公鸡生殖器官组织结构及其IL-1β和IL-6在生殖器官中的定位

【目的】IL-1β和IL-6在公鸡生殖器官免疫保护中发挥着重要的作用,研究拟揭示公鸡生殖器官的组织构造,以及定位IL-1β和IL-6在其生殖器官中的表达部位。【方法】通过苏木精-伊红染色方法,制作正常生理状态下公鸡生殖器官切片,观察公鸡生殖器官的组织构造以及生殖管道上皮细胞变化规律;同时采用免疫组化定位IL-1β和IL-6在生殖器官的部位。【结果】实验表明,附睾中的管道在公鸡生殖管道中占有很大比例,且生殖管道的上皮细胞的变化特征与其输送精液高度适应;IL-1β和IL-6主要定位于附睾近端输出管上,且IL-1β主要定位于短皱褶的近端输出管,IL-6主要定位于长皱褶的近端输出管上。【结论】结果表明附睾的输出管,尤其是近端可能是清除生殖道中的异常精子、脱落细胞等异物的主要部位。     

公鸡生殖器官中T细胞分布密度研究

【目的】检测CD4+/CD8+T细胞在公鸡生殖器官中的分布密度。【方法】通过荧光定量PCR分析IL-8的表达水平,以及通过冰冻切片和免疫组化技术,定位健康公鸡的生殖系统中CD4+和CD8+T细胞。【结果】IL-8在附睾中表达水平最高,在睾丸中的表达水平最低;有少量的CD4+和CD8+T细胞被定位在睾丸间质细胞区。在附睾管和输精管的固有层和黏膜上皮中,均识别到两种类型的T细胞。而且CD4+和CD8+T细胞在公鸡生殖道中不同部位密度的变化趋势明显:CD4+和CD8+T细胞在公鸡生殖管道中段(输出管、附睾管)的密度高于两端(睾丸网、输精管)。【结论】T细胞介导的免疫防御主要发生在附睾,尤其附睾输出管和附睾管中。     

IL-1β及其受体在雌牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中的表达定位

为探索正常生理条件下IL-1β和IL1R1参与雌性牦牛生殖调控及早期胚胎发育的生物学作用,试验采集雌性牦牛主要生殖器官(卵泡期:输卵管、卵巢、子宫;黄体期:输卵管、卵巢、子宫;妊娠期:输卵管、卵巢、子宫),并生产孤雌激活胚胎。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测IL-1β和IL1R1 mRNA在组织和胚胎发育过程中的表达;并采用蛋白质免疫印迹(Western-blot,WB)和免疫组织化学方法从蛋白水平分析IL-1β和IL1R1在各生殖器官的表达水平与定位。结果显示IL-1β和IL1R1在牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中均有表达。其中卵泡期输卵管中IL-1β和IL1R1表达均高于黄体期和妊娠期,卵泡期卵巢和妊娠期卵巢中IL-1β和IL1R1的表达高于黄体期,妊娠期子宫中IL-1β和IL1R1的表达高于卵泡期和黄体期,孤雌激活胚胎中IL-1β和IL1R1的表达桑椹胚最高,8细胞次之,2细胞和囊胚期最低。免疫组织化学结果显示IL-1β和IL1R1在输卵管黏膜上皮、卵泡颗粒层、黄体细胞、子宫上皮和子宫腺体均有表达。研究结果表明IL-1β和IL1R1参与牦牛生殖周期和胚胎发育的调控作用,为进一步探究IL-1β和IL1R1的作用机制提供了理论基础,有助于牦牛胚胎体外培养技术的改进。     

IL-1β和IL-6在建昌黑山羊睾丸和附睾中的分布与发育性表达

【目的】研究IL-1β和IL-6在建昌黑山羊的睾丸、附睾头和附睾尾中的分布和发育表达。【方法】采用免疫组化技术分别检测55、104、300和1 140日龄建昌黑山羊睾丸、附睾头和附睾尾中IL-1β和IL-6分布和表达水平。【结果】结果表明:在各个日龄睾丸的曲精细管的精原细胞中检测到IL-1β和IL-6,在55和104日龄睾丸结缔组织中检测到IL-1β,以及300和1 140日龄睾丸曲精细管基膜中检测到IL-6;在附睾头、尾生殖管道的柱状纤毛上皮细胞和基膜细胞中均检测到IL-1β和IL-6。相同组织不同日龄IL-1β、IL-6比较分析表明:IL-1β、IL-6的表达从55到300日龄在精原细胞表达逐渐降低,而在睾丸结缔组织和曲精细管基膜层中,随日龄增加,表达水平显著升高(P<0.05);在附睾头部,IL-1β、IL-6随发育日龄没有显著变化(P>0.05);而在附睾头部的柱状纤毛上皮细胞中,IL-1β在300日龄时的表达水平显著低于55和104日龄(P<0.05),IL-6在104日龄时的表达水平显著高于55日龄(P<0.05)。【结论】IL-1β和IL-6在建昌黑山羊的睾丸和附睾中均检测到,而且在睾丸和附睾尾部的表达与发育日龄有关。     

