二斑叶螨几丁质合成酶(CHS)基因的克隆及序列分析

为了解二斑叶螨(Tetranychus urticae)几丁质合成酶(CHS)基因结构及其潜在应用,采用同源基因克隆技术克隆二斑叶螨几丁质合成酶基因TuCHS,克隆获得的目的基因全长4 608bp,编码1 535个氨基酸,其蛋白预测分子质量约为175.48ku,理论等电点6.92。其包含EDR和QRRRW 2个几丁质合成酶特有的标签序列,18个保守基序。ExPASy在线分析表明,该基因具有18个跨膜螺旋、1个氨基化位点、5个糖基化位点以及12个酰基化位点。结合其他物种CHS基因构建系统发育树,结果表明,该基因催化区域与其他3种昆虫CHS1基因的相似性为80%~89%,属于几丁质合成酶A类基因。     

二斑叶螨几丁质酶基因的原核表达及多克隆抗体制备

以制备的二斑叶螨c DNA为模板,克隆二斑叶螨几丁质酶Se Chi基因功能结构域催化区片段,大小为786 bp。将该序列片段克隆到表达载体p ET-32a(+)中,获得多克隆原核表达载体p ET-32a-Tu Chi。重组质粒经酶切测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.6 mmol·L-1IPTG诱导4 h后高效表达约45 ku可溶性重组蛋白;经His亲和层析洗脱和浓缩获得高纯度的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备Tu Chi多克隆抗体。制备的多克隆抗体经Western Blot证实能特异性地识别几丁质酶而不与非特异性蛋白结合。ELISA分析表明制备的抗体效价达1??80 000,效价较高,为进一步研究二斑叶螨几丁质酶相关功能奠定基础。     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht2基因的克隆及特征分析

【目的】拟克隆朱砂叶螨几丁质代谢中的关键基因几丁质酶基因,并对其进行特征分析。【方法】利用转录组拼接技术对朱砂叶螨转录组进行拼接,根据叶螨几丁质酶序列通过BLAST找到朱砂叶螨几丁质酶相似序列,设计PCR引物,进行朱砂叶螨几丁质酶基因克隆,分析其详细特征。利用SWISS MODEL预测其蛋白结构,特别是催化功能区的结构。【结果】测序分析确认为朱砂叶螨几丁质酶基因序列,并提交到GeneBank(KY705296),其开放阅读框为1 875bp,编码624个氨基酸,C端有几丁质结合区。根据新的几丁质酶分类,判定TecCht2为Ⅵ型几丁质酶,其结构具有典型的几丁质酶结构特征。【结论】本研究克隆得到的朱砂叶螨几丁质酶基因,为今后几丁质酶功能和用于害螨防治研究奠定基础。     

香梨优斑螟几丁质合成酶(CHS-A)基因片段序列分析

几丁质合成酶A作为昆虫蜕皮和变态发育过程中几丁质合成的关键酶,已成为环境友好杀虫剂的理想靶标之一。为研究香梨优斑螟几丁质合成酶的基因结构及潜在应用,以同源基因克隆技术获得目的基因序列,利用生物信息软件进行序列分析。结果显示:该基因5’端2534bp碱基序列编码了蛋白质804个氨基酸,包含催化区域11个保守区中的8个,TMHMM 2.0软件预测此蛋白质中含有9个跨膜螺旋。以13种昆虫氨基酸序列(相似度大于90%)构建系统发育树,结果显示香梨优斑螟(Euzophera.pryiella)与脐橙螟蛾(Amyelois Transitella)进化关系最近,其次云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana),与三种蝶类(Papilio sp.)及家蚕(Bombyx mori)进化关系较远。     

朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3基因克隆及表达特征分析

[目的]拟克隆朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3并对其进行表达特征分析.[方法]采用同源基因克隆技术克隆TecCDA3,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达特征.[结果]成功克隆朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3 (GenBank No.MK779705),其开放阅读框长度为1 611 bp,共编码536个氨基酸,含有3种结构域,根据同源性和发育树分析判定其属于几丁质脱乙酰基酶家族Group Ⅱ.TecCDA3在成螨时期表达量最高,在幼螨时期表达量最低,呈现先下降后升高的表达趋势.[结论]克隆得到朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3并对其表达特征进行分析,丰富朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶基因家族.     

