珍稀野生大王杜鹃根际土壤细菌群落结构分析

为探明大王杜鹃(Rhododendron rex)根际土壤细菌群落结构,为今后开展大王杜鹃的根际促生菌(PGPR)分离筛选、人工培育及濒危机制研究奠定基础,本研究以野生大王杜鹃根际土壤为研究对象,采用高通量测序技术对土壤细菌16S rRNA的V3-V4区片段进行测序。结果表明：大王杜鹃根际土壤细菌测序共获得有效序列230 150条,基于≥97%的相似阈值对有效序列进行聚类后获得958个操作分类单元(OTU),隶属于19门54纲83目140科188属。细菌群落呈多样性分布,且在门、纲、目、科、属分类水平上的优势类群较为突出,优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。细菌生态功能以化能异养(Chemoheterotrophy)、需氧化能异养(Aerobic chemoheterotrophy)和固氮作用(Nitrogen fixation)为主,种群的相对丰度分别为6.98%、6...     

高通量测序分析根结线虫对马铃薯根际土壤真菌群落多样性的影响

【目的】分析根结线虫对马铃薯根际土壤真菌群落多样性的影响。【方法】通过高通量测序技术、土壤性质测定及生物信息学技术分析感染根结线虫马铃薯和健康马铃薯根际土壤真菌群落多样性差异。【结果】从6个土壤样品中共获得3界12门34纲77目171科332属526种的土壤真菌。对物种多样性指数分析后,发现感染根结线虫马铃薯病株与健康马铃薯植株的根际土壤真菌群落多样性和土壤性质均存在显著性差异。对6个样品进行物种组成分析后,在门水平中,感病植株根际土壤真菌Basidiomycota丰度较健康植株根际土壤真菌丰度高,Ascomycota丰度低于健康植株根际土壤;在科水平中,病株根际土壤丰度较高的菌群有Nectriaceae和Trimorphomycetaceae;在属水平中,健康植株根际土壤丰度较高的菌群为镰刀菌属Fusarium、被孢霉属Mortierella和未知分类毛壳菌科属unclassified_f_Chaetomiaceae。【结论】感染根结线虫的马铃薯与健康马铃薯根际土壤真菌群落丰度在门、科和属水平上均存在差异,为进一步研究马铃薯根结线虫的发生和防治提供了新的思路。     

连作对辽细辛土壤理化性质和根际微生物群落特征的影响

连作障碍是制约辽细辛产业发展的瓶颈问题。为探究连作对辽细辛根际土壤微生物多样性、群落结构以及土壤理化性质的影响,以未种植辽细辛土壤为对照,测定不同种植年限土壤理化性质含量,采用Illumina Miseq测序根际土壤的细菌和真菌群落,分析土壤理化性质与微生物群落特征之间的相互关系。连作辽细辛根际土壤中细菌分属于36个门、46个纲、96个目、161个科、282个属;真菌分属于14个门、38个纲、81个目、136个科、194个属。结果表明,连作使土壤pH值和有机质含量逐年下降,碱解氮、有效磷和速效钾含量先增后降,碱解氮和有效磷含量均显著高于对照。随着连续种植年限的增加,变形菌门和拟杆菌门相对丰度明显增加,放线菌门、酸杆菌门和芽单胞菌门相对丰度明显降低;粪壳菌纲和孢霉纲为优势真菌菌群,其丰度呈逐年递减趋势。分析结果表明,土壤碱解氮含量与细菌辛普森指数呈显著负相关,碱解氮含量与香农指数呈显著负相关,速效钾含量与真菌香农指数呈显著正相关;在细菌属水平上,有嗜酸菌属、节杆菌属、罗河杆菌属、褚氏杆菌属和Methylovirgula等优势菌属,种植6年后显著高于对照。而Gaiella、诺卡氏菌属、地杆...     

