烟草肌醇半乳糖苷合成酶基因NtGolS1的克隆及序列分析

为从烟草中克隆到与植物抗逆相关的肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS,以辣椒GolS基因为探针,通过电子克隆法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码GolS基因的cDNA序列,暂被命名为NtGolS1.NtGolS1包含一个完整的开放读码框,编码343个氨基酸,具备糖基转移酶保守结构域;序列比对结果表明,NtGolS1蛋白与其他植物的GolS蛋白具有很高的相似性;系统进化树分析表明,NtGolS1与耐旱植物维柯萨的Gols亲缘关系最近.这些结果为进一步研究NtGolS1的性质和功能,并为植物抗逆基因工程研究提供理论基础     

大豆肌醇半乳糖苷合成酶基因GmGolS克隆及非生物胁迫表达分析

【目的】本文探索了大豆肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)基因与非生物胁迫的关系。【方法】通过RT-PCR从大豆叶片cDNA中扩增编码GolS的基因GmGolS。生物信息学分析预测该基因及编码蛋白的理化性质。构建系统进化树分析GolS蛋白的亲缘进化关系。采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在非生物胁迫下的表达模式。【结果】GmGolS基因ORF全长987 bp,编码328个氨基酸,分子量38.03 kDa,等电点5.79。GmGolS蛋白定位于细胞的叶绿体和/或细胞质中,并且与沙冬青AmGolS蛋白的亲缘关系最近。干旱、高盐和低温胁迫均可不同程度的诱导GmGolS基因的表达,且GmGolS对干旱胁迫的响应最为明显。【结论】以上结果表明GmGolS基因在大豆中可响应多种非生物胁迫,为GmGolS在大豆抗逆基因工程育种中的进一步应用提供理论依据。     

百合单萜合成酶基因的克隆与序列分析

单萜化合物是‘西伯利亚’百合花香的主要成分,为了研究百合单萜化合物的合成与代谢机理,以百合的花瓣为材料,根据GenBank发表的单萜合成酶基因的保守区设计1对简并引物,通过RT-PCR与RACE相结合的方法,克隆得到一个单萜合成酶基因的cDNA序列,命名为Li-mTPS2。该基因全长为1 766bp,包含1 608bp的基因开放阅读框(ORF),45bp的5′UTR和113bp的3′UTR,编码535个氨基酸,含有萜烯合成酶(TPS)保守序列DDxxD以及TPSb亚家族共有的RRx8W基序。氨基酸同源性分析表明该基因所编码蛋白的氨基酸序列与小苍兰芳樟醇合成酶、姜花单萜合成酶、六出花月桂烯合成酶的同源性分别为55%,53%,51%。     

辣木查尔酮合成酶(CHS)基因的克隆及其序列分析

【目的】查尔酮合成酶是黄酮类生物合成途径中的第1个限速酶基因。从辣木中克隆查尔酮合成酶基因MoCHS1,并对其进行生物信息学分析,为进一步研究其生物学功能提供基础数据。【方法】根据NCBI数据库中的辣木基因组信息设计引物,以辣木叶片cDNA和基因组DNA为模板,PCR扩增获得MoCHS1基因序列。利用生物信息学方法分析其序列特征,使用DNAMAN9.0和MEGA10.0软件进行多重比对和构建系统进化树。【结果】MoCHS1ORF序列长度为1 185 bp,编码394个氨基酸,基因组序列长1 387 bp,含有2个外显子和1个内含子。生物信息学分析表明,MoCHS1为稳定的亲水蛋白,以α-螺旋(45.43%)和不规则卷曲(31.98%)为主。MoCHS1含有查尔酮合成酶家族的保守序列和酶活性位点的关键氨基酸残基,包括7个环化袋氨基酸残基、3个辅酶A活性结合位点、半胱氨酸(Cys)-组氨酸(His)-天冬氨酸(Asn)三联体催化位点和查尔酮合成酶基因家族的2个高度保守的特征序列(RLMMYQQGCFAGGTVLR和GVLFGFGPGL),与其他物种的CHS序列一致性较高。系统进化分析显示,MoCHS1与番木瓜聚在一类,说明其亲缘关系最近。【结论】成功分离了一个辣木查尔酮合成酶基因MoCHS1基因序列,该基因推测编码的氨基酸序列具有CHS家族蛋白的典型保守结构特征。研究结果有助于进一步研究辣木查尔酮合成酶基因的调控及基因家族进化机制和类黄酮合成调控机理。     