建鲤IL–1β和IL–8基因实时荧光定量RT–PCR 检测方法的建立

根据Gen Bank上的基因序列,在保守区设定并合成特异性引物,选择β–actin作为内参基因,采用SYBR Green I染料法,进行熔解曲线分析和标准曲线的制作。熔解曲线表明,β–actin、IL–1β、IL–8的基因产物均为特异性产物,其Tm值分别为86、82.5和84℃;标准曲线表明,各基因Ct值的检测范围为12~32,扩增效率分别为96.3%,103.2%和102.6%,具有良好的线性关系,且r2均大于0.990;组内变异系数分别为0.14%~0.86%,0.18%~0.93%和0.13%~0.86%;用建立的方法检测健康建鲤头、肾组织中IL–1β、IL–8的表达情况,相对表达量分别为1.09和1.71。综合分析,建立的建鲤IL–1β、IL–8基因实时荧光定量PCR方法具有检测范围广,扩增效率高,特异性强,重复性高的特点,可用于建鲤IL–1β、IL–8基因的表达测定。     

雄性蜡皮蜥生殖器官的年周期变化

[目的]研究蜡皮蜥繁殖特征。[方法]每月购买5~6只雄性蜡皮蜥成体,解剖其生殖器官,并进行形态和组织学特征观察。[结果]蜡皮蜥雄性生殖器官组织结构具有一定年周期变化。睾丸重量和曲细精管管径,每年6月达峰值后迅速下降,8月降至最小值,9月开始增大,冬眠期发育缓慢,出蛰后继续增大;附睾和输精管的管径及管壁厚的年周期变化与睾丸重的变化情况基本相同;生精活动随生殖器官的周期性变化也发生相应的年周期变化。[结论]利用精巢重量的年周期变化来判定精子发生进程适用于蜥蜴类。     

GPx5在内蒙古绒山羊附睾中的表达

为研究GPx5在内蒙古绒山羊附睾中的表达模式,对初情期、体成熟期、老龄期3个生殖生理阶段绒山羊附睾及睾丸中的GPx5从mRNA和蛋白水平进行了检测。结果显示各生殖生理阶段绒山羊睾丸中均未见GPx5表达,附睾中均有GPx5表达。各生殖生理阶段附睾表达区域及表达量存在差异:初情期,GPx5 mRNA和蛋白主要表达于附睾头部;体成熟期,附睾各区域GPx5 mRNA和蛋白的表达量极显著高于其他阶段,附睾起始部和附睾头部为主要表达区;老龄期,GPx5 mRNA和蛋白主要表达于附睾头部,但较体成熟期明显减少。免疫组化定位显示GPx5蛋白主要分布于附睾上皮细胞,而且各年龄阶段绒山羊附睾腔内精子上都有明显的GPx5阳性信号。研究表明绒山羊附睾GPx5的表达区域及表达量变化与动物生殖生理阶段直接相关。     

LCN5蛋白在雄性绵羊生殖器官及精子中的表达定位

【目的】探究绵羊附睾视黄酸结合蛋白——载脂蛋白5（lipocalin5,LCN5）在睾丸、附睾不同区段及输精管组织表达特点及其精子中的定位,为LCN5在雄性生殖器官中的功能研究提供理论依据。【方法】选择体重相近（（65.23±1.95）kg）、体况良好、健康无病的9月龄公绵羊6只,其中3只使用假阴道法采集精液,3只做无菌去势。快速采集左侧睾丸（testis,T）、附睾输出小管（efferent ducts,ED）、附睾头（caput,E1-E2）、附睾体（corpus,E3-E5）、附睾尾（cauda,E6-E7）及输精管（vas deferens,VS）组织样分别置于液氮和4%多聚甲醛中。使用计算机辅助精子分析仪检测精液中精子、从右侧睾丸、附睾不同区段及输精管中分离出精子的运动学参数;利用Western blot技术和免疫组织化学法检测睾丸、附睾不同区段及输精管中LCN5蛋白表达;采用精子免疫荧光观察睾丸、附睾不同区段及输精管中精子LCN5定位及分布。【结果】（1）精子运动学参数结果表明：附睾尾部和射出精子A级、C级精子数、VAP、VSL、VCL、ALH、BCF、WOB、LIN和STR均显著高于其他区段（P<0.05）。输精管精子中A级精子百分比、VAP、VSL、WOB、LIN均显著高于输出小管,附睾头和附睾体段（P<0.05）。然而,睾丸精子完全无运动能力。（2）Western blot结果显示LCN5在附睾头E1区段表达量最高,在附睾头E2区段、附睾尾E6区段表达量高于附睾体、睾丸和输出小管（P<0.05）,定量分析结果显示LCN5蛋白表达量从高到低为：E1>E2>E6>E3≈E5≈E4≈E7>VS>ED>T。（3）睾丸、附睾不同区段及输精管LCN5免疫组化结果表明,LCN5蛋白定位于睾丸长形精子细胞中,在ED主细胞和基底细胞中有微量表达,附睾头、附睾体和附睾尾主细胞、基底细胞及纤毛中大量表达并出现强阳性信号,管腔有颗粒状LCN5信号分散在精子聚集区内;输精管平滑肌细胞中也出现了较弱LCN5阳性信号。（4）睾丸、附睾不同区段及输精管中精子LCN5免疫荧光结果显示,LCN5在睾丸和输出小管精子顶体帽和中段中有微弱信号,在附睾头E1区段中精子顶体前端及尾部中段出现了强阳性信号。精子鞭毛上原生质滴中也有LCN5表达;精子运行到E6区段时,部分精子头部全部被包裹、原生质滴脱落完成成熟,但有些精子尾部仍有原生质滴,直到附睾尾E7区段原生质滴完全脱落。精子表面LCN5在附睾尾和体区段的表达模式与附睾头区段类似。【结论】LCN5蛋白在绵羊雄性生殖器官组织中区域性表达,高度表达在附睾头中,聚集在附睾尾E6区;LCN5蛋白在附睾头、附睾体、附睾尾及输精管的精子表面、鞭毛原生质滴中呈动态分布,这也表明其在精子成熟过程中的潜在功能。总之,LCN5可能在精子发生、成熟、贮存方面发挥重要作用,这也为后续LCN5的功能研究及其开发利用提供了理论参考。     

