汞盐诱导烟草悬浮细胞产生细胞编程死亡

【目的】阐明氯化汞处理烟草悬浮细胞产生的细胞死亡具有细胞编程死亡（programmed cell death,PCD）的特征和分子机制。【方法】采用形态和生物化学方法观察氯化汞处理细胞后的变化,并采用药理学方法,通过添加抑制剂和抗氧化剂阐明氯化汞引发的信号转导途径。【结果】氯化汞诱导产生的细胞死亡具有PCD特征,包括染色质浓缩、细胞核的TUNEL检测呈阳性和DNA ladder的形成。氯化汞诱导烟草悬浮细胞过氧化氢积累,过氧化氢酶和抗坏血酸等抗氧化剂能降低细胞死亡率。蛋白激酶抑制剂、磷脂酶C和磷脂酶D的抑制剂能显著地降低氯化汞引起的细胞死亡和过氧化氢积累。【结论】氯化汞引起的细胞死亡是一种PCD,蛋白激酶和磷脂信号介导的过氧化氢积累参与细胞死亡过程。     

HarpinXoo诱导烟草过敏性细胞死亡的细胞及分子特征

 HarpinXoo是水稻白叶枯病菌分泌的蛋白质，用harpinXoo注射烟草后20 h，可表现过敏性细胞死亡（hypersensitive cell death, HCD）。对harpinXoo诱导的烟草叶片用DNA特异染料（DAPI）染色后经荧光显微镜观察发现，烟草细胞在harpinXoo诱导后不同时间表现明显的染色质浓缩；对诱导后的烟草DNA经2％琼脂糖凝胶电泳发现，诱导后12 h烟草DNA开始出现弥散的条带，24 h后弥散的小片段大量增加；定量RT-PCR检测发现，harpinXoo诱导的烟草HCD早期即有标志基因hin1和hsr203J的诱导表达。这些结果表明，harpinXoo诱导的烟草细胞死亡，是植物的一种主动反应，具有细胞编程死亡的重要特征。     

磷脂酶C参与ParA1诱导的烟草悬浮细胞死亡和防卫反应

【目的】研究寄生疫霉Phytophthora parasitica分泌的蛋白激发子ParA1诱导烟草悬浮细胞后,磷脂酶C(phospholipase C,PLC)参与ParA1诱导烟草过敏细胞死亡(hypersensitive cell death,HCD)和防卫反应。【方法】采用药理学方法,在烟草悬浮细胞中添加PLC抑制剂,比较烟草悬浮细胞受ParA1诱导后细胞死亡和多种防卫反应的差别。【结果】PLC特异性抑制剂U73122能完全抑制ParA1引起的烟草悬浮细胞死亡,氧迸发、胞外基质碱化和植保素scopoletin(7-羟基-6-甲氧基香豆素)积累都能显著地被抑制,5种防卫基因hin1、hsr203J、PR(pathogenesis-related)-1a、PR-1b和PAL等的转录表达也都受到U73122不同程度的抑制。【结论】ParA1处理烟草悬浮细胞后,PLC参与了ParA1诱导细胞死亡和防卫反应的信号传导过程。     

过氧化氢诱导小麦悬浮细胞程序性死亡

为研究过氧化氢对小麦洛夫林10悬浮细胞的影响,分别采用溴酚兰染色、改良苯酚品红染色和琼脂糖凝胶电泳对不同浓度的过氧化氢处理小麦悬浮细胞后的细胞死亡率、细胞核形态变化及基因组DNA的完整性进行了观察和检测。结果表明:随着过氧化氢浓度的增加以及处理时间的延长细胞死亡率逐渐上升,并且伴随有细胞核染色质的凝集,琼脂糖凝胶电泳检测到DNA Ladder。证明过氧化氢能够诱导小麦悬浮细胞发生程序性死亡。     