大豆GmGolS基因的原核表达及抗旱性分析

肌醇半乳糖苷合成酶(galactinol synthase,简称GolS)是棉子糖系列寡糖(raffinose family oligosaccharides,简称RFOs)生物合成途径中的关键酶,在植物应对非生物胁迫的过程中发挥着重要作用。通过逆转录(RT)-PCR从大豆叶片cDNA中扩增得到编码肌醇半乳糖苷合成酶的基因GmGolS,再将GmGolS基因构建到原核表达载体pET28上,然后将载体导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,对其进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalacto pyranoside,简称IPTG)诱导。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)结果表明,在诱导时间为3 h、IPTG浓度为0.1 mmol/L的条件下,可以获得大量重组蛋白,分子量约为40 ku。对表达GmGolS蛋白的大肠杆菌进行抗旱性分析的结果显示,GmGolS基因在大肠杆菌中的过表达降低了重组菌的生活力,使其对干旱胁迫更加敏感。     

笃斯越橘花青苷途径中CHS基因的克隆与序列分析

以笃斯越橘花朵为试材,根据兔眼蓝莓查尔酮合成酶(VaCHS)mRNA全长序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增出长度大约为1 400bp目的片段,经测序,结果表明,笃斯越橘CHS基因(VuCHS)cDNA序列全长1 391bp,包含1 170bp开放阅读框(ORF),编码389个氨基酸,将笃斯越橘CHS基因(VuCHS)编码的蛋白质与其他来源的查尔酮合成酶蛋白的氨基酸序列进行比对,发现与兔眼蓝莓、杜鹃花和猕猴桃的一致性分别为99%、93%和93%,该基因蛋白质的氨基酸序列与其他植物CHS基因蛋白质的氨基酸序列进化分析表明,与兔眼蓝莓和猕猴桃属于同一分支,与兔眼蓝莓亲缘关系最近。     

芥蓝查尔酮合成酶基因BaCHS的克隆与序列分析

查尔酮合成酶基因是类黄酮生物合成途径的关键基因,在植物发育和逆境反应中起着重要作用.根据已发表的查尔酮合成酶基因序列设计全长引物,以芥蓝(Brassica albograbra)叶片基因组DNA和花蕾cDNA为模板,克隆到了芥蓝查尔酮合成酶基因全长序列,命名为BaCHS.该基因DNA全长为1 263 bp,具一个长度为75 bp的内含子,编码区长度为1 188 bp,编码395个氨基酸.序列比对结果表明,BaCHS基因编码的氨基酸序列与其他十字花科植物之间的同源性很高,仅存在个别氨基酸残基的差别.     

4种报春苣苔属植物叶插繁殖技术研究

以河池报春苣苔(Primulina hochiensis)、线叶报春苣苔(P.linearifolia)、永福报春苣苔(P.yungfuensis)、尖萼报春苣苔(P.pungentisepala)为研究对象,采用多因素完全随机区组试验设计,探讨3种扦插方式和3种扦插基质对4种报春苣苔属植物扦插生根的影响。结果表明,4种报春苣苔属植物在珍珠岩:草炭=1∶1(V/V)基质中的扦插效果最好,形成的子株数最多(19.67~29.67),不定根发生时间最短(28.33~41 d),不定芽发生时间最快(63.67~79.67 d);河池报春苣苔以全叶插方式繁殖效果最好,线叶报春苣苔、永福报春苣苔、尖萼报春苣苔以半叶插方式繁殖效果最好。     

粘质沙雷氏菌中乙偶姻合成途径基因克隆、序列分析及表达

运用生物信息学和PCR方法,鉴定了粘质沙雷氏菌乙偶姻生物合成途径中编码α-乙酰乳酸脱羧酶(a- ALDC)和α-乙酰乳酸合成酶(α- ALS)的基因(aceA和aceB)序列.经测序和序列分析显示aceA和aceB基因的开放阅读框(ORF)长度为780 bp和1 686bp,编码259和561个氨基酸,编码蛋白分子量和...     

