新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF086蛋白的原核表达、纯化及抗体制备

新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是导致石斑鱼养殖严重经济损失的主要病原体。本研究构建了含有新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)ORF086基因的重组表达质粒载体pET32a-ORF086,将其转化到大肠杆菌中进行融合表达,经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,证实重组大肠杆菌融合表达了SGIV ORF086蛋白。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isoprophl-thio-β-D-galactopyranoside,IPTG)浓度、诱导温度、诱导时间等诱导表达条件的优化,确定在0.7 mmol/L IPTG、16℃诱导14 h时可溶性SGIV ORF086重组蛋白占重组蛋白的60%。经镍琼脂糖凝胶柱纯化重组蛋白,纯化度达95%以上。用纯化的SGIV ORF086蛋白免疫小鼠,获得了高效特异的SGIV ORF086抗血清。     

新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF39L基因克隆、表达及抗体的制备

为研究新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)核心基因ORF39L在病毒侵染过程中的作用,制备了SGIV ORF39L表达蛋白的抗体;通过生物信息学软件预测SGIV ORF39L的抗原表位基因,并以所选抗原表位基因片段39Ag1和39Ag2构建原核表达质粒pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2;将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2;用所得融合蛋白分别免疫小鼠,获得了高效特异抗体39Ab1和39Ab2;利用制备的抗体进行间接免疫荧光试验,结果显示,VP39参与了SGIV的装配。本研究结果为进一步研究ORF39L基因在SGIV感染过程中的作用机制提供了数据资料。     

石斑鱼虹彩病毒SGIV感染致病的细胞分子基础及免疫防控对策

虹彩病毒(Iridovirus)是目前海水和淡水养殖鱼类最严重的病毒性病原之一,已从100多种鱼类中分离鉴定出该病毒。石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是从新加坡养殖的患病石斑鱼中分离鉴定的高致病性虹彩病毒,是虹彩病毒科Iridoviridae蛙病毒属Iridovirus 1种新的病毒。本文从以下几个方面对SGIV的研究进行综述:SGIV的形态、超微结构及其在石斑鱼细胞中的复制和装配过程;SGIV病毒基因组、转录组、囊膜蛋白质组及miRNAs的解析;SGIV感染宿主靶标组织的鉴定;病毒侵染的入侵方式、运动轨迹和胞内运输的实时追踪;SGIV感染宿主引起类凋亡的死亡机制及介导的信号通路的揭示;多种宿主免疫抗病基因对病毒感染的调节作用;多种SGIV的检测技术,包括基于抗体的流式细胞技术、微流控芯片检测技术、环介导等温扩增技术及核酸适配体检测方法等;SGIV的灭活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗的研制等。以期为深入阐明SGIV感染致病机理奠定坚实的理论基础,为发展抗病毒对策提供技术支撑。     

石斑鱼PPAR-δ基因SNP位点和单倍型与抗虹彩病毒和神经坏死病毒抗性的关联

【目的】获得石斑鱼Epinephelus spp.抗病分子标记,选育石斑鱼抗病品系以解决石斑鱼病害频发的问题。【方法】基于免疫基因PPAR-δ的基因组DNA序列开展单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点筛选,并对这些位点分别进行石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus, SGIV)和神经坏死病毒(Red-spotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV)抗性的关联分析。【结果】在SGIV感染的易感组和抗感组样品中共筛查到9个SNP位点,均位于内含子中;多态信息含量(Polymorphism information content, PIC)的范围为0.177～0.375,其中,SNP-S1(g.940T>A)属于低度多态(PIC<0.25),其余SNP位点属于中度多态(0.25≤PIC<0.50);关联分析结果显示,SNP-S7(g.4595T>A)基因型频率在SGIV易感组和抗感组中存在显著差异分布(P<0.05),SNP-S7的...     

