在烟草中超表达并提高了烟草植株的耐旱性。     

AtNHX1提高烟草耐盐性的研究

[目的]探讨利用AtNHX1基因提高烟草耐盐性的效果。[方法]利用农杆菌侵染的方法对烟草的叶盘进行遗传转化,将拟南芥的液泡膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因AtNHX1成功地转入了烟草中,对获得的28株潮霉素抗性转基因植株中的6株进行了Southern检测,并用200mmol/LNaCl对转基因植株进行盐分胁迫与耐盐性鉴定。[结果]分子检测表明,AtNHX1已经整合到烟草的基因组中,并得到了表达。在盐分胁迫下,各转基因株系具有较高的光合速率和PSⅡ活性,光合速度和Fv/Fm值均显著高于野生型对照,株系T1、T5的SOD酶活分别是野生型的1.8和2.1倍,各转基因株系GR活性也均显著高于野生型,而MDA含量则低于野生型。[结论]转At-NHX1基因的各株系的耐盐性较野生型对照有了较大程度的提高。     

拟南芥两个MYB基因标签融合蛋白转基因植株的获得和鉴定

[目的]进行染色体免疫共沉淀（ChIP）试验,挖掘MYB类基因At3g11280和At5g05790所调控的下游基因。[方法]在构建了标签融合蛋白植物表达载体的基础上,利用农杆菌介导的转化将这些载体转入拟南芥植物中,获得转基因植株,并用Western blotting检测标签融合蛋白在转基因植株中的表达。[结果]拟南芥植株转基因的效率很高,4种标签蛋白融合载体的转化均获得了20株以上的转基因植株。随机对4种转基因植株的8株T1代植株进行Western blotting分析,结果表明4,种转基因植株中均鉴定出阳性植株。融合蛋白的条带大小在30 kD左右,将显色信号条带与Marker比对,显示条带大小与预测蛋白大小相符。[结论]这些有融合蛋白表达的转基因植株为ChIP试验的进行提供了重要材料。     

转群体感应淬灭基因attM烟草抗青枯病的研究

自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)克隆获得attM基因。采用叶盘转化法,农杆菌介导转化烟草,经过卡那霉素抗性筛选获得抗性愈伤组织,对其分化产生的植物株系进行PCR、PCR-Southern和荧光定量PCR及GUS染色检测分析。结果表明:attM基因被成功插入烟草基因组DNA中。在转基因株系中均能够表达,相对表达量最大可达125.8,最小为31.0。以野生型烟草和转pBI121空载体的烟草为对照,分别进行了离体及活体检测试验,结果表明:转attM基因烟草植株对茄科雷尔氏菌引起的青枯病抗性显著。1×107～1×108CFU.mL-1的青枯菌接种离体叶片,野生型烟草和转pBI121空载体的烟草的中毒面积与接种面积比值为15～25,转基因植株的比值低于3;青枯菌3×106CFU.mL-1伤根接种盆栽烟草植株14d,野生株和转空载体烟草均青枯死亡,病情指数为100,转基因植株病情指数为31.25。     

拟南芥抗寒基因ICE1的克隆及功能分析

【目的】从野生型拟南芥中克隆抗寒基因ICE1,通过农杆菌介导法将ICE1基因转到烟草中,对其功能进行研究。【方法】以三叶一心期拟南芥幼苗为材料,提取其总RNA,通过RT-PCR扩增得到ICE1基因的完整开放阅读框序列;构建以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3301-ICE1,通过农杆菌介导法转入到烟草中,对阳性植株进行PCR检测和生理生化指标测定,并对ICE1基因在转基因烟草植株中的表达特征进行分析。【结果】成功克隆了拟南芥抗寒基因ICE1,其完整开放阅读框长1 485bp。系统进化树表明,拟南芥ICE1基因与其他物种的ICE1基因差别较大。用农杆菌介导法得到4株阳性烟草植株,Southern blotting检测证明,ICE1基因已经以单拷贝的形式整合到烟草基因组中。实时荧光定量PCR检测表明,ICE1基因在转基因烟草植株的根、茎和叶片中均有表达,且在叶片中的相对表达量最高。4℃低温环境下,与未转化植株相比,转ICE1基因烟草植株叶片的相对电导率降低了12.00%~17.65%,脯氨酸含量增加了13.28%~24.10%,丙二醛含量减少了7.09%~14.52%,过氧化物酶活性提高了9.39%~22.54%。【结论】克隆获得了拟南芥ICE1基因的完整开放阅读框序列,在烟草中转入ICE1基因可提高其耐寒性。     