黄瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS2克隆与表达调控

肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是合成棉子糖系列寡糖(RFOs)的关键酶，在植物抵抗非生物胁迫过程中发挥重要作用。为探究GolS2基因在黄瓜应答非生物胁迫中的作用，本研究采用RT-PCR法从黄瓜中克隆了GolS2基因，其开放阅读框长度为981 bp,编码326个氨基酸，植物GolS2蛋白氨基酸序列一致性很高。进化树中，黄瓜GolS2蛋白与拟南芥GolS2和GolS3蛋白聚在同一分支，亲缘关系最近。盐胁迫和低温胁迫处理显著诱导GolS2基因在黄瓜幼苗中的表达，但低温处理显著抑制GolS2基因在采后黄瓜果实中的表达。对其启动子顺式作用元件的分析结果显示，GolS2基因启动子中含有多个与逆境胁迫响应有关的顺式作用元件。在采后黄瓜果实中沉默HHO2和GRP3基因的表达，显著下调GolS2基因表达，表明这两个基因调控GolS2基因表达。本研究结果明确了GolS2基因在不同类型黄瓜组织中应答非生物胁迫的功能存在差异，这为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

40种苦苣苔科植物毛蕊花糖苷与总黄酮含量的测定

为给苦苣苔科植物的药用研究提供依据,采用反相高效液相色谱法和紫外分光光度法测定苦苣苔科4属40种植物的毛蕊花糖苷与总黄酮含量。结果表明:40种苦苣苔科植物中有30种含有毛蕊花糖苷,其中只有半蒴苣苔属11种植物全部含有,吊石苣苔属不含有毛蕊花糖苷,且半蒴苣苔属在4个属间分布含量较高,平均含量为0.078%;吊石苣苔属分布含量最低,平均含量为0.004 4%。40种苦苣苔科植物中均含有丰富的黄酮类化合物,其含量为0.31%~7.84%。报春苣苔属、半蒴苣苔属、吊石苣苔属和芒毛苣苔属的黄酮含量分布均无明确规律,含量高低差异较大。其中,半蒴苣苔属植物毛蕊花糖苷和总黄酮平均含量均最高,分别为0.078%和4.53%。     

中国水仙叶绿体ATP合成酶基因NtATPF的克隆与序列分析

以多效唑诱导中国水仙的抑制差减杂交文库(SSH)获得的cDNA片段为基础,采用RACE及RT-PCR技术,分离克隆到1个ATP合成酶CF0 B亚基基因NtA TPF.此基因包含有1个555 bp完整阅读框架(ORF),编码184个氨基酸,具有1个跨膜区域(27～49),分子量为20.809 5 kD,理论等电点为5.69.聚类分析表明:其氨基酸序列与葱的叶绿体ATP合成酶CF0 B亚基蛋白氨基酸序列亲缘关系最近.     