促性腺激素受体在母犬生殖器官的表达定位研究

为研究促性腺激素受体(FSHR、LHR)在母犬生殖器官中的分布情况,运用免疫组织化学SABC法对处于卵泡期、黄体期成年母犬的卵巢、子宫、输卵管中FSHR和LHR分别进行免疫定位。结果表明:FSHR和LHR阳性细胞在卵巢主要见于卵母细胞、颗粒细胞、卵泡膜细胞、外周生殖上皮细胞和血管周围间质细胞;输卵管中主要分布于输卵管黏膜表面的柱状上皮细胞和肌层细胞;子宫中主要见于子宫内膜上皮细胞、子宫腺上皮细胞。此外,发情周期不同,FSHR和LHR的表达量存在差异,卵泡期卵巢FSHR和LHR的表达量均高于黄体期,且卵泡期卵巢的FSHR阳性反应强度均高于LHR;子宫中卵泡期FSHR、LHR的阳性反应强度高于黄体期,且黄体期中LHR阳性反应强度高于FSHR;输卵管中卵泡期FSHR、LHR的阳性反应强度高于黄体期,且黄体期LHR阳性反应强度高于FSHR。本试验研究促性腺受体在动物生殖器官中的表达情况,对进一步探讨动物促性腺激素的作用机制,具有非常重要的意义。     

外泌体miR-218抑制脂多糖诱发子宫内膜上皮细胞免疫因子释放研究

[目的]探究奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体及其miR-218在减轻大肠杆菌脂多糖诱发免疫反应中的作用.[方法]用不同质量浓度大肠杆菌脂多糖作用于奶牛子宫内膜上皮细胞系24 h后采用细胞计数试剂盒检测细胞活性;酶联免疫吸附测定检测免疫因子IL-1β和TNF-α释放;采用透射电子显微镜和蛋白印记法验证提取外泌体的粒径和标识蛋白CD63表达,荧光定量聚合酶链式反应法检测外泌体中miR-218表达变化;采用激光共聚焦显微镜观察外泌体与奶牛子宫内膜上皮细胞融合;细胞转染mimics 218检测其对大肠杆菌脂多糖诱发奶牛子宫内膜上皮细胞免疫因子释放的影响.[结果]100μg/mL大肠杆菌脂多糖处理奶牛子宫内膜上皮细胞后,IL-1β、TNF-α含量均显著高于对照组(P＜0.05);大肠杆菌脂多糖刺激奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体中miR-218的表达量极显著低于奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体中miR-218的表达量(P＜0.01);正常培养奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体能够与大肠杆菌脂多糖处理的奶牛子宫内膜上皮细胞融合并与NF-KB (p65)蛋白共定位于细胞质中.将奶牛子宫内膜上皮细胞来源外泌体加入到100 μg/mL大肠杆菌脂多糖处理奶牛子宫内膜上皮细胞24 h后,显著抑制了大肠杆菌脂多糖引起的奶牛子宫内膜上皮细胞培养上清中的IL-1β和TNF-a释放(P＜0.05).同样的,转染进奶牛子宫内膜上皮细胞内mimics 218与磷酸化的NF-KB (p65)核外部分共定位并显著抑制了大肠杆菌脂多糖诱发的奶牛子宫内膜上皮细胞中TNF-α释放(P＜0.05),而对IL-1β释放无显著差异.[结论]miR-218能够随着健康子宫内膜上皮细胞分泌外泌体进入到受到大肠杆菌脂多糖刺激奶牛子宫内膜上皮细胞内,并与磷酸化p65核外部分共定位并抑制大肠杆菌脂多糖引起的TNFα的释放.