核黄素诱导烟草悬浮细胞酚类物质和木质素的积累

 【目的】阐明核黄素对烟草悬浮细胞苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)、过氧化物酶(peroxidase,POD)活性以及抗病相关的酚类物质、木质素等次生代谢产物含量的影响。【方法】1 mmol?L-1的核黄素处理烟草悬浮细胞,用生物化学、细胞化学和高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)等方法测定苯丙烷代谢有关的生理和生化指标。【结果】核黄素处理后,PAL和POD活性明显升高,处理12 h 和24 h后酶活性分别达到峰值;荧光观察细胞壁积累了更多的酚类物质,胞内和胞外scopoletin(7-羟基-6-甲氧基香豆素)含量明显升高,在处理12 h后都达到峰值,分别是对照的3.6和3.9倍;细胞染色和含量测定表明,核黄素处理后烟草悬浮细胞沉积了更多的木质素,处理24 h和48 h后,木质素含量分别为对照的1.5和1.8倍。【结论】核黄素处理后提高了烟草悬浮细胞PAL、POD活性,积累了更多与抗病有关的次生代谢产物。     

小鼠MSCs体外定向诱导分化神经及脂肪细胞的研究

 【目的】建立昆明小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养体系,并鉴定其定向诱导分化为神经及脂肪细胞的能力。【方法】采用贴壁培养法分离培养昆明小鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,通过相差倒置显微镜对其进行形态学特征观察;通过碱性磷酸酶（AKP）染色、Hoechst 33258染色、瑞士-姬姆萨复合染色检测MSCs的表型特征;通过β-ME诱导MSCs定向分化为神经样细胞,诱导后的细胞进行H.E染色,观察其形态学特性;通过NF-200、NSE免疫荧光细胞化学方法对已分化的神经样细胞进行鉴定和分化率分析;通过马血清诱导MSCs定向分化为脂肪细胞,观察其体外生长过程,并对诱导后的脂肪细胞进行油红O染色鉴定和分化率分析。【结果】分离得到的MSCs为成纤维样细胞,可见多个核仁,AKP染色阳性率为93.2%±1.5%;β-ME诱导后,MSCs分化为多种表型的神经细胞与原代培养的小鼠全脑细胞的外形相似,诱导后的神经细胞NF-200、NSE免疫荧光细胞化学染色均呈阳性,NF-200阳性率为85.4%±1.8%,NSE阳性率为82.7%±2.1 %;马血清诱导后,MSCs可100%分化为脂肪细胞,油红O染色为阳性。【结论】 采用贴壁培养法能够成功分离和培养昆明小鼠的MSCs,分离得到的MSCs具有定向分化成多种神经细胞和脂肪细胞的能力。     

感染叶锈菌的小麦细胞间隙液对小麦悬浮细胞程序性死亡的诱导

以小麦悬浮细胞为材料,分别用感染叶锈菌小种165的小麦细胞间隙液(IWF165)和未接菌的小麦细胞间隙液(IWFck)对其进行处理,处理后不同时间点取样进行形态学观察和DNA电泳。结果表明,用IWF165处理后的悬浮细胞可观察到明显的染色质凝聚化、边缘化和细胞核解体等现象;同时DNA电泳结果显示IWF165处理后的细胞基因组DNA发生降解并形成明显的DNA梯状条带。而用IWFck处理的悬浮细胞,其细胞核结构完整,染色质分布均匀;DNA电泳没有出现DNA梯状条带。在感染叶锈菌的小麦细胞间隙液中存在着激发子,它能够诱导小麦悬浮细胞发生程序性死亡。     

烟草赤星病菌代谢产物对烟草BY-2细胞ROS爆发和ATP损耗的诱导?

 【目的】本文以烟草BY-2细胞为实验材料,探讨赤星病菌代谢产物（metabolic products of Alternaria alternata,MP）对烟草BY-2细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生和ATP含量变化的影响以及产生这种影响的原因。【方法】用10% MP处理烟草BY-2细胞,用氧电极检测不同时间MP处理后,烟草BY-2细胞呼吸速率和呼吸途径的变化,同时分析BY-2细胞内H2O2产生和ATP含量等的变化。【结果】 MP处理导致了烟草BY-2细胞H2O2爆发和ATP含量下降,此外MP处理也导致了烟草BY-2细胞总呼吸速率、细胞色素途径（cytochrome pathway）和及交替氧化酶途径（AOX）的下降,并且造成线粒体渗透转换孔（permeability transition pore,PTP）开放和细胞色素c释放。【结论】 MP对BY-2细胞呼吸速率和细胞色素途径的抑制不可避免地导致胞内ATP含量下降,此外MP诱导的烟草BY-2细胞氧化磷酸化的解偶联作用是MP导致胞内ATP含量下降的另一重要原因。而MP对 AOX途径的抑制则是诱导胞内ROS爆发的重要原因。     

