无血清微载体培养Vero细胞增殖传染性法氏囊病毒

为了获得用生物反应器无血清培养基微载体悬浮培养Vero细胞增殖传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的工艺参数,通过驯化Vero细胞适应无血清微载体悬浮培养后,再优化传染性法氏囊病毒在此细胞上的增殖工艺参数,包括初始细胞密度、微载体浓度、IBDV的感染复数(MOI)、接种时间和病毒收获时间。结果表明:获得适应无血清培养的细胞株——V0株,建立细胞库。获得3 L反应器中培养V0细胞增殖IBDV工艺参数,其初始接种密度为3×105cell/m L、微载体浓度为3 g/L、细胞培养1 d后按MOI为0.2接种IBDV,接毒后120 h收获病毒,可达最高病毒效价109.307TCID50/m L。本研究获得的Vero细胞、IBDV以及各项工艺参数为后续大规模悬浮培养制备法氏囊疫苗提供了生物材料和技术支持。     

利用生物反应器和Vero细胞培养鸡传染性法氏囊病病毒的研究

 通过对血清、pH、接毒量和收毒时间等培养条件的优化 ,确定鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV)在Vero细胞上增殖的最佳培养条件为 :血清 2 %,pH 7.0 ,接毒量 5∶10 0 0 0 ,收毒时间为接毒后培养 10 8h。 2 5 0ml自制搅拌瓶和 5L搅拌式生物反应器研究结果表明 ,在 2g/L微载体的Vero细胞悬浮培养系统中 ,待细胞刚长满微载体时 ,按照确定的IBDV最佳增殖条件换液培养 ,病毒可在较长一段时间维持高的病毒滴度 ,最高滴度分别可达 8.875和8.5 8(-lgTCID50 ) ,比传统转瓶生产方法至少提高 1个毒价 ,可用于IBDV规模化生产。     

PK-15细胞在微载体悬浮放大培养及PCV2增殖工艺研究

为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术。采用分批式培养方法,研究了PK-15细胞在微载体胰酶消化放大悬浮培养及猪圆环病毒2型(PCV2)增殖工艺。结果表明,5 g/L的微载体和高糖DMEM下,采用4.0×105cells/m L的初始接种密度及培养至第2天进行换液操作工艺可以获得最佳的PK-15细胞生长效能。胰酶消化转移将PK-15细胞从1 L反应器放大至3 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,培养3 d细胞密度可达34.3×105cells/m L。采用感染复数为0.1的接毒比例,细胞接毒后在微载体上传至第3代收获毒液可获得最高的PCV2增殖效价107.25TCID50/m L。为PCV2疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

用微载体系统培养PK15细胞生产猪圆环病毒2型

研究了生物反应器、转瓶、方瓶3种不同培养系统生产PCV2,对转瓶不同参数下的病毒效价情况进行了比较和优化,最终确定培养参数为:以1∶10稀释种毒后接种、接种24 h的PK15细胞、5～7 mg/mL微载体浓度和维持液低糖DMEM+2 g/L水解乳蛋白(LH)的培养方式效果最为理想;采用微载体和反应器系统生产PCV2,病毒效价可达105.0 TCID50/mL以上.     

大鲵虹彩病毒转瓶规模化培养条件研究

研究了利用2.0 L转瓶进行大鲵虹彩病毒规模化培养的最佳工艺条件。结果显示,培养液稀释体积为150m L时,1×106个/m L的初始接种细胞密度可使大鲵虹彩病毒滴度达到最高;培养液稀释体积和接种细胞密度存在一定相关性,在不影响病毒滴度的情况下,可以在细胞密度为5×105个/m L时加入300 m L的培养(维持)液以尽可能多的收获病毒。在1∶20和1∶40的病毒接种剂量下,病毒均可大量增殖,滴度最高为104.35TCID50/0.1 m L;接毒方法简化步骤对病毒在转瓶中的增殖无明显影响。在转瓶中EPC细胞接种病毒的增殖动态曲线显示,接种病毒8 h后,病毒滴度开始上升并进入对数生长期,24 h后病毒增值速度趋缓,72 h病毒滴度达到最大。本研究为大鲵虹彩病毒的规模化培养和细胞培养疫苗的规模化制备技术奠定了基础。     

