昆虫几丁质酶的研究与应用

昆虫的几丁质防治昆虫是一种有效的途径，所以近年来几丁质酶的研究越来越受到研究者的关注，对昆虫几丁质酶的酶学特性，理化特性，基因的组织结构以及在植物保护中的应用已有诸多研究资料，本文对此进行综述，并作了分析。     

球孢白僵菌胞外蛋白酶及几丁质酶的研究进展

昆虫病原真菌白僵菌由体表入侵寄主时,分泌蛋白酶、几丁质酶等来分解昆虫体表皮,以完成侵染过程,对致死寄主有相当重要的辅助作用.笔者综述了近年来球孢白僵菌蛋白酶、几丁质酶的研究进展.     

海藻糖代谢及其调控昆虫几丁质合成研究进展

海藻糖为一种非还原性糖,广泛存在于细菌、藻类、真菌、植物和无脊椎动物中。海藻糖被称为昆虫“血糖”,源于该糖为昆虫血淋巴中的主要糖类物质,在昆虫生长、发育、蜕皮等正常生理活动中有着重要的作用。昆虫的海藻糖先由海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase,TPS）生成海藻糖-6-磷酸,然后通过海藻糖磷酸脂酶（trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP）最终合成海藻糖,在能量需求时通过海藻糖酶（trehalase,TRE）降解为葡萄糖,用于能量供给。几丁质为昆虫表皮、中肠围食膜和气管系统的主要组成成分,昆虫在发育过程中需要蜕掉旧表皮,形成新的表皮,该过程一直是害虫控制的重要靶标途径。海藻糖酶为昆虫几丁质合成途径的第一个酶,在几丁质合成通路中有着重要的功能。那么海藻糖代谢又是如何调控几丁质合成途径来控制昆虫的蜕皮及几丁质代谢的呢？随着国内外海藻糖代谢相关基因功能研究的深入开展,研究结果表明昆虫海藻糖供给在几丁质合成中具有重要的作用,海藻糖酶分为可溶性和膜结合型两类,可溶性TRE和TPS在不同昆虫种类中具有多个同源基因,表明昆虫海藻糖代谢进化途径多样化。其次,海藻糖代谢直接调控几丁质合成途径,不论是海藻糖合成酶还是海藻糖酶基因的低表达,均能控制海藻糖使其供给不平衡,从而导致几丁质合成途径受阻,特别是几丁质合成酶基因表达降低而造成几丁质含量下降,该调控作用可进一步引起昆虫蜕皮困难、翅发育畸形等,甚至大量死亡。再次,海藻糖酶抑制剂能够抑制可溶性和膜结合型两类海藻糖酶活性、引起几丁质合成通路相关基因及几丁质酶基因表达的显著下降,导致几丁质含量显著降低,产生高比例的昆虫个体死亡。这些结果充分表明,一旦昆虫海藻糖代谢的供给平衡被打破,会直接影响到昆虫的几丁质合成乃至昆虫的蜕皮与发育过程。本文综述前人在海藻糖代谢调控几丁质合成方面的最新研究成果,为将来开发和利用海藻糖酶抑制剂及海藻糖合成酶抑制剂等绿色农药防治害虫提供理论依据。     

昆虫几丁质代谢与植物保护

正几丁质是昆虫外骨骼和围食膜的重要组成成分,昆虫蜕皮和生长发育依赖于几丁质合成和降解的精细调控。几丁质代谢酶参与昆虫表皮和围食膜几丁质的形成,在昆虫蜕皮发育等生命活动中具有重要的生理功能,利用几丁质代谢酶的调控作用研发分子靶标,在植物保护领域具有潜在的应用价值。RNA干扰(RNAi)技术作为反向遗传学研究的有效工具,在昆虫基因功能研究方面发挥了重要作用,同时在害虫控制方面展示出广阔的应用前景~([1-4])。RNAi技术的发展也推动了昆虫几丁质代谢关键基因生物学功能的解析     