传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)ORF086基因的表达·纯化及其抗体的制备

[目的]构建传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF086基因的融合表达载体,制备抗体为进一步研究ORF086蛋白的免疫保护性提供前提条件。[方法]PCR扩增目的基因,构建重组质粒,经酶切鉴定,PCR和核酸序列分析后,IPTG诱导表达,Ni-柱纯化,注射新西兰白兔获得抗血清。[结果]扩增出ORF086基因,成功构建了重组质粒pET32a-ORF086,SDS-PAGE电泳和Western-blot分析显示,获得一条36.0 kD的融合蛋白。[结论]成功构建了原核表达载体,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经柱层析纯化蛋白,纯度达90%以上。     

传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF086基因的表达&#183;纯化及其抗体的制备

[目的]构建传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF086基因的融合表达载体,制备抗体为进一步研究ORF086蛋白的免疫保护性提供前提条件。[方法]PCR扩增目的基因,构建重组质粒,经酶切鉴定,PCR和核酸序列分析后,IPTG诱导表达,Ni-柱纯化,注射新西兰白兔获得抗血清。[结果]扩增出ORF086基因,成功构建了重组质粒pET32a-ORF086,SDS-PAGE电泳和Western-blot分析显示,获得一条36.0 kD的融合蛋白。[结论]成功构建了原核表达载体,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经柱层析纯化蛋白,纯度达90%以上。     

石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白的表达及其生物学功能分析

【目的】明确石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus,SGIV）主要衣壳蛋白（Major capsid protein,MCP）的生物学功能,为阐明SGIV感染致病机理及研发抗病毒产品提供理论依据。【方法】使用实时荧光定量PCR检测SGIV感染过程中MCP基因的转录时序及其在SGIV感染石斑鱼脾脏、肝脏、肾脏、肠道、胃和鳃组织中的表达水平;将SGIV MCP基因分别克隆至真核表达载体pEGFP-N3和pcDNA3.1上,构建重组质粒pEGFP-N3-MCP和pcDNA3.1-MCP,然后以重组质粒pEGFP-N3-MCP转染石斑鱼脾细胞（Grouper spleen cell,GS）进行亚细胞定位分析,同时以重组质粒pcDNA3.1-MCP转染胖头鲤细胞（Fathead minnow cells,FHM）构建能稳定表达MCP蛋白的FHM细胞系（FHM-MCP）,用于分析MCP蛋白对宿主细胞生长增殖及SGIV感染压力下细胞存活率和病毒复制的影响。【结果】在SGIV感染8 h后即可检测到MCP基因的特异性转录,即MCP基因是一个晚期基因。在SGIV感染24 h后,MCP基因在石斑鱼脾脏中的相对表达量最高,其次是在肝脏、肾脏和肠道组织中,而在胃和鳃组织中的相对表达量较低,提示胃和鳃组织并非SGIV感染的主要靶器官。SGIV的MCP蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中。细胞生长增殖曲线和细胞计数结果均证实,MCP蛋白能调节细胞生长及促进细胞分裂增殖。在SGIV感染后24和48 h,FHM-MCP细胞的存活率均显著高于FHM-Vector细胞（真核表达载体pcDNA3.1转染FHM细胞）,其存活率分别是FHM-Vector细胞的1.12和1.15倍。此外,FHM-MCP细胞在SGIV感染24和48 h后,其病毒滴度均高于FHM-Vector细胞,即MCP蛋白能促进SGIV病毒复制。【结论】SGIV的MCP基因是一个晚期基因,其编码蛋白主要定位于细胞核附近的胞质中,通过促进宿主细胞分裂增殖及病毒复制,最终提高SGIV的病毒滴度和感染力。     

红鳍东方鲀去乙酰化酶SIRT3基因的克隆及原核表达

从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肝脏组织中提取总RNA,通过RT–PCR扩增,获得SIRT3基因的编码阅读框(ORF),用原核表达载体p ET32a(+)构建p ET32a/SIRT3重组质粒,用异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)将重组质粒p ET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示,红鳍东方鲀SIRT3基因(tr SIRT3)ORF区大小为1 263 bp大小,编码420个氨基酸。经IPTG诱导表达后,获得1个带组氨酸(His)标签的融合蛋白,目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了相对分子质量约66 000的重组蛋白。     