朱砂叶螨谷氨酸门控氯离子通道GluCl1基因的克隆与序列特征分析

朱砂叶螨是一种分布广泛、危害极大、难以防治和易产生抗性的农业害螨。为了研究朱砂叶螨杀螨剂神经靶标谷氨酸门控氯离子通道,进一步确定阿维菌素对朱砂叶螨的抗性机理,采用同源基因克隆以及RACE技术,克隆朱砂叶螨杀螨剂靶标谷氨酸门控氯离子通道(GluCl1)基因全长,分析其序列特征。结果表明,GluCl1基因序列全长为1856 bp,其中开放阅读框(ORF)为1338 bp,编码455个氨基酸,N端含25个氨基酸的信号肽,有4个跨膜结构域,GenBank登陆号为KC543353。同源比对分析表明,朱砂叶螨与其他蜱螨目GluCl基因有高度的同源性,特别与二斑叶螨的相似度最高。研究还发现朱砂叶螨敏感品系GluCl1第3个跨膜区的G314,与二斑叶螨敏感品系相应位点的氨基酸G323一致,而二斑叶螨抗性品系相应位点突变为D323。本研究进一步证实了G323突变为D323和二斑叶螨对阿维菌素产生抗性有关。本研究为今后建立以朱砂叶螨谷氨酸门控氯离子通道为靶点的选择性杀螨剂体外筛选体系奠定坚实基础。     

杨树PsChiⅠ基因全长的克隆与表达分析

【目的】克隆川杨几丁质酶基因cDNA全长序列,分析其在病原菌侵染过程中不同时段的表达特征。【方法】以受落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)单孢子堆菌系Sb052侵染后的川杨叶片为试材,采用RACE法克隆川杨几丁质酶基因cDNA序列,对其进行生物信息学和实时荧光定量表达分析。【结果】克隆到1条川杨几丁质酶基因序列,将其命名为PsChiⅠ(GenBank登录号:KC416180)。该序列全长1 145bp,包含1段960bp的开放阅读框(ORF),38bp的5′非编码区和147bp的3′非编码区。其编码蛋白含有319个氨基酸,具有2条糖苷水解酶19家族特征序列,理论等电点为5.03,为ClassⅠb型酸性几丁质酶,属于几丁质酶第19家族。序列比对和系统进化树结果表明,PsChiⅠ与毛果杨(Populus trichocarpa)几丁质酶基因相似性最高,且亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,菌系Sb052侵染杨树叶片后PsChiⅠ基因在各个时段都有表达,但以侵染后12和48h时的表达量相对较高。【结论】获得了几丁质酶基因全长序列,推测其参与了寄主川杨抵抗真菌的防御机制。     

斑茅过氧化氢酶基因(EaCAT-1a)克隆与序列分析

斑茅是栽培种甘蔗最重要的近缘物种之一,具有抗逆性强等特点。本文以高粱过氧化氢酶基因(NCBI登录号为XM002437586.1)c DNA序列为探针,对甘蔗属EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,后经基因组PCR、分子克隆、序列分析验证成功分离了1个斑茅过氧化氢酶基因DNA序列(Ea CAT-1a,Gen Bank登录号为KF864223)。该序列全长3831 bp,包含8个外显子和7个内含子,c DNA序列长为1532 bp,包含10 bp的5’非翻译区(UTR)和43 bp的3’UTR,以及一个1479 bp的开放读码框,编码492个氨基酸,此蛋白序列具有过氧化氢酶保守结构域,属于CAT家族。将推测的Ea CAT-1a蛋白序列与高粱、水稻、玉米等物种进行同源进化分析,均表现出较高的保守性。     