小地老虎几丁质脱乙酰基酶基因的克隆与原核表达

几丁质脱乙酰基酶(Chitin deacetylase,CDA)可以将几丁质修饰为壳聚糖,在昆虫几丁质代谢中具有重要作用。研究以小地老虎(Agrotis ipsilonHufngel)5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到小地老虎几丁质脱乙酰基酶基因的cDNA序列。该序列含有2 048个碱基,包括一个1 626个碱基的开放读码框,编码541个氨基酸,分子质量约为61.7 ku,多肽的等电点为5.03。推导得到的氨基酸序列与其他昆虫,尤其是鳞翅目昆虫的几丁质脱乙酰基酶高度同源。所获小地老虎CDA基因的cDNA序列已登录GenBank并获得登录号,登录号为JQ012932。将CDA基因连接到PET21b载体上转入到BL21中诱导表达,SDS-PAGE电泳得到目的蛋白条带。     

昆虫几丁质合成酶B基因的研究进展

几丁质是昆虫的主要组成成分，由于几丁质不存在于植物和无脊椎动物中，被认为是环境友好型农药的设计靶标。几丁质合成酶B是几丁质合成路径中的最后一个关键酶，近些年已成为国内外研究的热点内容。根据国内外对昆虫几丁质合成酶B基因功能的研究，综述了几丁质合成酶B对几丁质合成的调控研究进展，包括时空表达特性、基因功能、基因在害虫防治中的研究、并对RNA干扰技术应用存在的问题及解决途径进行了展望。     

微生物几丁质酶在植物线虫病害防治等领域的应用

几丁质酶在防治由真菌、昆虫及线虫等低等生物引起的植物病虫害中发挥着重要的作用。对微生物几丁质酶在植物寄生线虫病害和其它领域中的应用等方面的现状及今后的发展方向进行了综述,以期微生物几丁质酶能够得到更加广泛地研究和利用,并将其应用于植物寄生线虫等病虫害的生物防治。     

少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶基因的克隆及生物信息学分析

为研究捕食线虫性真菌几丁质酶的功能,在国内首次对少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-801和AO-483基因进行扩增、克隆及测序,并对其编码蛋白信号肽、疏水性与亲水性、高级结构、功能域进行预测和分析。结果显示,2个不同蛋白均具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGGW和DGXDXDWE,属于糖苷水解酶18家族几丁质酶,无信号肽序列,表明这2个蛋白为非分泌型蛋白,二级结构以无规则卷曲、α-螺旋和β-折叠为蛋白的主要结构元件,三级结构中有(α/β)8的圆桶形结构。系统发育分析表明,几丁质酶AO-801和AO-483与昆虫病原真菌几丁质酶的亲缘关系更为接近,说明它们所产生的几丁质酶在侵染宿主的过程中发挥着类似的功能,并且不同来源真菌几丁质酶根据分子质量的差异形成3个不同的进化分枝。     

二斑叶螨几丁质酶基因的克隆及特性分析

几丁质酶广泛存在于自然界的许多物种,并参与几丁质降解、蜕皮、免疫和致病性等诸多功能.采用同源克隆结合RACE-PCR的方法,首次从螨类中克隆到二斑叶螨几丁质酶基因(TuChi)的cDNA全长序列(GenBank登录号:JQ041366).TuChi全长1 822 bp,包含3'非翻译区(UTR)为150 bp和5'UTR为52 bp,开放阅读框(ORF)为1 620 bp,编码539个氨基酸.预测的相对分子量为60.7 ku,理论等电点为5.99.二斑叶螨几丁质酶具有几丁质酶典型的结构域,包括1个N-端信号肽序列、1个几丁质催化区域、1个几丁质结合域,以及连接催化区和结合域之间的连接区域.与其他物种几丁质酶进化树比较分析表明,TuChi与昆虫几丁质酶家族Group 1具有较高的同源性,推测其与二斑叶螨的蜕皮密切相关.     

