本氏烟抗细胞凋亡基因NbDAD1克隆及遗传转化研究(英文)

[目的]克隆本氏烟的抗细胞凋亡基因 NbDAD1,并对该基因进行遗传转化研究。[方法]通过 RT-PCR 技术分离本氏烟 NbDAD1 基因,构建基因超表达载体,以获得转入NbDAD1基因和携带HAtag标签的NbDAD1基因抗性植株。[结果]试验克隆出了全长351 bp的本氏烟NbDAD1基因;成功构建了重组质粒pCAMBIA1301-NbDAD1和pCAMBIA1301-NbDAD1HAtag;共获得3个基因型50株T0代抗Hyg本氏烟植株,其中23株检测 PCR 呈阳性。[结论]该试验为研究 NbDAD1 基因在本氏烟中的具体功能及深入探讨 DAD1 蛋白在植物细胞程序性死亡中可能的作用机制奠定了基础。     

Cloning and Geneic Transformation of Nbdadl Gene from Nicotiana benthamiana

[目的]克隆本氏烟的抗细胞凋亡基因NbDAD1,并对该基因进行遗传转化研究.[方法]通过RT-PCR技术分离本氏烟NbDAD1基因,构建基因超表达载体,以获得转入NbDAD1基因和携带HAtag标签的NbDAD1基因抗性植株.[结果]试验克隆出了全长351 bp的本氏烟NbDAD1基因;成功构建了重组质粒pCAMBIAI301 - NbDAD1和pCAMBIA1301 - NbDAD1 HAtag;共获得3个基因型50株T0抗Hyg本氏烟植株,其中23株检测PCR呈阳性.[结论]该试验为研究NbDAD1基因在本氏烟中的具体功能及深入探讨DAD1蛋白在植物细胞程序性死亡中可能的作用机制奠定了基础.     

苦豆子凝集素基因植物表达载体的构建及其对烟草的转化

[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株.[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL.采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定.[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株.[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础.     

棉花热激转录因子GhHsf基因的表达及其烟草转化

[目的]了解棉花GhHsf基因的功能,分析该基因的表达模式,构建其植物表达载体并转化烟草获得转基因植株.[方法]利用半定量RT-PCR对棉花热激转录因子基因GhHsf的表达模式进行分析.构建pCAMBIA1301-GhHsf植物表达载体,采用农杆菌介导法转化烟草,并进行鉴定.[结果]棉花GhHsf基因在棉花各组织中为组成型表达;构建GhHsf基因植物表达载体pCAMBIA1301-GhHsf,转化烟草获得了转基因植株.[结论l棉花Gf基因在棉花的不同组织中是组成型表达,获得了转GhHsf基因烟草株,为进一步开展功能研究奠定基础.     

番茄LeCBL4功能的初步研究

[目的]对番茄LeCBL4基因的功能进行初步研究。[方法]构建番茄LeCBL4超表达载体,并转化本氏烟,对获得的植株进行PCR检测、潮霉素抗性检测与半定量分析。[结果]试验共获得30株转基因植株;半定量分析发现,在超表达植株中LeCBL4表达量明显高于野生型。[结论]试验真正获得了LeCBL4超表达烟草,为进一步研究LeCBL4的功能奠定了基础。     

抗稻瘟病基因Pib4的转基因研究

[目的]探讨抗稻瘟病基因Pib4的转基因。[方法]利用PCR法克隆Pib基因的NBS功能结构域到双元载体pCAMBIA1301上,以粳稻品种农大18的成熟胚诱导出愈伤组织,以愈伤组织作为转化的受体,采用农杆菌介导法转化Pib4基因。[结果]经PCR和GUS活性检测表明外源基因已整合到水稻基因组中并获得表达;用稻瘟病菌接种阳性植株,获得了抗稻瘟病菌的水稻植株。[结论]为合理利用抗病基因和育种提供了参考。     