LYC-b基因反义表达对番茄果实番茄红素含量的影响

【目的】研究番茄红素β-环化酶(LYC-b)基因反义表达对番茄果实中番茄红素含量的影响,为番茄品质育种提供新方法。【方法】以番茄品种"TTI1117A"和"灵光3号"为材料,构建了分别由CaMV35S启动子驱动的GUS标记基因和反义LYC-b5′基因双价植物表达载体,通过农杆菌GV3101介导,将基因整合到番茄基因组中,采用GUS、PCR以及RT-PCR、Northern杂交进行检测,并测定了转基因植株果实中的番茄红素含量。【结果】由GUS、PCR检测结果可知,筛选出1株"TTI1117A"和4株"灵光3号"转基因植株;RT-PCR、Northern杂交检测结果表明,目的基因在RNA水平上已经表达;对番茄果实中番茄红素含量的测定结果表明,转基因植株果实中番茄红素含量均高于未转基因植株。【结论】LYC-b基因的反义表达具有提高番茄果实中番茄红素含量的作用。     

Os WRKY80基因参与调控水稻抗病反应研究

为进一步了解OsWRKY80基因参与调控的抗病分子机理,对OsWRKY80增强表达转基因水稻和干涉转基因水稻进行稻瘟病抗性检测,Northern杂交分析OsWRKY80基因和PR基因(ZB8、PBZ1)稻瘟病接种0 h和24 h时的表达情况.结果表明:与干涉转基因水稻和未转基因对照相比,增强表达转基因水稻表现出对稻瘟病有较好的抗性.Northern杂交结果显示,在干涉转基因植株中内源OsWRKY80基因的诱导表达被抑制,转基因植株的抗病性与OsWRKY80基因的表达呈一定的正相关性.在干涉转基因植株中均未检测到ZB8和PBZ1的表达,稻瘟病诱导24 h时,未转基因植株和增强转基因植株中均能检测到ZB8、PBZ1诱导型表达,但在增强转基因植株中ZB8、PBZ1的诱导表达丰度要显著高于未转基因植株.这表明OsWRKY80基因可能作为正调控因子参与水稻防卫反应,PR基因的高水平诱导表达导致增强表达转基因植株对稻瘟病的抗性增强.     

根癌农杆菌介导的花青素调节基因 LC NtAn2 转化烟草的研究

旨在研究花青素调节基因LC-NtAn2对烟草花青素合成的影响,以普通烟草品种"97204"叶片为受体,采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,C58C1)介导法,进行LC-NtAn2基因转化普通烟草的研究。经共感染和潮霉素抗性筛选,获得29株抗性再生植株。经PCR特异性检测和RT-PCR检测,初步证明LC-NtAn2基因已被整合到烟草基因组,并可以正常转录。观察发现,导入LC-NtAn2基因的烟草植株的叶片颜色并无明显改变;检测发现,转基因植株与非转基因植株叶片中花青素无显著差异。     

百脉根花对称性基因LjCYC3转化烟草的研究

根据百脉根花对称性基因LjCYC3构建反义表达载体,经农杆菌介导正、反义LjCYC3基因转化烟草,以获得花型改变的转基因烟草植株,并根据表型选取正、反义各3株转基因植株和1株野生型植株进行Q-PCR分析,观察外源基因在远源植物中的作用和影响.PCR分析结果表明:转基因植株中正义基因和反义基因的转化率分别为62.5%和71%.表型观察显示:30%的正义转基因植株主要表现为花瓣和雄蕊数目减少;而40%的反义转基因植株表现为2朵花有一定程度的融合,花冠萼片有褪色现象,雄蕊端头有花瓣状结构,雌蕊2枚且与雄蕊有合生现象.Q-PCR分析结果表明:在正义转基因再生植株中,外源基因均高效表达,随着表达量的增加,花型变化更加明显;而在反义转基因再生植株中,外源基因也有表达,随着表达量的降低,花型变化更加明显;与正义基因表达量相比,反义基因表达量要小约150倍.本研究结果为下阶段用该基因转化花卉植物以改变花型、改良花卉品种打下了实验基础.     

甜菜碱醛脱氢酶基因转化速生杨107的研究

利用农杆菌介导法将甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因导入速生杨107号中,以提高其耐盐性.对650个叶盘进行抗生素筛选获得25株抗性芽,PCR检测表明,BADH基因已整合到其中10株的基因组中.耐盐筛选结果表明,转基因植株在NaCl浓度为50、100mmol/L的生根培养基上生长情况均好于未转化植株;相对电导率测定结果表明,在同等盐胁迫下转基因植株细胞膜较未转化植株能更好的保持其完整性.