猪繁殖与呼吸综合征GP5蛋白和N蛋白在大肠杆菌中的优化表达和纯化

采用不同的培养基、诱导温度、诱导时间、IPTG诱导剂浓度以及诱导菌浓度等大肠杆菌表达条件,进行了融合蛋白HIS-GP5和HIS-N的优化表达和纯化研究.结果表明:重组质粒转化菌E.coli BL21(DE3)在含0.3 mmol/L IPTG的TB培养基中,20℃诱导表达14 h时融合蛋白表达量最高,经纯化得到了HIS-GP5和HIS-N融合蛋白.SDS-PAGE电泳分析表明,纯化的蛋白纯度大于95%.     

大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因设计引物,PCR扩增得到MCP基因编码框全长序列1 392 bp,将其克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-MCP,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,融合表达的重组蛋白分子量约为70 ku,与预期大小一致,主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度,诱导温度等诱导表达条件进行优化,确定0.5 mmol/L的IPTG于37℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化GSIVMCP重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了GSIV-MCP多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明,该多克隆抗体可与由GSIV感染引起细胞病变的EPC细胞(GICB)发生特异性的结合。研究为建立GSIV免疫诊断方法以及为研究GSIV MCP基因编码蛋白的功能奠定了前期基础。     

葡萄盆栽技术

葡萄盆栽技术,包括择土选种、露地扦插、田间管理、装盆及整形、肥水管理等内容,对葡萄盆栽爱好者有一定的指导意义。     

Yield and quality of maize stover: Variation among cultivars and effects of N fertilization

Biomass yields and concentrations of crude protein(CP), ether extract(EE), neutral detergent fiber(NDF), acid detergent fiber(ADF), and crude fiber(CF) were analyzed for five cultivars of summer-sown maize(Zea mays L.) stover grown in field trials at three rates of N fertilization, and sampled immediately after grain harvest.The results revealed differences in yields and concentrations of nutrients according to stalk height and hence harvest portion among the cultivars.N application greatly increased biomass yield and CP, especially in upper stalks and to a lesser extent, EE.Concentrations of NDF and ADF decreased as N rate increased.The results show that stovers from all local popular maize cultivars are suitable as animal fodder and that moderate N application improves feed quality of stover.     

民勤绿洲荒漠交错带三种沙丘类型的自然植被特征

基于对民勤沙井子地区植被调查数据,研究了固定沙丘、半固定沙丘和流动沙丘3种沙丘类型的自然植被特征.结果表明:从固定沙丘、半固定沙丘到流动沙丘,总盖度、灌木盖度下降,草本盖度增加.物种丰富度减小是物种多样性下降的主要原因.从植物的生活型来看,多年生草本和灌木类植物受沙丘类型的影响最大,而一年生草本和半灌木可存活于不同沙丘类型.白刺的生态优势度(重要值)由小到大依次为固定沙丘、半固定沙丘、流动沙丘.植物多样性与白刺的生态优势度呈负相关.不同沙丘类型白刺地上生物量变化明显,半固定沙丘白刺生物量最大.     

寄生虫引起的草鱼鳃病的组织病理比较研究

本文对草鱼的隐鞭虫病、车轮虫病、小瓜虫病、指环虫病、三代虫病及中华鱼蚤病六种寄生虫性鳃病的组织病理变化进行比较研究，寄生虫性鳃病均可引起鳃组织发生炎症反应，粘液分泌亢进，嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润；但又因病原体的种类不同，危害鱼的方式、方法不同，因此病理变化又有很大差别，对鱼危害较大的均为变质性炎，如隐鞭虫病；对鱼危害较小的则属增生性炎，如中华鱼蚤病．     