AtIPS1与细胞程序化死亡相关蛋白ATXR5/6的相互作用

【目的】对拟南芥肌醇磷酸合酶AtIPS1进行亚细胞水平定位,并验证AtIPS1与细胞程序化死亡（PCD）相关蛋白ATXR5或ATXR6的相互作用。【方法】构建pAtIPS1::AtIPS1-GFP融合基因表达载体,并分别转化烟草BY-2细胞和拟南芥植株,共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白GFP的分布。采用双分子荧光互补（BiFC）技术分析AtIPS1与ATXR5/6的相互作用,并观察突变体atips1的表型。【结果】AtIPS1定位于细胞质和细胞核。AtIPS1与ATXR5和ATXR6之间存在相互作用,且互作位点与AtIPS1的细胞定位一致。突变体atips1叶片上自然产生细胞死亡的表型,外源增加肌醇或AtIPS1超表达可恢复突变体的野生型表型,叶片不再出现坏死斑。【结论】AtIPS1突变可导致植物细胞死亡;AtIPS1定位于细胞质和细胞核;AtIPS1通过与ATXR5/6互作参与了植物PCD的调控。     

大麦淀粉胚乳发育期间程序性细胞死亡的研究

 【目的】大麦胚乳发育过程中,淀粉胚乳细胞变成死细胞,本研究阐明这种死亡方式是一种特殊形式的程序性细胞死亡（PCD）。【方法】利用透射电镜和荧光显微镜观察淀粉胚乳细胞核的结构变化,利用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL检测DNA断裂,并对抗氧化酶活性动态和籽粒灌浆速率进行测量。【结果】伴随淀粉胚乳发育进程,大麦淀粉胚乳细胞核呈现出核变形、染色质凝集、核膜破裂和核瓦解形成核残体等一系列PCD过程中核的变化特征。琼脂糖凝胶电泳和TUNEL结果都表明,核DNA发生了有规律的断裂,但DAPI染色结果却表明,核残体并没有从死亡的淀粉胚乳细胞中消失,而是分散存在于淀粉粒之间。Evan’s blue染色表明,死亡的淀粉胚乳细胞在胚乳组织中是随机发生的。在淀粉胚乳细胞核衰退解体和无核的胞质发育过程中,胚乳内抗氧化酶都存在一定的活性,籽粒的粒重也在不断增加。【结论】大麦淀粉胚乳在核衰退解体和无核化的胞质发育时期,胚乳细胞维持较高的代谢活性,没有表现衰退解体特征,直到被贮藏物质所充实才死亡,淀粉胚乳细胞的发育是一种特殊形式的PCD过程。     

Steedman’s wax包埋切片DAPI染色法证实铝诱导花生根尖细胞程序性死亡

【目的】检验Steedman’swax包埋切片DAPI染色法是否适用于观察花生根尖细胞核形态。【方法】分别采取100μmol/L AlCl3处理不同时间（0、4、8、12 h）后两个花生品种（铝敏感型中花2号和耐铝型99-1507）的根尖,经过Steedman’s wax包埋切片等一系列过程,利用荧光染料DAPI染色观察细胞核形态变化。【结果】100μmol/L AlCl3可引起花生根尖细胞核形态发生改变,核质浓缩、核边缘化、呈新月状等,具有明显的PCD特征。花生根尖细胞在铝胁迫下发生PCD,PCD程度与花生耐铝性呈负相关,与处理时间呈正相关。【结论】Steedman’swax包埋切片DAPI染色法是一种快速、高效的适用于观察花生根尖细胞核形态的方法。     

小麦糖原合成酶激酶(TaGSK1)的亚细胞定位及其功能鉴定

【目的】对小麦糖原合成酶激酶（TaGSK1）进行亚细胞水平定位以及功能鉴定。【方法】构建Tagsk1-gfp融合基因表达载体并转化拟南芥，以仅携带gfp基因的拟南芥作为对照，利用共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白在转基因植株根部细胞的分布；利用含不同浓度NaCl的MS培养基对携带有融合基因的拟南芥和Columbia型拟南芥进行耐盐性鉴定，观察主根生长量和侧根生长数目。【结果】发现TaGSK1存在于细胞质内，且该激酶在根尖分生组织和与侧根发生有关的中柱鞘细胞中分布较多；耐盐性鉴定结果表明，转Tagsk1-gfp融合基因的植株的平均主根生长量和侧根生长数目与Columbia型拟南芥植株的差异均达到极显著水平（P<0.01）。【结论】TaGSK1定位于细胞质内，该激酶具有促进细胞分裂及提高转基因拟南芥抗渗透、抗胁迫的能力。     