基于GSS高通量测序技术的怀山药根、茎中内生真菌群落多样性分析

采用GSS高通量测序技术分别测定怀山药根和茎中内生真菌的内转录间隔区ITS序列,将真菌归类到种或亚种水平。用Qiime和Mothur等软件分析样品的序列数目和操作单元数量,进而分析物种的丰度和Alpha多样性。本试验从怀山药根和茎分别获得的有效序列数为64 774条和273 930条;根、茎OTU数分别为268、308。其中根部内生真菌含5门,14纲,36目,65科,92属,109种;茎部内生真菌包含4门,14纲,38目,66科,95属,112种。结果表明,怀山药根、茎中内生真菌非常丰富,且茎中内生真菌多样性程度略高于根。根的优势菌群为葡萄孢盘菌属(Botryotinia),茎的优势菌群为链格孢属(Alternaria)。     

灭菌方式对人参连作土壤养分及真菌群落结构的影响

强还原土壤灭菌和氯化苦土壤熏蒸是2种常用的农业措施,为了探寻2种灭菌方式对人参连作土壤养分及真菌群落结构的影响,采用化学分析和高通量测序技术研究氯化苦土壤熏蒸技术加复合微生物菌肥(SFC＿CB)、强还原土壤灭菌技术加复合微生物菌肥(RSD＿CB)和氯化苦土壤熏蒸技术加强还原土壤灭菌技术(SFC＿RSD)对人参连作土壤养分及真菌群落结构的影响。结果表明,SFC＿CB处理组显著提高了土壤有机质(SOM)和全钾(TK)含量,RSD＿CB处理组显著提高了土壤电导率(EC值)和速效钾(AK)、水解氮(AN)含量,SFC＿RSD处理组显著提高了土壤pH值和有效磷(AP)含量;与RSD＿CB处理组相比,SFC＿CB、SFC＿RSD处理组显著降低了土壤真菌群落丰富度、多样性和均匀度,提高了覆盖度;从不同处理土壤样本中共检测到5个真菌门、9个真菌纲、15个真菌目、19个真菌科和24个真菌属,其中共有OTU被划分为20个真菌属,有17个真菌属的相对丰度发生显著变化,特有OTU被划分为47个真菌属,SFC＿CB、RSD＿CB、SFC＿RSD处理组分别包含15、29、18个属。此外,土壤真菌群落多样性与土壤养...     

大球盖菇菌渣原位还田对土壤理化性质及真菌多样性的影响

为了有效利用大球盖菇菌渣,研究了大球盖菇菌渣原位还田对土壤养分(有机质和氮、磷、钾)含量、土壤酶(磷酸酶和脱氢酶)活性及土壤真菌多样性的影响。结果表明:与对照相比,大球盖菇菌渣还田能够显著降低土壤p H,中和土壤酸碱度,并显著提高大田土壤有机质含量以及全氮、全磷、全钾、速效氮、碱性速效磷和速效钾含量。大球盖菇菌渣处理组的土壤磷酸酶和土壤脱氢酶活性均显著高于对照(CK),分别增加30%以上和40%以上。大球盖菇菌渣处理组的土壤真菌多样性低于对照,处理组土壤中优势菌群为Hypocreales(肉座菌目)、Russulaceae(红菇科)、Pezizales(盘菌目)、Saccharomycetales(酵母目)、Bursaria(袋形虫属),对照土壤中优势菌群为Pseudoplatyophyra(拟匙口虫属)、Aleuria(网孢盘菌属)、Onygenales(爪甲团囊菌目)、Trichosporon(丝孢酵母属)、Sordariomycetes(粪壳菌纲)、Sordariales(粪壳菌目)、Basidiomycota(担子菌门)。     

多花黄精根腐病对根际土壤酶活性及真菌群落变化的影响

对多花黄精根腐病病株及健株根际土样的理化性质、酶活性变化及真菌种群群落进行分析,探索多花黄精根际土壤真菌群落组成与根腐病发生的关系,为有效防治多花黄精根腐病的发生提供一定的理论依据.以种植3年的健株(HJJ)、病株(HJB)根际土壤和未种植(HJCK)土壤为实验材料,采用常规方法测量土壤理化性质和相关土壤酶活性,并利用Illumina MiSeq高通量测序技术,对3种土样真菌群落结构进行分析.结果表明:与多花黄精健根相比,病根根际土壤的pH值、碱解氮、速效磷、速效钾质量分数降低,有机质有所升高;根际土壤中的脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、酸性蛋白酶活性均减弱.高通量测序3个土样共产生215 191条Clean tags,平均产生71 730条Clean tags;根际土壤中真菌DNA测序结果显示,在97%的ITS序列同源水平下划为1 193个OTU,被注释到11门、 28纲、 62目、 125科、 197属、 209种,根际土壤中真菌多样性为HJCKHJBHJJ.在门和属水平上,根际土壤中前3位的优势种群分别为子囊菌门(Ascomycota)、丝抱菌门(Mortierellomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和侧耳属(Pleurotus)、被孢霉属(Mortierella)、镰刀霉属(Fusarium).因此得出,多花黄精根腐病的发生改变了根际土壤的理化性质、酶活性和真菌群落结构.     