植物几丁质酶及其在油菜抗真菌病害中的作用

几丁质酶存在于各种生物中,是以几丁质(聚乙酰氨基葡萄糖)为底物的糖苷水解酶,为单基因所编码。根据其氨基酸序列的同源性可把几丁质酶分为18家族和19家族两大类。18家族存在于各种生物中,如病毒、细菌、真菌、昆虫、节肢动物、植物和哺乳动物等,而19家族大多存在于植物中,     

甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶基因(secda 5)的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]几丁质脱乙酰酶(Chitin deacetylase,CDA,EC 3.5.1.41)是昆虫几丁质代谢中的一种关键酶,在昆虫生长、发育和代谢中具有重要作用.本研究旨在克隆甜菜夜蛾secda5基因,对其进行原核表达,同时制备其蛋白的多克隆抗体.[方法]以pMD19-T-secda5重组质粒为模板,通过PCR技术获得编码甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)中肠几丁质脱乙酰酶secda5全长基因,连接pET-28a载体并转化E.coli BL21 (DE3)构建工程菌.以不同IPTG浓度、培养温度对目的蛋白进行诱导表达.[结果]IPTG终浓度为0.50 mmol/L、37℃诱导培养4h时蛋白表达量最高.诱导表达获得的重组蛋白经纯化后制备多克隆抗体.[结论]此研究成功克隆了甜菜夜蛾secda 5基因,并进行了原核表达以及多克隆抗体的制备.     

三种新型化合物对草地贪夜蛾海藻糖与几丁质代谢及生长发育的影响

[目的]几丁质是昆虫外骨骼和围食膜的主要成分,其合成始于海藻糖酶(trehalase,TRE),终于几丁质合成酶(chitin synthase,CHS),蜕皮与外表皮重塑过程则需要依靠几丁质酶(chitinase,CHT)完成.本研究通过注射3种新型化合物,检测草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)...     

微生物几丁质酶及其在植物病害防治中的作用

几丁质酶广泛存在于植物、动物及微生物细胞和组织中,参与多种生理过程。研究发现许多动物、植物、微生物都可以产生几丁质酶。笔者主要对微生物几丁质酶的特性、功能及几丁质酶在植物真茵病害防治中的应用方面进行了综合论述,并对几丁质酶在植物病害生物防治和抗病基因工程中的应用前景进行了展望。     

昆虫几丁质合成关键酶功能及其RNAi技术在害虫防治中的研究进展

几丁质对昆虫的生长发育至关重要,且不存在于植物和哺乳动物中,因此其合成途径的关键酶是较为理想的杀虫剂靶标。近年来,多种害虫的几丁质合成关键酶基因被克隆和鉴定,通过RNAi技术应用于一些重要害虫的防治研究工作中。本文较为系统的总结了近些年害虫几丁质合成关键酶的基因克隆及功能研究进展,重点阐述了几丁质合成酶、海藻糖酶基因基于RNAi技术应用于害虫防治取得的研究进展,分析了RNAi技术通过转基因植物表达dsRNA（RNAi抗虫作物）以及作为核酸农药（dsRNA）直接进行作物喷施的两种应用途径,文章最后还探讨了RNAi在害虫防治中面临的主要瓶颈问题以及主要应对策略。上述较为系统的归纳和总结,目的是为今后基于几丁质合成关键酶的RNAi技术应用于害虫绿色防控研究提供有价值的理论指导。     

香梨优斑螟几丁质合成酶(CHS-A)基因片段序列分析

几丁质合成酶A作为昆虫蜕皮和变态发育过程中几丁质合成的关键酶,已成为环境友好杀虫剂的理想靶标之一。为研究香梨优斑螟几丁质合成酶的基因结构及潜在应用,以同源基因克隆技术获得目的基因序列,利用生物信息软件进行序列分析。结果显示:该基因5’端2534bp碱基序列编码了蛋白质804个氨基酸,包含催化区域11个保守区中的8个,TMHMM 2.0软件预测此蛋白质中含有9个跨膜螺旋。以13种昆虫氨基酸序列(相似度大于90%)构建系统发育树,结果显示香梨优斑螟(Euzophera.pryiella)与脐橙螟蛾(Amyelois Transitella)进化关系最近,其次云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana),与三种蝶类(Papilio sp.)及家蚕(Bombyx mori)进化关系较远。     