大豆RACK1基因RNAi载体构建及植株转化

[目的]筛选大豆RACK1基因的RNAi突变体,为研究RACK1基因在大豆生长发育过程的调控作用提供依据.[方法]采用RT-PCR克隆大豆叶片RACK1基因核心保守序列片段,以植物表达载体pCAMBIA 1301为基本载体,构建抑制大豆RACK基因表达的RNAi载体.通过农杆菌介导转入大豆子叶节,经潮霉素筛选转基因植株,利用PCR、Southern blot及RT-qPCR进行转基因植株检测.[结果]克隆获得大豆RACK1基因核心保守序列片段432 bp;将该基因片段连接到pCAMBIA1301表达载体内含子两侧,通过酶切分析,RNAi载体构建正确.通过农杆菌介导,将该载体转入大豆中黄13号,获得23个转基因大豆株系;经PCR和Southern blot检测,确定大豆RACK1基因RNAi片段已融合到大豆基因组中.经定量RT-qPCR分析,不同转基因大豆株系RACK1基因mRNA的表达量具有明显差异,其在株系5的表达量最高,为对照的68.5%;株系7最低,降至对照的19.9%.[结论]成功构建了大豆RACK1 RNAi表达载体并导入大豆基因组中,获得23个农杆菌介导的RACK1 RNA干扰表达的大豆转基因植株,为研究RACK1基因在大豆生长发育过程中的功能和作用奠定了基础.     

双价抗虫转基因水稻的育成及初步鉴定

[目的]构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻,为选育广谱、高抗转基因抗虫水稻提供技术参考.[方法]构建半夏凝集素基因(pta)和苏云金杆芽孢菌基因(Bf)两个抗虫基因的双价表达载体pCAMBIA 1301-Bt-pta,利用大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌LBA4404转化水稻恢复系辐恢838,同时对转化植株进行GUS染色及PCR鉴定.[结果]以构建的双价植物表达载体pCAMBIA 1301-Bt-pta为模板,PCR扩增到pta基因的部分片段,大小为807 bp,且该载体经Hind Ⅲ酶切后,能得到15854 bp的中间载体pCAMBIA 1301-Bt片段和2046 bp的pta基因片段.对转化植株进行GUS染色,得到3株转基因阳性植株,经PCR鉴定结果显示外源基因已成功导入水稻.[结论]通过构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻,成功获得的转基因植株可用于水稻抗虫转基因恢复系及组合的研究,以提高其抗病虫害能力.     

水稻RACK1基因过表达载体的构建与转化

利用过表达基因技术将从水稻中分离克隆的RACK1基因定向克隆至植物中间表达载体pCAMBIA1301中,构建了RACK1过表达融合基因植物表达载体pCAMBIA1301/R,通过根癌农杆菌EHA105将其导入水稻基因组。对获得的抗性植株的报告基因、基因组PCR及Southern Blotting进行检测分析。结果表明,该过表达基因已整合到水稻基因组中。     

拟南芥CBF3基因克隆和植物表达载体的构建

[目的]克隆拟南芥CBF3基因并构建植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3。[方法]从模式植物拟南芥中克隆分离出转录因子CBF3与逆境诱导型启动子Rd29A的DNA序列,构建植物表达载体。[结果]克隆得到的CBF3与GenBank数据库所公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为750bp;克隆克隆得到的Rd29A与GenBank数据库公布序列比对发现,同源性达到100%,全长为1425bp。[结论]以双元载体pCAMBIA1301为基础,植物表达载体pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3被成功构建,对提高植物耐盐、耐旱和耐寒性有很大帮助。     

马铃薯X病毒复制酶基因载体的构建及在烟草中的转化

[目的]构建马铃薯X病毒复制酶基因（RdRp）的载体,并将其在烟草中转化。[方法]将RdRp基因分为3个片段,分别连入表达载体中,其中基因5＇端和3＇端序列通过PCR方法获得,中间序列通过酶切从病毒载体pGR107上获得。最后将构建成功的载体转入烟草中进行表达。[结果]表达载体pK1390＋RdRp被成功构建;获得PCR初步鉴定为转基因的植株50多棵。[结论]为研究植物病毒机制提供了依据,也为利用杂交手段得到外源蛋白高效表达的双转基因植物奠定了基础。     