大青杨纤维素合成酶PuCesA6基因cDNA的克隆及序列分析

以大青杨总RNA为模板,通过反转录PCR获得纤维素合成酶PuCesA6基因的全长cDNA序列。序列分析结果表明：其cDNA序列全长3778bp,开放读码框序列3264bp,共编码1087个氨基酸。PuCesA6基因编码的氨基酸序列具备被子植物纤维素合酶基因的特征：锌指结构域、高变区I（HVR—I）、高变区II（HVR—II）与β-糖苷转移酶有关的保守结构域以及8个跨膜区。通过多氨基酸序列比对发现,与光皮桦B1CesA5相似度最高,为89％;其次是玉米ZmCesA8,相似度为80％,且8类CesA的锌指结构与c末端氨基酸序列高度保守。34种CesA蛋白序列的分子进化分析表明,大青杨PuCesA6蛋白与欧洲颤杨PtrCesA6蛋白亲缘关系最近,相似度达99％;和光皮桦BICe．sA5、大桉EgCesA6蛋白同聚为一类。     

雷竹纤维素合成酶基因cDNA克隆与表达分析

根据绿竹纤维素合成酶(cellulose synthase)基因的保守区序列设计引物,以雷竹cDNA为模板,采用PCR方法,成功扩增出1个含有完整阅读框架的cDNA序列,长度为3 385 bp,共编码1 056个氨基酸,将其命名为PpCesA1基因.氨基酸序列的分析结果表明,PpCesA1与其他纤维PeCesA4素合成酶有较高的同源性,同绿竹序列相似性高达94% ,且其序列具有典型的Cellulose_synt-GT-A 结构域,推测此PpCesA1为雷竹纤维素合成酶基因.对雷竹不同组织采用半定量方法研究该基因的表达情况,结果表明该基因在不同组织中的表达有明显差异.     

单核细胞增生李斯特菌新型内化素lmo0549的分子特征及其表达

应用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)新型内化素lmo0549基因进行克隆和测序,并对其进行生物信息学分析;通过扩增获得Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区序列,并将其亚克隆至pET-32a(+)表达载体,转入大肠杆菌中用异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,简称IPTG)诱导表达,应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(western blot)鉴定重组蛋白的表达形式及其抗原特异性。序列分析结果表明,扩增得到的lmo0549基因全长为2 034 bp,编码677个氨基酸,其信号肽序列是前23个氨基酸,在Lmo0549蛋白氨基酸序列中,从N端到C端分别包括5个富含亮氨酸的重复基序(LRR)、1段PKD重复序列和1个WxL结构域;同时还存在N-联糖基化位点10个、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点14个、蛋白激酶C磷酸化位点15个。同源性分析显示,LM-SB5 lmo0549基因编码的蛋白氨基酸序列与标准株李斯特菌EGD-e,(NC_003210.1)蛋白氨基酸序列的同源性为88.04%,且在单核细胞增生李斯特菌中具有较高的保守性。SDS-PAGE分析显示,表达的Lmo0549蛋白氨基端抗原集中区具有与理论值33.8 ku相符的分子质量;蛋白质印迹法分析表明,重组蛋白Lmo0549与LM阳性血清可发生特异性免疫反应,为进一步探讨Lmo0549在LM侵入宿主细胞的分子作用机制奠定了前期基础。     

马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长克隆及序列分析

[目的]分离克隆马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长.[方法]根据其他松科植物α-蒎烯合成酶基因保守区域设计引物,扩增出基因的部分片段,再结合RACE技术分别扩增出基因3’端和5’端序列,通过序列拼接获得cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因编码蛋白的特性.[结果]马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长为2 103 bp,编码区1 980 bp,编码629个氨基酸,含有1个N端结构域、1个金属结合结构域和1个天冬氨酸富集基序（DDMYD）.[结论]该方法成功克隆了马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长序列,具有单萜烯合成酶基因的典型特征,序列提交至GenBank,获得登录号KF547035.     