乳清蛋白抗氧化肽对H_2O_2所致人胚肺成纤维细胞MRC-5过氧化损伤的保护作用

【目的】探讨纯化后的乳清蛋白抗氧化肽P4对人胚肺成纤维细胞(human lung fibroblast)MRC-5过氧化损伤的保护作用及可能的作用机制。【方法】采用H2O2诱导建立细胞氧化损伤模型,应用四唑蓝快速比色法(MTT法)检测细胞存活率,通过检测细胞培养液中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量,来确定P4对过氧化损伤MRC-5细胞的保护作用,并利用电镜观察细胞形态学变化。【结果】1mmol·L-1H2O2孵育24h可显著诱导MRC-5细胞损伤,使细胞存活力下降到22.47%,细胞经不同浓度的抗氧化肽P4(4、20、100μg·mL-1)与H2O2共孵育后,特别是100μg·mL-1(高剂量组)抗氧化肽P4可使细胞存活率达到44.77%。同时,提高乳清蛋白抗氧化肽P4的浓度,可促进受损的MRC-5细胞修复,提高了SOD、CAT、GSH-Px酶活性,降低MDA含量。扫描电镜和透射电镜观察结果也表明,一定浓度的乳清抗氧化肽对MRC-5细胞具有保护作用。【结论】乳清抗氧化肽通过拮抗H2O2而对MRC-5的过氧化损伤具有保护作用。     

罗非鱼“腹水病”组织病理学研究

【目的】对乌鲁木齐市红雁水产公司流水养殖的死亡罗非鱼采样进行病理组织学研究,并进一步研究该病的病因发病机理和危害性及对各组织器官的影响。【方法】采用常规切片制作,H·E染色,显微镜观察其病理变化。【结果】该病暂定名为罗非鱼"腹水病",病理解剖学观察显示:各组织器官均有病变,其中尤以肝、肾、脾为严重,肝脏肿大,质地极度柔软,大量肝细胞坏死,肝小叶中央带坏死,炎性细胞浸润;肾小管消失,肾皮质部大面积出血;脾脏生发中心变性坏死、出血。【结论】通过组织病理学观察证实,经病原分离鉴定,确定其病原为嗜水气单胞菌(Aemromonas hydrophila),该病为嗜水气单胞菌导致的全身败血性变化。研究为罗非鱼相关疾病的诊断及防治提供了科学依据。     

谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35在水稻中对盐胁迫的响应

【目的】盐胁迫影响作物的产量和品质,而作物的耐盐性受特定基因的调控。在前期获得谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35过表达水稻株系的基础上,拟结合植株在盐胁迫下的表型,对部分盐胁迫指标及响应基因的表达模式进行检测和验证,解析谷子SiRLK35参与盐害响应的可能机制。【方法】 选取谷子SiRLK35过表达水稻株系,分别为过表达株系（over-expression,OE）-1（OE-1）、OE-2和OE-3,以野生型中花11为对照,实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测各株系中SiRLK35的表达情况;分别用含0、150和200 mmol·L ^-1 NaCl的MS培养液处理三叶期的对照及转基因株系幼苗,观察其表型,统计150 mmol·L ^-1 NaCl处理3 d后苗长及根长;用150 mmol·L ^-1 NaCl处理四叶期幼苗,统计处理14 d后材料干重、死亡率和死叶率,对各材料的耐盐性进行评价;进一步挑选SiRLK35过表达程度高且耐盐表型好的OE-1株系,利用3,3'-二氨基联苯胺（3,3'-Diaminobenzidine,DAB)和氮蓝四唑（nitrotetrazolium blue chloride,NBT）染色检测其胁迫下过氧化物积累及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和过氧化物酶（peroxidase,POD）的活性;并对部分盐害响应基因的表达模式进行检测。 【结果】 谷子SiRLK35在株系OE-1中的相对表达量最高;150 mmol·L ^-1NaCl处理3 d幼苗后,中花11苗长和根长的生长受抑制程度均大于SiRLK35过表达株系,其中OE-1的受抑制程度最小;四叶期幼苗经150 mmol·L ^-1 NaCl处理14 d后,转基因株系地上部和地下部干重降低幅度均低于对照,且幼苗死亡率和死叶率均低于对照;盐胁迫下对照过氧化染色反应明显,O ^2-和H₂O₂的积累均高于过表达植株,SOD和POD抗氧化酶活性均高于对照;部分盐害响应基因在SiRLK35过表达株系中表现为上调,其中,OsLEA3在盐处理24 h的相对表达量是对照中的1.9倍。 【结论】 谷子SiRLK35异源转化水稻获得的过表达株系对盐胁迫具有一定的抗性,SiRLK35可通过调控抗氧化酶活性及相关信号途径,从而参与盐害响应。     