抗水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的双价RNA沉默载体的构建

为利用RNAi技术获取抗水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)植株,分别针对两种病毒的S6和S10基因构建RNA沉默载体。采用重组PCR方法将RBSDV S6基因片段(R6)和SRBSDVS6基因片段(SR6)进行融合,获得600 bp的R6-SR6融合基因;将RBSDV S10基因片段(R10)和SRBSDV S10基因片段(SR10)进行融合,获得600 bp的R10-SR10融合基因。融合基因以反向重复的方式连入pBS载体,并定向插入到pCAMBIA1301载体上,获取了含有发夹结构的植物表达载体pCAMBIA1301-hp(R6-SR6)和pCAMBIA1301-hp(R10-SR10)。抗RBSDV和SRBSDV RNA沉默载体的构建为利用RNA沉默进行植物抗病毒研究奠定了基础。     

水稻线粒体基因atp6超表达载体的构建及遗传转化

[目的]克隆水稻线粒体基因atp6,构建转基因表达载体,获得35S∷Rf1b5'∷atp6转基因水稻植株。[方法]设计目的基因的特异引物,采用TRIzol法提取水稻叶片总RNA,借助Toyobo反转录试剂盒反转录为cDNA,通过PCR扩增得到atp6全序列;将atp6连接到含线粒体信号肽(Rf1b5')的pCAMBIA1302双元表达载体上,采用农杆菌介导的愈伤组织侵染法进行水稻的遗传转化。[结果]利用目的基因atp6成功构建了35S∷Rf1b5'∷atp6植物表达载体,并获得了转atp6基因的阳性植株。[结论]为探讨水稻中超表达atp6对水稻生长的影响奠定基础。     

Transgenic Rape with hrf2 Gene Encoding HarpinXooc Resistant to Sclerotinia sclerotinorium

The objective of this study was to increase the resistance of rape using the method of transformation. The gene hrf2 derived from Xathomonas oryzae pv. oryzicola encoding harpinxooc protein was constructed into transgenic vector pCAMBIA1301. The cotyledonal petiole segments from rapeseed variety Yangyou 4 were infected by Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404/pCAMBIA1301-hrf2. Hygromycin-resistant green shoots were obtained. Successful integration of the foreign gene into the genome of the rapeseed variety Yangyou 4 was confirmed by PCR, RT-PCR, and β-glucuronidase analyses. Disease bioassays of transgenic plants revealed an improved resistance of transgenic plants to Rape sclerotiniose. In brief, the hrf2 gene can be transferred into rape using the method of Agrobacterium-mediated transformation, which increased the resistance to Sclerotinia sclerotinorium in the transgenic plant.     

转harpinXooc蛋白编码基因hrf2对油菜抗菌核病的影响

【目的】尝试利用转基因方法提高油菜抗病性。【方法】将来自水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola）编码harpinXooc蛋白的hrf2基因插入植物表达载体pCAMBIA1301中,构建了植物重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2。由根癌农杆菌LBA4404介导,将重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2转化甘蓝型油菜杨油4号子叶节。【结果】获得了抗潮霉素的再生转基因油菜植株,经PCR,RT-PCR和GUS染色检测证明hrf2基因已整合到油菜基因组中。抗病性鉴定结果表明,转基因油菜对油菜菌核病有较好的抗性,在转基因植株叶片上油菜菌核病菌菌丝的生长受到明显抑制。【结论】利用农杆菌转化法可将hrf2基因导入油菜基因组中,并使转基因油菜对菌核病的抗性提高。     

受MeJA诱导的烟草GTs基因启动子的克隆及转化

利用已克隆的1个受甲基茉莉酸(MeJA)诱导的糖基转移酶(GTs)基因,以PCR扩增得到该基因启动子序列,长度约为1.4kb,用改造后的双元载体pCAMBIA1301与GTs基因启动子连接,构建了含目的启动子与GUS基因的融合基因质粒pCAP-GUS.通过根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草W38,经PCR检测验证得到了含有融合基因的转基因烟草植株,为进一步研究GTs基因的功能奠定了基础.