基于高通量测序对塔克拉玛干沙漠南缘2种多年生植物根际细菌及真菌群落结构的研究

本研究利用高通量测序法(Miseq测序平台)对塔克拉玛干沙漠南缘2种多年生植物根际土壤微生物进行初步研究。结果表明,骆驼刺根际土壤中细菌分为16门、33纲、67目、129科、320属,柽柳根际土壤中细菌分为14门、30纲、66目、125科、335属;骆驼刺根际土壤中真菌分为8门、13纲、36目、58科、104属,柽柳根际土壤中真菌分为8门、13纲、34目、59科、92属。2种植物根际微生物群落结构种间存在差异,真菌差异大于细菌且丰度高。     

不同种植年限对凤丹牡丹根际真菌群落组成和多样性的影响

连作障碍对牡丹的生长发育会产生严重的影响,根际微生物环境会对这种改变做出相应的反馈,因此,对连作状态下的不同种植年限凤丹牡丹根际微生物环境的研究有重要意义.采用Illumina高通量测序技术,以苏州地区的3、6、10年生凤丹牡丹根际土壤为研究对象,对根际真菌群落进行测序分析,研究真菌ITS rDNA可变区的丰富度和多样性指数.测序后不同种植年限根际土中共得到1020520条原始序列,序列过滤拼接后可得613250条序列(tags);3组土壤样品共含有891个分类操作单元(OTUs),涵盖了5门、115纲、15目、175科、230属、320种菌群;3年生凤丹牡丹根际优势菌群为球囊菌门(Glomeromycota)、木耳科(Auriculariales)、盘菌科(Pezizaceae)、球腔菌科(Mycosphaerellaceae);6年生凤丹牡丹的优势真菌群落主要有肉座菌目(Hypocreales)、鬼伞属(Coprinopsis)、巢菌科(Nidulariaceae)、黑蛋巢菌(Cyathus)、银耳目(Tremellales);10年生凤丹牡丹的优势真菌群落主要有丝膜菌属(Cortinarius)、蜡皮马鞍蜡壳菌(Helvellosebacina)、革菌属(Thelephora).α多样性分析和β多样性分析均表明,不同种植年限凤丹牡丹根际土菌群群落多样性所呈现的规律为6年生>3年生>10年生.此外还发现,在连作状态下不同种植年限的凤丹牡丹根际真菌群落多样性之间有显著差异,菌群群落多样性呈先升高后降低的趋势.     

大花杓兰根际与非根际土壤真菌多样性的高通量测序分析

采用Illumina Miseq高通量测序技术对大花杓兰根际与非根际土壤真菌群落组成进行对比分析。结果表明,大花杓兰根际土壤获得63 780条Clean tags,非根际土壤获得48 094条Clean tags。基于≥97%的相似度水平,通过聚类共获得1 223个OTUs,根际和非根际土壤真菌OTUs数量分别为1 004和945,二者共有726个OTUs。Chao1和Shannon指数揭示根际土壤真菌群落在丰富度和多样性上均高于其非根际土壤。与非根际土壤相比,在门、纲、目、科和属分类水平上丰度显著增加的根际土壤真菌类群分别为担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agaricomycetes)、伞菌目(Agaricales)和鸡油菌目(Cantharellales)、小菇科(Mycen-aceae)和角担菌科(Ceratobasidiaceae)、小菇属(Mycena)和角担菌属(Ceratobasidium)。首次从分子水平上揭示大花杓兰根际与非根际土壤真菌群落的多样性对大花杓兰的保育具有重要意义。     