斑马鱼性腺的荧光组织学观察

【目的】探索斑马鱼性腺经不同染色剂染色后在不同激发光激发下的荧光特性。【方法】以斑马鱼性腺为材料，用Bouin's液固定，石蜡切片未经染色或单染伊红、单染苏木精、HE染色后，分别在白光（明场）、绿色激发光、蓝色激发光和紫外激发光下观察斑马鱼性腺的荧光特性。【结果】未染色的斑马鱼性腺组织切片，经不同激发光激发后，可观察到自发产生较弱的荧光；而以单染伊红、单染苏木精或HE染色后，经不同激发光激发，斑马鱼性腺中的生殖细胞和体细胞分别呈现不同的荧光特性，且不同染色切片经相应的激发光激发后所发出的荧光及细胞结构的清晰度均存在明显差异。【结论】将组织学技术中最常用的苏木精和伊红染色方法与荧光技术、荧光观察结合起来，可更简易而快速区分不同细胞类型、不同细胞周期等。     

厚鳞柯叶水提物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌机理

【目的】明确厚鳞柯叶水提物（Aqueous extract of Lithocarpus pachylepis leaf, AELL）对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 （Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）的抑菌效果及其作用机理,为开发安全高效、低毒环保、无残留的抗MRSA药物提供理论依据。【方法】采用微量肉汤稀释法、平板菌落计数法分别测定AELL对MRSA的最小抑菌浓度 （MIC）和最小杀菌浓度 （MBC）,以比浊法绘制AELL处理后MRSA的生长曲线,并通过酶标仪测定、流式细胞仪及扫描电镜等测定AELL处理后MRSA生物被膜清除作用、纤维蛋白原黏附率、呼吸代谢活力、可溶性蛋白含量、DNA含量、细胞周期分布、细胞凋亡率、胞内活性氧（ROS）水平及其形态结构特征的变化情况。【结果】 AELL可能通过影响MRSA对数生长期而发挥抑制或杀灭作用,其MIC和MBC均为0.15625 mg/mL。与空白对照组相比,经AELL处理后MRSA的生物被膜含量明显下降;随着AELL处理浓度的增加, MRSA相对黏附率呈逐渐下降趋势,从47.486%下降到5.440%。随着AELL处理时间的延长, MRSA的呼吸代谢活力逐渐降低,且呼吸链脱氢酶活性明显低于空白对照组,说明AELL可能是通过抑制MRSA呼吸链脱氢酶活性促使菌株处于死亡甚至呈破碎状态。经AELL处理后,MRSA可溶性蛋白呈明显下降趋势,还扰乱MRSA细胞周期分布,使其停滞在S期,同时抑制DNA合成; MRSA的细胞凋亡率和胞内ROS水平均随AELL浓度的增加而呈逐渐上升趋势; MRSA的形态结构不规则、萎缩、畸形,细胞塌陷,细胞间隙出现裂痕,细胞壁严重弯曲、变形。【结论】 AELL具有开发成抗MRSA兽药、植物杀菌剂的潜力,其抑菌机理是通过清除MRSA生物被膜,降低其对纤维蛋白原黏附力,抑制蛋白和DNA生成,阻碍呼吸代谢,延缓细胞繁殖周期及促进菌体内脂质过氧化等,从而导致菌体细胞凋亡。