人参classⅢ几丁质酶Gchil基因克隆及原核表达分析

几丁质（N-乙酰氨基葡萄糖线性聚物）是病原真菌细胞壁的主要成分,几丁质酶通过破坏细胞新物质的沉积,激发寄主植物的抗病反应,使病原真菌细胞壁中的几丁质降解。植物几丁质酶具有广泛的生理活性。几丁质的酶基因工程成为目前抗真菌基因工程研究热点之一。本研究通过几丁质酶基因的克隆,构建原核表达载体pET-28a（＋）-GchiI,利用IPTG诱导表达,经PAGE分析表明,该基因表达的蛋白分子量为34kD左右,其表达产物主要以包涵体的形式存在。抑茵圈试验发现,IPTG浓度为0．6mmol／L时抑茵效果最佳。本研究对利用基因工程技术培育抗病作物品种,提高作物抗病性具有重要参考价值。     

几丁质酶在植物病害生物防治中的应用

主要对几丁质酶的特性、功能及其在植物真菌病害防治中的应用进行了综合论述。在此基础上,对几丁质酶在植物病害生物防治中的应用前景进行了展望。     

蚕蛹壳几丁质降解菌的分离筛选及其产酶条件优化研究（英文）

[目的]对产几丁质酶菌株发酵产酶活性工艺进行优化。[方法]将筛选得到的一株产几丁质酶菌株G-254进行驯化培养,通过单因素试验考察了不同碳源、氮源和无机盐对菌株产酶活的影响响应面试验利用,以菌株发酵所产酶活为响应值,确定最佳的发酵产酶工艺条件。[结果]菌株G-254发酵产几丁质酶最佳发酵条件为：葡萄糖8%,牛肉膏料5%,硫酸镁0.07%,在此条件下获得的几丁质酶活为6.86U。[结论]该研究提高了菌株发酵产几丁质酶酶活,为后续工业化发酵生产奠定了基础。     

蚕蛹壳几丁质降解菌的分离筛选及其产酶条件优化

[目的]对产几丁质酶菌株发酵产酶活性工艺进行优化。[方法]将筛选得到的1株产几丁质酶菌株G-254进行驯化培养,通过单因素试验考察了不同碳源、氮源和无机盐对菌株产酶活的影响;进行响应面试验,以菌株发酵所产酶活为响应值,确定最佳的发酵产酶工艺条件。[结果]菌株G-254发酵产几丁质酶最佳发酵条件为,葡萄糖8%,牛肉膏料5%,硫酸镁0.07%,在此条件下获得的几丁质酶活为6.86 U。[结论]提高了菌株发酵产几丁质酶酶活,为后续工业化发酵生产奠定了基础。     

木霉几丁质酶和几丁寡糖的制备及提纯

[目的]为木霉几丁质酶和几丁寡糖的开发应用提供必要的技术支持。[方法]由高产几丁质酶的木霉菌株YHS-1液体振荡培养得到木霉几丁质酶粗酶液,分别测定了木霉菌株YHS-1在不同时间、不同温度下的几丁质酶活值,优化木霉产酶条件。并研究了几丁寡糖的制备及提纯方法。[结果]供试木霉最佳产酶温度为35℃,最佳产酶时间为4 d,此时酶活值为55 U。几丁质酶粗酶液通过(NH4)2SO4分级沉淀、阴离子交换柱层析、SDS-PAGE提纯后可以达到层析纯,出现单一并且峰值很高的层析峰,电泳确认2条带,分别为几丁质外切酶和几丁质内切酶。几丁寡糖用初提纯的几丁质酶与过量的胶态几丁质反应得到粗溶液,再经过蛋白质沉淀和冷冻离心后得到纯化。[结论]建立了木霉几丁质酶和几丁寡糖的制备及提纯方法,为木霉几丁质酶和几丁寡糖的开发应用提供了必要的技术支持。