洋葱查尔酮合成酶基因的分子克隆和表达分析

查尔酮合成酶是类黄酮类物质合成的关键酶。本研究克隆了洋葱的查尔酮合成酶基因AcCHS1和AcCHS2。AcCHS1的ORF序列1182 bp,编码393个氨基酸残基;AcCHS2的ORF序列1 176 bp,编码391个氨基酸残基。在同等条件下,AcCHS2基因的表达明显高于AcCHS1。     

菊芋查尔酮合成酶基因的克隆与表达分析

为揭示菊芋(Helianthus tuberosus L.)查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因的功能,以菊芋‘廊芋8号’叶片为材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,克隆得到菊芋CHS基因命名为HtCHS,其编码区全长为1 197 bp(GenBank登录号MN124515),编码398个氨基酸。HtCHS的基因组DNA(gDNA)全长为1 567 bp,含2个外显子和1个内含子。序列比对和系统进化树分析显示,不同植物中的CHS氨基酸序列具有极高的同源性,菊芋与同属的向日葵CHS氨基酸序列一致性达到99.25%,共聚于一个分支。HtCHS蛋白相对分子质量为43.61 ku,等电点为6.33。HtCHS蛋白具有查尔酮合成酶结构域,属于查尔酮合成酶超家族成员,HtCHS不含信号肽和跨膜区,属于非分泌蛋白。实时荧光定量PCR结果显示,HtCHS在根中表达量最高。与对照相比,150 mmol·L~(-1) NaCl和20%PEG 6000处理6 h时HtCHS表达显著上调,处理12 h时显著下调。原核诱导表达分析结果显示,成功诱导出与预测蛋白大小一致的目的蛋白。     

桃基因组ACC合成酶基因的分离及其生物信息学分析

根据桃(Prunus persica L．Batch)品种Hakuho中与成熟相关的ACC合成酶基因cDNA序列,设计了两对特异引物,从新白花水蜜桃基因组DNA中,利用PCR方法扩增得到两个片段,经过拼接获得了ACC合成酶基因的完整序列(GenBank accession：AY994054),并对其进行了生物信息学分析。该序列全长2496bp,包括4个外显子和3个内含子,4个外显子共长1479bp。桃ACC合成酶基因编码区与蔷薇科梅(Prunus mume)和梨(Pyrus communis)的同源性分别为98％和84％,除终止密码子外,编码492个氨基酸,其中有SLSKDMGLPGLR共12个氨基酸残基的保守区,被认为是ACC合成酶的活性中心,位于274至285氨基酸残基处。推测其酶蛋白分子量为55kDa,pI为8．26。     

干旱胁迫下4种报春苣苔属植物叶绿素荧光特性的比较

以尖萼报春苣苔(Primulina pungentisepala)、永福报春苣苔(Primulina yungfuensis)、翔鸟报春苣苔(Primulina‘Flying Wings’)和启明星报春苣苔(Primulina‘Venus’) 4种报春苣苔属植物为研究对象,采用盆栽自然干旱法比较干旱胁迫下叶绿素荧光参数的变化。结果表明,随着干旱时间延长,仅尖萼报春苣苔干旱30 d时初始荧光(Fo)显著降低,其他3种植物Fo无显著变化。尖萼报春苣苔、翔鸟报春苣苔和启明星报春苣苔最大荧光(Fm)与0 d相比均无显著变化,而永福报春苣苔Fm则在干旱45 d显著低于0 d。最大光化学效率(Fv/Fm)基本呈先升高后降低的趋势,尖萼报春苣苔和翔鸟报春苣苔分别在干旱30 d和15 d显著上升,启明星报春苣苔在干旱45 d显著下降。相对光合电子传递速率(ETR)基本呈先降低后升高再降低的趋势,永福报春苣苔、翔鸟报春苣苔与启明星报春苣苔均在干旱15 d与45 d显著下降,而尖萼报春苣苔在干旱15 d与30 d显著下降。非光化学淬灭(NPQ)呈先升高后降低或先升高后降低再升高的趋势,尖萼报春苣苔在干旱15 d和30 d显著上升,干旱45 d则显著下降,永福报春苣苔在不同干旱时间内均显著上升,翔鸟和启明星报春苣苔仅在干旱15 d与45 d显著上升。光化学淬灭(qP)的变化趋势中,尖萼报春苣苔与永福报春苣苔无显著变化,翔鸟报春苣苔和启明星报春苣苔则呈先降低后升高再降低的趋势。