机械搅拌式生物反应器悬浮培养293T细胞生产慢病毒的工艺

采用L型大泡通气系统机械搅拌式生物反应器培养293T悬浮细胞和规模化生产慢病毒载体,通过4种方法驯化293T悬浮细胞,对其慢病毒包装能力进行验证,并建立种子扩增链,在5.5 L工作体积生物反应器中绘制悬浮细胞生长曲线和包装慢病毒。结果表明,采用体积分数50%的293 CD05 Medium无血清基础培养基和体积分数50%的SMM293-TⅡ培养基可以快速驯化293T细胞,成功得到野生型且具有慢病毒包装能力的悬浮细胞系。悬浮细胞在机械搅拌式生物反应器培养,2 d细胞密度可达1.5×10~6个·mL~(-1)。添加质粒复合物和补料培养基,培养4 d可以收获6.5×10~7 TU·mL~(-1)滴度的慢病毒粗产品,相比细胞工厂的滴度提高34倍。     

Marc-145细胞微载体模化培养PRRSV

为确定甲型流感病毒在贴壁MDCK细胞上最佳增殖条件。将PRRSV在微载体悬浮培养的Marc-145细胞上增殖,以半数细胞感染剂量为检测指标,对病毒维持液中血清浓度、接毒时间、感染复数(MOI)和收毒时间进行优化。结果表明,细胞培养后72 h接种病毒,病毒维持液中血清含量为2%,病毒感染复数为0.05,病毒感染48 h后PRRSV效价较高达到10~(6.6)TCID_(50)·mL~(-1),确定了PRRSV在微载体悬浮培养的Marc-145细胞上的增殖条件。     

Marc-145细胞微载体悬浮培养及PRRSV增殖工艺的建立

采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的PRRSV增殖效价。在5 L反应器中重复验证上述工艺,获得较为稳定的试验结果,最大细胞密度均可高于1 ml 2×106个细胞,PRRSV的增殖效价均高于108.0TCID50/ml。为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

藻-菌系统中微藻生长条件的响应面法优化

人工构建藻-菌系统,探讨培养系统密闭情况及搅拌速率、藻-菌初始接种比例和废水有机负荷对系统中微藻生长的影响。在单因素试验结果的基础上,利用响应面法对搅拌速率、藻-菌初始接种比例和废水有机负荷3个因素进行优化。结果表明,培养系统密闭情况及搅拌速率、藻-菌初始接种比例和废水有机负荷均显著影响系统中微藻的生长,其中培养系统敞开更有利于微藻的生长。经响应面优化的最佳培养条件为:搅拌速率1 574.29 r/min,菌-藻接种比例150∶1,有机负荷(以化学需氧量计)3 676.02 mg/L。在此条件下培养7 d后,微藻的生物量为5.68 g/L,与理论预测值(5.69 g/L)基本吻合。本研究结果可为提高藻-菌系统对废水的资源化利用效率提供科学依据。     

鸡肺泡上皮Ⅱ型细胞的培养与鉴定

为研究禽流感等敏感病毒及其他致病因子对肺泡上皮Ⅱ型细胞(AEC-Ⅱ)的致病性,建立了鸡AEC-Ⅱ细胞体外培养方法.采用胰蛋白酶和Ⅳ型胶原酶联合消化法时 18 日龄鸡胚肺组织进行消化,经差速离心和免疫黏附,获得了鸡 AEC-Ⅱ细胞,再经纯化、体外培养和碱性磷酸酶染色法鉴定.结果表明,鸡AEC-Ⅱ细胞在接种后18 h开始贴壁进入适应期,细胞为圆形,呈岛屿状生长;接种后 24～72 h,进入对教生长期,细胞为多边形,并融合成单层,胞浆内有明显的颗粒;接种后第 4 天细胞数量达到高峰(1.38 × 105个/mL),并进入稳定生长期,胞浆内颗粒开始减少;接种后6～7 d,细胞进入衰退期,胞浆内颗粒显著减少,细胞逐渐死亡、脱落.另外,4代(F4)之前的AEC-Ⅱ传代细胞贴壁时间早,形态均一,纯度高.说明接种后24～72 h内获得的AEC-Ⅱ原代细胞和F4之前的传代细胞可以供体外试验研究.     

负压式光生物反应器对微藻的培养效果

采用一种新型负压式光生物反应器对常用饵料微藻威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)的培养效果进行研究,分析培养过程中藻密度、异养菌与弧菌(Vibrios)数量及氨氮与亚硝酸氮质量浓度变化及相互关系。结果表明:在负压光生物反应器培养下威氏海链藻的生长速度快,培养第4天达到平台期,藻密度最大值可达到1.5×10~6个/mL,最大比生长率可达1.37;弧菌与异养菌数量两者变化趋势相同,分别为(0.19～2.70)×10~4 cfu/mL和(0.071～0.93)×10~6 cfu/mL,藻与细菌表现出相互竞争抑制的效果,在指数增长期藻对细菌抑制较强,特别是对弧菌的抑制,在平台期与衰败期藻对弧菌与异养菌的抑制作用逐渐减弱。藻液中氨氮与亚硝酸氮质量浓度随藻密度增加而上升,最高值分别达到0.24 mg/L和0.37 mg/L,指数增长期藻密度与氨氮和亚硝酸氮质量浓度呈显著正相关(P0.05)。因此,采用负压式光生物反应器培养威氏海链藻,可以大大缩短培养周期,抑制细菌生长,提高培养效率和藻液质量,但需要在投喂幼体前对藻液进行充分曝气来降低氨氮与亚硝酸氮质量浓度。该反应器是一种适合饵料微藻培养的系统。研究结果为负压光生物反应器作为微藻生物饵料培养系统的应用提供了参考依据。     

