2株油菜菌核病拮抗内生细菌的筛选鉴定及其拮抗活性初步分析

油菜菌核病是一种严重危害油菜生长的病害。于2017年3月从湖南农业大学生物科学技术学院试验田采集油菜湘油15盛花期植株的根茎叶,采用纯培养法对内生细菌进行分离纯化,共分离得到68株内生细菌;采用基于16S rRNA基因序列的系统发育分析法对内生菌株的多样性进行分析研究;利用琼脂扩散法对内生菌株进行抗菌活性筛选,共筛选出7株抗菌活性较强菌株,分别为Y171004、Y172014、Y173005、Y174007、Y174017、Y177001和Y177002;利用平板对峙法对油菜菌核病病原菌核盘菌的拮抗菌进行筛选,筛选出2株(Y171004和Y177002)油菜核盘菌的拮抗细菌,经初步鉴定为芽孢杆菌(Bacillus),继而对其拮抗活性进行初步分析,其中菌株Y171004的抗菌物质经鉴定为热不稳定性蛋白。研究结果能为该地区油菜内生细菌资源的进一步研究及其在油菜菌核病生物防治等方面的应用提供试验依据和理论指导。     

姜瘟病菌生防芽孢杆菌蛋白的分离及其生物活性

姜瘟病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种细菌性病害,是世界生姜产区中普遍发生的一种毁灭性土传病害。研究表明,从发病田中未发病植株的根际土壤中分离得到的蜡状芽孢杆菌菌株L1(B.cere-us,L1)对茄科雷尔氏菌等8种病原菌具有较强的拮抗能力,具有广谱抗性。经Econo-Pac Q离子交换柱纯化、SDS-PAGE分析,从菌株L1得到一个表观分子量约为40 kDa的拮抗蛋白Lp,该蛋白具有光稳定性,在pH 6.0~8.0,温度20~60℃条件下均表现出对茄科雷尔氏菌的极强拮抗能力,但经胰蛋白酶处理后失活。实验表明,0.38 mg/mL为该蛋白的最低拮抗浓度。     

桃根癌病菌拮抗放线菌抑菌活性物质的分离及其初步鉴定

[目的]分离并初步鉴定从桃树高发根癌病土壤中获得的拮抗线菌G19菌株的抑菌活性物质。[方法]采用蛋白沉淀法对拮抗放线菌G19菌株的抑菌活性物质进行粗提,利用高效液相色谱仪、中压制备色谱仪对其进行分离、纯化,应用MALDI-TOFMS法进行分子量的测定,最后通过化学显色反应进行相关官能团的验证。[结果]经分离纯化后拮抗放线菌G19的抑菌物质被抨击出7个肽段,是分子量范围为900～1 300 Da,同时推断其含有一个Cys并携带H2O,Na＋;官能团显色反应验证该物质为多肽且含有糖基。[结论]研究结果为拮抗放线菌G19菌株的抑菌物质结构的最终确定奠定了基础。     

虎杖内生放线菌的分离鉴定及抗菌活性

采集秦巴山区野生虎杖(Polygonurn cuspidatum),选取以海藻糖、葡萄糖、淀粉等为主要营养和能源的4种培养基,经分离纯化得到47株内生放线菌.经形态学鉴定并结合16S rDNA序列分析,将6株具有较强抑菌活性的菌株初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces)2株,小单孢菌属(Micromonospora)2株,链孢囊菌属(Streptosporangium)2株;采用滤纸片法初步研究了内生放线菌发酵液的抑菌活性.结果表明,17株菌株具有不同程度的抗菌活性,占所有分离菌株的36.2%,其中6株具有较明显的抑菌活性,菌株PEA023对所有靶标菌均有较强的抑制作用,菌株PEA023和PEA032对铜绿假单胞菌具有拮抗活性.     

稻瘟病菌拮抗微生物的筛选

采用稀释平板法从水稻根、叶、穗部分离到大量微生物,用平板对峙培养法测定其中601个菌株对稻瘟病菌的拮抗活性,其中196个菌株具有拮抗活性,占测定总菌株数的32.6%,获得2个生长快且具有显著拮抗作用的菌株B38和B4.进一步的生物测定表明:这2株菌株对作物病原菌有较广的抗菌谱;转管繁殖10代后抑菌作用未退化;发酵液在100 ℃,30 min条件下处理,抑菌作用未丧失;在室温(25 ℃)下浸种24 h对水稻种子的萌发无不良影响.菌株B38和B4显示出很好的生防应用潜力.     