美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia的wsp基因分子检测及系统发育分析

【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。     

火龙果HpGST基因克隆及表达分析

为探究火龙果（Hylocereus）谷胱甘肽S-转移酶基因（HpGST）的功能,克隆了HpGST基因的cDNA序列,并进行生物信息学及表达分析。结果显示：HpGST序列全长为666 bp,编码221个氨基酸,编码蛋白属于非分泌型不稳定亲水性蛋白,亚细胞定位预测其于细胞质中发挥作用;系统进化树显示其与藜麦亲缘关系较近,属谷胱甘肽转移酶Tau家族;实时荧光定量PCR分析结果显示,HpGST在火龙果不同色泽类型品种果肉中均有表达,在有色素累积的紫肉和粉肉类型中表达量均显著高于无色素累积的白肉类型,表达趋势均为先上升后下降,其表达量与甜菜素含量呈现正相关,且在不同色泽类型品种中表达趋势与甜菜素累积趋势高度一致,推测HpGST基因在火龙果甜菜素合成与分布中发挥重要作用。     

shRNA下调家蚕细胞系BmCREB的表达

sh RNA(short hairpin RNA)是一种干扰基因表达、研究基因功能的有效方法。CREB(c AMP response element binding protein)是真核生物重要而又保守的转录调控因子,参与许多生理功能的调节。作者前期的研究发现,家蚕CREB(Bm CREB)的表达与家蚕滞育的诱导密切相关。为进一步阐明BmCREB调控家蚕滞育的分子机制,利用p MD18-T质粒构建BmCREB的干扰质粒p MD18-U6-shRNA,转染家蚕卵巢细胞系(BmN),对其下调BmCREB的表达进行研究。结果表明,在BmN细胞系中转染1μg shRNA,72 h后能有效地下调BmCREB蛋白的表达量,最高干扰效率达63.0%。不同干扰片段shRNA质粒的干扰效果差异很大,其中T-227的干扰效果最好。这些结果为进一步利用shRNA方法在家蚕体内下调基因表达,研究BmCREB基因与家蚕滞育的关系奠定基础。     

芽孢杆菌拮抗镰孢菌机制的研究进展

镰孢菌（Fusarium）分泌多种真菌毒素引起的枯萎病、赤霉病、根腐病和穗腐病等植物病害,造成重大的作物生产损失。化学防治是防治镰孢菌的重要手段,但其带来的镰孢菌抗性和生态环境污染等问题,严重制约了农业可持续发展。在病害管理中使用生物防治剂为控制镰孢菌引起的植物病害提供了一种安全、有效和可持续的手段,因此生物防治具有比化学防治更深远的优势。在生物防治剂中使用最广泛的生防微生物是芽孢杆菌属（Bacillus）的成员,其可通过多种机制为植物提供有效控制镰孢菌入侵的方案。芽孢杆菌作为一种优良的生物防治剂已被广泛研究,其可通过生态位竞争、产生抗菌物质、诱导植物系统抗性和塑造根际健康微生物组来拮抗镰孢菌侵染,本文从以上4个方面对芽孢杆菌拮抗镰孢菌的机制进行综述,为农业生产中芽孢杆菌防治镰孢菌病害的研究提供参考。     

假结核耶尔森氏菌rpoS基因的抗胁迫功能

为探讨食源性病原微生物假结核耶尔森氏菌的抗逆机制,采用同源重组原理进行双交换以获得rpoS基因突变株。分别在5mmol/L H_2O_2和pH 3.5两种胁迫下测定野生型菌株、rpoS基因突变株和互补菌株的存活率,并以2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)为荧光探针,测定两种胁迫下细菌胞内活性氧水平。结果显示,在5mmol/L H_2O_2和pH3.5胁迫下,假结核耶尔森氏菌rpoS基因突变株存活率明显降低,这种降低能够在互补菌株中得到恢复;突变株中胞内活性氧自由基水平明显高于野生型菌株和互补菌株。说明:rpoS基因具有帮助假结核耶尔森氏菌抗氧化胁迫和酸胁迫的功能,且这一功能的发挥是通过调节胞内活性氧水平实现的。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

神经毒素基因RjAa17f在Sf9细胞中的表达及活性分析

【目的】在昆虫草地贪夜蛾细胞(Sf9)中表达一种能专一阻断昆虫钠、钾离子通道的神经毒素基因RjAa17f。【方法】运用杆状病毒真核表达系统表达RjAa17f毒蛋白,并用蛋白质印迹对其进行检测;测定RjAa17f毒蛋白引起健康棉铃虫中肠膜电位的变化,并对其毒力进行测定。【结果】通过重组杆状病毒质粒的转染和Western blot检测验证,神经毒素基因RjAa17f的重组Bacmid已经成功转染到Sf9细胞中,且在Sf9中表达出与预测大小一致的RjAa17f目的蛋白;此毒蛋白作用于棉铃虫中肠3~12h后,中肠膜电位与CK相比差异显著,且随着作用时间的延长,棉铃虫中肠膜电位呈逐步升高的趋势,作用9h以后,升高的幅度逐渐降低,趋于平缓。RjAa17f毒蛋白对棉铃虫的LD50为108.12μg/g。【结论】在Sf9细胞内表达出了有活性的RjAa17f毒蛋白,且该毒蛋白对棉铃虫中肠膜电位有显著改变。     

牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法的建立

【目的】建立牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌的双重PCR检测方法。【方法】根据布鲁氏菌IS711序列和单增李斯特菌毒力因子HlyA序列设计并合成引物,建立双重PCR检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检测,并制备污染模型乳,通过直接检测、增菌后检测、细菌富集后增菌检测,确定最低检测限。【结果】建立了牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法,该方法特异性好、敏感性高、可重复性好。布鲁氏菌和单增李斯特菌单PCR检测最小DNA质量浓度分别为0.282和3.33 pg/μL,双重PCR检测最小DNA质量浓度分别为2.82和33.3 pg/μL。感染模型乳不经过增菌,布鲁氏菌和单增李斯特菌最低检测限分别为104和8×104CFU/mL;经过24h增菌,就可以检测到10 CFU/mL的布鲁氏菌,经过12 h增菌,就可以检测到8 CFU/mL的单增李斯特菌;经过离心法富集细菌后再增菌,灵敏度可以扩大40~50倍,布鲁氏菌经24 h增菌后最低检测限为10 CFU/40 mL,单增李斯特菌经12 h增菌后最低检测限为8 CFU/40 mL。【结论】建立的双重PCR检测方法特异、灵敏、可重复,可单独或同时检测牛奶中的布鲁氏菌和单增李斯特菌,也可以用于其他产品中布鲁氏菌和单增李斯特菌的检测。     

黄瓜YABBYs家族及CsYAB1a基因功能初探

为鉴定黄瓜YABBYs家族及对CsYAB1a基因的生物学功能进行初步探究,通过BLASTp比对鉴定黄瓜YABBYs基因,并对其进行基因、蛋白质水平分析和染色体定位,同时利用实时荧光定量和原位杂交技术检测其在黄瓜中的时空表达模式;在拟南芥中异源过表达CsYAB1a基因,对转基因株系进行表达量分析和表型观察统计;通过外源喷施脱落酸和生长素处理检测CsYAB1a基因的响应情况。结果表明:1)黄瓜YABBYs家族包含8个家族成员,所有成员均包含C2C2锌指结构域和YABBY结构域;大部分YABBYs基因在生殖器官有表达,CsYAB1a基因主要在花瓣原基和子房外果皮中富集,并呈现出远轴端表达的极性模式。2)在拟南芥中异源过表达CsYAB1a基因导致雌雄蕊发育畸形且果荚变短、叶片细长并向远轴端卷曲等表型;CsYAB1a基因调控拟南芥果实和叶片的发育,并对果实发育基因AtSPL、AtIND、AtHEC以及叶片极性基因AtAS1和AtKANs的表达量有影响。3)黄瓜YABBYs基因启动子包含5种激素响应元件,CsYAB1a和CsCRC基因对外源脱落酸和生长素喷施处理均有响应。综上,推测黄瓜YABBYs家族可能在黄瓜营养生长和生殖生长过程中发挥重要作用,且CsYAB1a基因调控黄瓜果实和叶片的发育。     

牙鲆变态发育过程中epigen基因的空间表达分布

细胞分裂在鲽形目鱼类变态过程中发挥了重要作用。Epigen作为表皮分裂原,通过激活MAPK通道来调控有丝分裂。以前的研究利用定量PCR表明,epigen在变态前期表达量升高,而变态后期表达量下降,表明其与变态发育相关。为了进一步调查epigen与牙鲆变态发育的关系,利用RNA整体原位杂交技术检测了epigen在变态期牙鲆体内的空间表达分布,发现在变态期的各个阶段,epigen基因表达分布均比较广泛,表皮、鳃、肝脏、肠道、鳍条、支鳍骨、肌节等组织都有表达,在牙鲆变态前和变态早期(E期)信号较强,而在变态高峰期(F期和G期)和变态后期(H期)信号逐渐变弱。Epigen空间表达分布模式提示,其作为表皮分裂原,可能广泛参与牙鲆变态发育早期事件,尤其可能与肝脏、肠道、支鳍骨和鳍条的发育有关。