朱砂叶螨烟碱型乙酰胆碱受体α4亚基基因的克隆与序列特征分析

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)是一种对神经递质乙酰胆碱起快速反应的激动剂门控离子通道,也是新烟碱类杀虫剂的作用靶标。此研究利用同源克隆结合RACE技术,从朱砂叶螨敏感品系中克隆了一条nAChR基因,全长为2 023bp,开放阅读框长1 635bp,编码544个氨基酸。预测分子量(Mr)为62.20kDa,等电点(pI)为5.00。根据同源性及系统发育分析,将其命名为Tcα4,提交至NCBI数据库,获得GenBank登陆号为KP694228。Tcα4具有nAChRα亚基典型结构特征:N端胞外结构域和C端跨膜结构域。Tcα4与二斑叶螨nAChRα4亚基基因序列同源性高达98.71%,与二斑叶螨其他nAChR亚基基因同源性仅在20.07%~43.16%之间,与其他昆虫nAChRα4亚基基因同源性在45.96%~56.07%之间。系统发育分析结果表明朱砂叶螨与二斑叶螨和肩突硬蜱nAChRα4亚基基因在同一分支,与其他昆虫nAChRα4亚基基因则较远。朱砂叶螨nAChRα4亚基基因的克隆为朱砂叶螨其他nAChR亚基基因的研究及以nAChR为作用靶标的新型杀螨剂的研究提供了一种新途径,奠定了基础。     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pColdⅡ载体上,构建pColdⅡ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pColdⅡ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。     

中华稻蝗几丁质酶基因10（OcCht10）的分子特性及功能

【目的】获得中华稻蝗（Oxya chinensis）几丁质酶基因10（OcCht10）的cDNA序列,预测其功能域,并做聚类分析明确该基因的系统发育关系。绘制OcCht10在5龄若虫不同组织部位和发育时间的表达图谱,研究其在中华稻蝗蜕皮过程中的生物学功能,为害虫防治提供高效安全的候选基因。【方法】从中华稻蝗转录组数据库搜索OcCht10 cDNA片段,经过blast分析、比对、拼接后,翻译为氨基酸序列,预测其功能域,并与其他昆虫几丁质酶家族基因进行聚类分析,进一步确认该基因的系统发育关系并进行准确命名;选取中华稻蝗5龄第6天不同组织部位及5龄若虫不同天数表皮样本,总RNA提取后反转录为cDNA模板,采用Real-time quantitative PCR（qPCR）方法获得OcCht10在5龄稻蝗若虫不同组织部位和不同发育阶段的表达谱;设计OcCht10 dsRNA引物,用试剂盒体外合成dsOcCht10,采用注射法进行RNA干扰;取注射24 h稻蝗表皮样本,用qPCR方法检测OcCht10基因沉默效率;并仔细观察dsRNA注射后稻蝗表型,统计其死亡率。【结果】经对中华稻蝗转录组数据库的搜索,获得OcCht10 cDNA片段长度为9 318 bp,开放阅读框为8 613 bp,编码2 870个氨基酸;其3′非编码区为705 bp,推测OcCht10 5'端有500多碱基尚未获得;预测其氨基酸序列具有多个结构域,包含有5个几丁质酶催化域和6个几丁质结合域;与其他昆虫几丁质酶基因聚类分析结果显示OcCht10属于昆虫几丁质酶家族基因Ⅱ组,该组基因与昆虫蜕皮相关;5龄若虫组织特异性分析表明该基因主要在表皮、前肠和后肠等外胚层发育而成的组织器官中表达,提示OcCht10可能参与表皮几丁质代谢;发育时间表达图谱表明该基因在5龄第6-7天,即蜕皮前的表皮中高表达,表明OcCht10可能负责蜕皮时表皮几丁质降解;5龄若虫第2天注射该基因的dsRNA,24 h后取表皮检测其干扰效率,结果显示该基因被沉默70%;与注射dsGFP的对照组相比,注射dsOcCht10 5龄若虫表现为龄期延长,旧表皮无法开裂,蜕皮受阻,昆虫无法正常活动导致死亡,死亡率达到100%。【结论】获得OcCht10的部分cDNA序列,该基因在昆虫蜕皮前表皮中高表达;OcCht10参与中华稻蝗的蜕皮发育,注射dsOcCht10可有效沉默靶基因,并导致试虫无法完成正常蜕皮而死亡。     

鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的克隆、组织表达谱和序列特征分析

 【目的】克隆仙湖肉鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的cDNA,并进行组织表达谱和蛋白结构分析,为肉鸭的分子育种提供基础资料。【方法】通过比较基因组学,采用RT-PCR和RACE技术,获得了Lb-FABP基因的cDNA序列全长序列;并采用半定量PCR分析了Lb-FABP基因在16个组织的表达;通过生物信息学方法预测了Lb-FABP基因的蛋白结构。【结果】仙湖肉鸭Lb-FABP基因的cDNA全长548bp,包括97bp长的5′非翻译区(5′UTR)和70 bp长的 3′非翻译区(3′UTR)以及381 bp开放阅读框(ORF,含终止密码子)。Lb-FABP基因组序列包括4个外显子和3个内含子,3个内含子分别长为991 bp、292 bp和713 bp。在所检测的16个组织中Lb-FABP基因mRNA均有表达,尤其在肝脏组织中的表达明显高于其它组织。Lb-FABP理化性质表明该蛋白为一偏碱性蛋白,无明显的信号肽和跨膜区域;蛋白二级结构主要由β折叠和少量的α螺旋、loop环构成,预测发现在第5—22氨基酸残基处存在一个细胞溶质脂肪酸结合蛋白活性功能区;其三维结构由反向平行的10条β链及2条短α链组成的有一开口的“蛋白桶”构成。Lb-FABP基因氨基酸序列与鸡的该基因氨基酸的相似性为97.0%,与其它非哺乳脊椎动物的同源性达80%以上,比对尚未发现哺乳动物存在该基因。【结论】成功克隆肉鸭Lb-FABP基因cDNA序列以及基因组序列,该基因在肝脏组织的表达高于其它组织,并获知在5—22氨基酸处存在其蛋白活性功能区。     

羊草Class Ⅱ几丁质酶基因的克隆及序列分析

[目的]克隆自然生长于黑龙江省盐碱地的羊草ClassⅡ几丁质酶基因并进行序列分析,为进一步研究几丁质酶基因的生物功能和应用奠定了基础。[方法]构建羊草叶片的cDNA文库,对其进行DNA序列测定和分析,并与GenBank中收录的植物几丁质酶基因序列及编码的氨基酸序列进行同源性比较。[结果]在羊草叶片eDNA文库中克隆出1条全长eDNA片段,片段长996bp,其中,可读框768bp,编码255个氨基酸。编码产物在结构上缺乏CBD和C-端延伸区,具有ClassⅡ几丁质酶的结构特征,其氨基酸序列与黑麦和小麦ClassⅡ几丁质酶具有很高的同源性;构建的pQE—LcChi2重组载体经诱导后表达出一个约27KD的蛋白,与推测的pQE-LcChi2基因编码产物大小一致。[结论]LcHi2基因在大肠杆菌中能够表达,是一个具有表达功能的基因。     