泡菜中产细菌素的乳酸菌分离研究

实验从泡菜中分离出一株有抑制革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌作用的菌株,经鉴定为乳酸菌中的肠膜明串珠菌,该抗菌物质对蛋白水解酶敏感,耐热并在较宽的pH值范围内保持活性.在排除是有机酸和过氧化氢后,初步认为该菌产生的抗菌物质为抗菌肽,即细菌素.     

苹果霉心病生防菌株抗菌蛋白的提纯与部分初报

对苹果霉心病具有优良防治效果的枯草芽孢杆菌ＸＭ１６菌株,是作者从七阳农学院农场苹果树上分离得到的一种拮抗菌株。ＸＭ１６菌株培养液经硫酸铵分级盐析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００及ＤＥ３２柱层析后,分离纯化得到一种抗菌蛋白,该抗菌蛋白通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析测定的分子量为６００００,等电点约为５．５,偏酸性;ＸＭ１６菌株抗菌蛋白对１００℃以上高温稳定。ＸＭ１６蓖株抗菌蛋白对１０种测定的病原真菌,均具有良     

极端嗜热多肽的纯化、性质初探及对苗瘟的防效

本试验用加热法从多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)LM-3菌株的发酵液中纯化得到2个极端嗜热多肽。平板拮抗实验表明,5μl纯化多肽对稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)抑菌率达89.6%。SDS-PAGE电泳显示纯化多肽分子量介于6 000~7000 Da之间。多肽复性后,其中之一对稻瘟病菌表现出强的拮抗活性,命名为APPLM3(Antagonism Polypeptide fromPaenibacilluspolymyxaLM-3);另一个则无此活性,命名为PPLM3(Polypeptide fromPaenibacillus polymyxaLM-3)。APPLM3经氨基酸测序,获得了其N-末端5个氨基酸序列(H2N-ANDPR);以该序列为靶序列在NCBI上进行相似性检索,发现其可能与3个假设蛋白(或推导蛋白)相关。以APPLM3为主效成分配得5种微生物源生防乳剂,对水稻苗瘟进行了田间防效试验。试验结果表明,这5种乳剂的防效都优于LM-3拮抗液直接喷雾,其中AB4处理的防效最佳,达80.73%,其拮抗成分、吐温80、乳化剂OP、溶剂的质量比为50∶6.5∶1.75∶41.75。APPLM3为首次报道的兼具极端嗜热性和稻瘟病菌拮抗活性的小分子多肽。     

解淀粉芽孢杆菌ASR-12抗菌蛋白的分离纯化 及其编码基因克隆

为了从菌株ASR-12发酵液中分离纯化获得抗菌蛋白。将菌株ASR-12发酵液经硫酸铵沉淀、透析除盐后获得粗蛋白,粗蛋白进行热处理和Q Sepharose Fast Flow柱层析,纯化后的蛋白进一步进行LC-MS鉴定,并克隆其编码基因进行测序。粗蛋白经热处理和柱层析后得到5个吸收峰,活性检测结果显示峰Ⅳ具有较高抑菌活性,经SDS-PAGE检测显示为单一条带,分子量约为50k Da。LC-MS鉴定结果显示抗菌蛋白与M42家族肽酶同源性最高,覆盖度达到80%;并能从菌株ASR-12基因组中克隆到M42家族肽酶编码基因,测序结果经BLAST比对与解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2的M42家族肽酶编码基因同源性达100%。菌株ASR-12产生的抗菌蛋白中,M42家族肽酶为主要活性成分。     

两株芽孢杆菌的鉴定

通过对2株芽孢杆菌的形态学、生理生化试验及16S rDNA序列同源性分析,发现B02号菌株与Ba-cillus cereus的同源性为100%,系统发育树分析与Bacillus cereus遗传关系最近,确定该菌株为Bacillus ce-reus。而B03号菌株与Bacillus cereus的同源性为98%,要确定其种还需进一步DNA杂交;该2株芽孢杆菌的芽胞数在1.0×1012个/kg体重以下安全无毒。2株芽孢杆菌的药敏性试验和拮抗性试验结果表明,参试菌对5类抗菌药物大多数都很敏感;对4种动物肠道病原菌无明显拮抗作用。通过酶系测定,参试菌都具有一定SOD酶活性。喂养实验结果表明,2株菌对雏鸡具有一定的防病治病效果。以上结论初步证明该菌株的抑病促生机理主要是生物夺氧和有益代谢产物的作用,而非优势种群、生物拮抗作用。