小菜蛾阿维菌素和虫酰肼抗性品系对几种新型药剂的交互抗性研究

以敏感品系为对照,利用室内筛选获得的虫酰肼和阿维菌素高抗品系Teb-R和Aba-R,测定了小菜蛾对几种新型杀虫剂的交互抗性。结果发现:小菜蛾对虫酰肼产生高水平抗性后(抗性倍数185.5倍),对阿维菌素表现出中等水平交互抗性(41.0倍),对茚虫威(11.4倍)和溴虫腈(5.3倍)仅表现出低水平交互抗性,对多杀菌素(1.7倍)和氯虫苯甲酰胺(1.4倍)则没有表现出明显的交互抗性。用阿维菌素筛选Teb-R品系39代后获得阿维菌素高抗品系Aba-R(593.8倍),该品系对茚虫威(12.3倍)表现出中等水平交互抗性,对多杀菌素(7.9倍)表现出低水平交互抗性,对溴虫腈(2.7倍)和氯虫苯甲酰胺(0.9倍)的交互抗性不明显;同时该品系对虫酰肼的抗性也由阿维菌素筛选前的185.5倍下降到筛选后的28.0倍,也没有交互抗性。基于上述研究结果认为,使用虫酰肼防治小菜蛾出现抗性后,可以使用多杀菌素和氯虫苯甲酰胺进行替代防治,但不宜用阿维菌素、茚虫威和溴虫腈进行替代防治;利用阿维菌素防治小菜蛾产生抗性后,可以用溴虫腈、氯虫苯甲酰胺和虫酰肼进行替代防治,但不宜用多杀菌素和茚虫威。     

Water quality,agriculture and food safety in China:Current situation,trends, interdependencies,and management

Water quality in China is becoming a severe challenge for agriculture and food safety,and it might also impact health of population via agriculture and food. Thus,it is causing widespread concern. Based on extensive literatures review and data mining,current situation of water pollution in China and its effects on food safety were analyzed. The 2nd National Water Resource Survey in China show that the surface water all over the country was under slight pollution and about 60% of groundwater is polluted. Drinking water quality is basically guaranteed in urban area but it is worrisome in rural areas. In addition,China is the largest consumer of fertilizer and pestici de in the world and the amounts of application still show increasing trends. Fertilizers and pesticides are the most important sources of pollution,which affect human health as persistent organic pollutants and environmental endocrine disruptors. Eutrophication of surface water and nitrate pollution of groundwater are serious threats to drinking water safety. Sewage irrigation is becoming a pollution source to China's water and land because of lacking of effective regulations. Although,with the advance in technology and management level,control of nitrogen and phosphorus emissions and reducing water pollution is still a major challenge for China.     

拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型分析

【目的】建立拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型,分析明确不同来源拟斯卑尔脱山羊草的FISH核型特点,比较不同拟斯卑尔脱山羊草及其与普通小麦的FISH核型差异。【方法】以荧光标记的寡核苷酸Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2为探针,利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术分析pTa535和pSc119.2在不同拟斯卑尔脱山羊草、四倍体小麦和普通小麦染色体上的杂交信号分布特点;以禾本科植物着丝粒专化寡核苷酸Oligo-CCS1为探针,明确拟斯卑尔脱山羊草的着丝粒位置,测量拟斯卑尔脱山羊草染色体相关参数;通过FISH核型比较明确不同拟斯卑尔脱山羊草及其与小麦核型的多态性差异。【结果】Oligo-pTa535主要分布在小麦的D和A组染色体上,在小麦的B组染色体上仅有零星分布,在5份拟斯卑尔脱山羊草的染色体中未显示Oligo-pTa535杂交信号。Oligo-pSc119.2杂交信号主要分布在小麦的B组染色体上,在小麦的A、D组染色体中分布较少,但在5份拟斯卑尔脱山羊草染色体上均有广泛分布。根据Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2杂交信号在小麦染色体上的分布特点,可以将小麦的不同染色体相互区分开来。Oligo-pSc119.2杂交信号在不同倍性、不同品种的小麦B组染色体上的分布特点基本相似,而不同来源拟斯卑尔脱山羊草的Oligo-pSc119.2的FISH核型差异较大,甚至在同一细胞内的2条同源染色体上Oligo-pSc119.2杂交信号的分布也具有明显差异。不同来源的拟斯卑尔脱山羊草与小麦B染色体组的FISH核型存在明显差异。PI542238的7对染色体均为中间着丝粒染色体,核型公式为2n=14=14m。其余4份拟斯卑尔脱山羊草的4S染色体均为近中着丝粒染色体,其余染色体均为中间着丝粒染色体,核型公式皆为2n=14=12m+2sm。【结论】拟斯卑尔脱山羊草染色体上含有丰富的与pSc119.2高度同源的重复序列,不含有与pTa535高度同源的重复序列。不同来源的拟斯卑尔脱山羊草之间以及同一来源的拟斯卑尔脱山羊草的个体间甚至同一个体内的同源染色体间在pSc119.2的分布上均具有遗传多样性。以Oligo-pSc119.2为探针建立的拟斯卑尔脱山羊草染色体FISH核型与小麦B组染色体的核型具有显著差异。利用荧光标记的Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2为探针进行FISH分析,可以准确区分拟斯卑尔脱山羊草的不同染色体,并能将拟斯卑尔脱山羊草与小麦的染色体区分开来。     

断根与打顶对番茄嫁接愈合的抑制作用

【目的】断根嫁接苗和打顶双干或多干嫁接苗日益广泛用于番茄栽培,丰产作用显著。了解断根与打顶对番茄嫁接愈合的作用机制,可为番茄嫁接生产提供理论依据。【方法】以‘硬粉8号’为接穗品种,‘砧爱1号’为砧木品种,观测断根和打顶后番茄嫁接愈合进程、成活率和木质部连通性等,同时测定嫁接接合部生长素和细胞分裂素的含量及愈合相关基因的表达。【结果】断根和打顶抑制了嫁接接合部上方木质部分化基因VND7的表达,并显著延迟了木质部的重构。断根显著降低了嫁接后12和72 h接合部玉米素核苷（tZR）和反式玉米素（tZ）的含量,以及嫁接后12 h接合部吲哚-3-乙酸（IAA）,吲哚-3-乙酸甲酯（ME-IAA）和吲哚-3-甲醛（ICAld）的含量;打顶嫁接后12 h接合部IAA和ME-IAA含量显著低于对照和断根处理,下调了嫁接后3和12 h接合部上方和下方韧皮部分化相关基因NEN4表达水平。断根或打顶均下调了嫁接后3—48 h接合部上方细胞分裂相关基因Histone H4和SlcycB1-4的表达水平;断根和打顶同时处理使嫁接接合部IAA和ME-IAA含量显著低于断根处理,使tZR和tZ的含量及木质部连通性显著低于打顶处理。打顶和断根后分别在嫁接接合部施用10 mmol∙L^-1 IAA和10 mmol∙L^-1 6-BA可显著促进嫁接苗木质部的重构。【结论】断根和打顶分别降低接合部细胞分裂素和生长素积累,下调愈合相关基因表达,降低木质部输导能力,进而延缓番茄嫁接愈合进程。     

芦荟多糖抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用试验

在安全浓度的基础上,将芦荟多糖稀释成不同浓度,作用于猪繁殖与呼吸综合征病毒,当病毒对照CPE达到70%～80%后,在酶联免疫检测仪上测定A490nm值,A490nm值越大,表明细胞生长越旺盛,抗感染效果越好。在先加芦荟多糖后接种病毒时,多糖对PRRSV感染有阻断作用,且作用显著;在加芦荟多糖之前先接种病毒,则芦荟多糖对PRRSV的抑制作用不明显;高浓度芦荟多糖对PRRSV具有直接杀灭作用。