绒山羊RORα基因2种亚型的结构与进化分析

为深入研究绒山羊RORα基因的结构及功能,利用cDNA末端快速扩增法（RACE）结合转录组获得了绒山羊（Capra hircus）维甲酸相关孤核受体（retinoic acid receptor-related orphan receptorα,RORα）基因的2个亚型:RORα1和RORα2（GenBank登录号分别是HM₀61155和HM₃58053）。序列分析表明,RORα1序列全长1 620bp,包括5′端非翻译区（untranslated region,UTR）29bp、3′端非翻译区211bp和开放阅读框（open reading frame,ORF）1 380bp,共编码459个氨基酸,分子质量约为52.3ku,理论等电点6.25。RORα2序列全长1 694bp,包括5′UTR 76bp、3′UTR 211bp和ORF 1 407bp,共编码468个氨基酸;与人RORα4的长度相同,相似性达99%,分子质量约为53.4ku,理论等电点为6.37。结果显示:1)RORα1氨基酸序列缺少大多数核受体具有的调节区（A/B区）,预测的二级结构少一个β-折叠基序（YFV）;2)RORα的DNA结合区到配体结合区部分属于纯化选择,A/B区在长度和序列方面变异都很大。     

缢蛏铁蛋白基因的分子特性及其表达分析

从缢蛏(Sinonovacula constricta)cDNA文库中筛选出一条铁蛋白同源序列,直接扩增质粒获得全长cDNA序列,共1 106 bp,包括128 bp的5’非翻译区和309 bp的3’非翻译区,以及669 bp的开放阅读框。阅读框共编码222个氨基酸,N端含有17个氨基酸的信号肽序列,推算的分子量约为25.47 ku,理论等电点为5.48。氨基酸序列分析结果表明,该基因含有保守的铁氧化酶活性中心的7个氨基酸残基,但是不具有糖基化位点(NQS)和5’非编码区铁蛋白的铁反应元件(iron response element,IRE),属于H型铁蛋白基因,该基因被命名为ScFERs。系统进化显示,基本上同一个物种的不同亚型铁蛋白首先聚在一起,然后和其他物种的铁蛋白聚在一起。缢蛏ScFERs首先与日本花棘石鳖(Liolophura japonica)LjFERs聚在一起,然后与缢蛏另一种ScFER以及文蛤(Meretrix meretrix)MmFERs聚在一起。荧光定量PCR检测结果显示ScFERs基因在肝胰腺中高度表达,肝胰腺与其它组织间的表达量存在着极显著差异。经鳗弧菌(Vibrioanguillarum)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)诱导后,ScFERs基因表达水平呈显著上调。为进一步研究缢蛏铁蛋白基因的结构和功能奠定了基础。     

红鳍东方鲀gsdf基因的克隆及表达模式分析

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes的性别决定因子(gonadal soma derived factor,GSDF),利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)首次克隆了红鳍东方鲀gsdf基因(Trgsdf)的c DNA全长序列(Gen Bank登陆号:KR914667)。结果表明:Trgsdf c DNA序列全长为1734 bp,其中5'端非编码区144 bp,开放阅读框648 bp,3'端非编码区942 bp,共编码215个氨基酸;预测的氨基酸序列中存在1个长度为19个氨基酸的信号肽和相同长度的跨膜区,1个N-糖基化位点NST,1个TGF-β家族成员特有的保守结构域;BLAST同源性分析结果显示,红鳍东方鲀GSDF氨基酸序列与其他鱼类的相似性为26%~58%;系统发育分析结果显示,鱼类GSDF单独聚为一支,与TGF-β超家族内的其他成员分开,红鳍东方鲀与青鳉Oryzias latipes GSDF的亲缘关系最近,先聚为一支,后与三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus聚在一起,与矛尾鱼Latimeria menadoensis的GSDF亲缘关系最远;应用RT-PCR技术检测Trgsdf mRNA在雌性和雄性红鳍东方鲀成鱼不同组织中的表达,结果显示,Trgsdf mRNA在卵巢和精巢中高表达,在皮肤和肌肉组织中微量表达,在其他组织中无表达;采用相对实时荧光定量PCR方法比较了成鱼卵巢和精巢中Trgsdf mRNA的表达量,结果显示,Trgsdf mRNA在精巢中的表达量显著高于卵巢(P0.05),约为卵巢表达量的6倍。研究表明,gsdf基因可能在红鳍东方鲀的性腺尤其是精巢的分化和发育过程中起着重要的作用。     

酸柚根系CS和PEPC基因的克隆及序列分析

以酸柚(Citrus grandis)根系为材料,利用热硼酸法提取了根系总RNA,并逆转录成cDNA,利用PCR和RACE技术相继得到柠檬酸合酶基因(CS)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的保守区、3'端和5'端.酸柚根系CS基因全长1760bp,开放读码框有1413 bp,编码472个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为52.487 ku,等电点为6.9,亲水指数为-0.199;5'端非编码区为67 bp,3'端非编码区为277 bp;推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.4%-99.6%).酸柚根系PEPC基因全长3307 bp,开放读码框有2604 bp,编码868个氨基酸,氨基酸序列相对分子质量为99.569ku,等电点为6.68,亲水指数为-0.398;5'端非编码区为431 bp,3'端非编码区为269 bp,推导的氨基酸经序列比对,发现与其他物种具有很高的同源性(85.8%-95.7%).初步确定克隆到的为酸柚根系CS和PEPC基因,登陆Genbank,登陆号分别为HQ537481和HQ537482.     

毛尖紫萼藓GpAPX的克隆和信息学分析及其在植株干旱与复水下的表达分析

以毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)为试材,采用RACE技术克隆获得1个抗坏血酸过氧化物酶基因(APX)的cDNA序列,命名为GpAPX(GenBank登录号:GU989311)。该基因全长1 115 bp,编码区为771 bp,编码256个氨基酸,5’非翻译区为116 bp,3’非翻译区为228 bp。序列分析表明:该基因属于过氧化物酶基因家族,与其他植物抗坏血酸过氧化物酶的同源性为70.2%～89.7%。实时定量PCR检测结果显示,GpAPX在干旱及复水条件下均能表达,表明GpAPX蛋白可能与抗旱性相关,在毛尖紫萼藓响应干旱胁迫过程中发挥作用。     

草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因cDNA的克隆与表达分析

利用快速扩增cDNA末端(rapid amplification cDNA end, RACE)技术获得草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因全长cDNA序列为2 093 bp,含有1个1 944 bp的开放阅读框,5′非编码区长25 bp,3′非编码区长124 bp,可编码647个氨基酸.生物信息学分析表明,在IAP的N端无氨基酸残基组成的信号肽;与斑马鱼的同源性最好,其次是斑猫鲿;在系统进化上,与斑马鱼、斑猫鲿共聚为1支.用半定量RT-PCR分析正常及细菌诱导下草鱼细胞凋亡抑制蛋白基因在不同组织中的表达分布,正常情况下,凋亡抑制蛋白基因在所取的7种组织中均有表达,其中脑、肠和肾表达最高,肝和心脏次之,鳃和肌肉最低,但差异不显著;用嗜水气单胞菌人工感染24 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均降低约26%,以肝脏和肌肉降低较为明显,在感染48 h后,所有组织中的IAP mRNA水平平均升高约4%,其中心脏、肝脏和鳃分别升高8%、16%、19%,这表明草鱼细胞凋亡抑制蛋白可能参与了机体对嗜水气单胞菌感染的免疫应答.     

羊草ClassⅡ几丁质酶基因的克隆及序列分析

1材料与方法 1．1植物材料采摘自然生长于黑龙江省安达市（119°28’E,44°1’N）盐碱地的羊草叶片,-70℃冰箱保存。1．2总RNA的分离与eDNA文库的构建用液氮研磨叶片后,用TRIZOL Reagent（GIBCO BRL）提取总RNA,使用PolyATtract mRNA Isolation Systems（Promega）提取mRNA。然后采用Stratagene提供的cDNA合成体系合成cDNA,体外包装和扩增,构建羊草叶片的cDNA文库。