船舶压载舱黑暗条件对青岛大扁藻种群的生态影响

为阐明船舶压载舱的黑暗密闭环境对绿藻生长的影响,以青岛大扁藻为模式生物,设置不同的初始密度(5 cells/m L、50 cells/m L、5×10~2cells/m L、5×10~3cells/m L和5×104~cells/m L),研究青岛大扁藻在黑暗条件下的相对生长抑制率及在不同生长期和初始密度处理下的种群响应。并对黑暗处理后的青岛大扁藻进行光照恢复研究,探索在不同的起始密度下,未经黑暗与经黑暗处理后的扁藻种群密度变化的差异。结果表明,经过黑暗处理的低密度(3 cells/m L)的青岛大扁藻在光恢复两周后仍然可以达到较高的种群密度水平(1×10~3);经黑暗处理的青岛大扁藻在光恢复初始密度为3及3×10~4cells/m L时的种群恢复能力较未经黑暗处理的弱,且存在显著差异(P0.05)。     

Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF6多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备Ⅱ型鲤疱疹病毒（CyHV-2）ORF6多克隆抗体,为深入探究ORF6在CyHV-2急性感染或潜伏感染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】利用MEGA 6.0、Adobe Illustrator CS6及BepiPred-2.0等在线软件分析CyHV-2的ORF6基因序列信息,采用PCR从CyHV-2基因组中扩增ORF6基因片段,将其连接至原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导和尿素洗涤纯化获得融合蛋白。以纯化的融合蛋白ORF6免疫健康Babl/c小鼠制备ORF6多克隆抗体,并通过Western blotting和间接免疫荧光技术鉴定ORF6多克隆抗体的特异性。【结果】CyHV-2的ORF6基因全长3003 bp,与CyHV-3和CyHV-1的ORF6氨基酸序列相似性均高于30.00%,其中与CyHV-3的相似性高达39.36%;其抗原表位最可能存在于第1~300位氨基酸序列中。将PCR扩增获得的ORF6基因片段连接至原核表达载体pET-28a可成功构建重组质粒pET-28a-ORF6,转化BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导4 h即获得融合蛋白ORF6;原核表达的融合蛋白ORF6主要以包涵体形式进行表达,其分子量为17.13 kD,经6 mol/L尿素洗涤纯化后的浓度为0.1 mg/mL。以纯化融合蛋白ORF6免疫Babl/c小鼠制备获得的ORF6多克隆抗体能特异性识别融合蛋白ORF6及CyHV-2感染的异育银鲫尾鳍细胞（GiCF）;利用制备的ORF6多克隆抗体对CyHV-2感染GiCF细胞进行间接免疫荧光分析,结果在CyHV-2感染GiCF细胞周围能观察到特异性绿色荧光,而在未感染CyHV-2的GiCF细胞周围未观察到特异性绿色荧光,进一步说明ORF6多克隆抗体可特异性识别CyHV-2。【结论】制备获得的ORF6多克隆抗体能与CyHV-2感染GiCF细胞发生特异性免疫反应,即可用于鉴定CyHV-2感染,为探究ORF6蛋白功能是否与CyHV-2潜伏感染相关打下了基础。     

防治蓟马的球孢白僵菌SDDZ-9菌株液体发酵工艺优化

【目的】球孢白僵菌(Beauveria bassiana)作为一种重要的虫生真菌,已广泛应用于害虫生物防治,但其不成熟的规模化生产技术一直是限制球孢白僵菌广泛应用的主要问题之一。开展球孢白僵菌液体发酵工艺研究,提高液体发酵生物量,从而为固体发酵阶段提供优质的种子液,进而提高固体发酵的产孢量,为球孢白僵菌规模化生产提供参考。【方法】影响球孢白僵菌液体发酵的培养条件有温度、装样量、摇床转速、接种浓度和pH等,首先采用Plackett-Burman试验设计,筛选出影响球孢白僵菌菌株SDDZ-9的液体发酵的主要因子,然后运用最陡爬坡路径法,以试验值变化的梯度方向和各因素效应值的大小分别确定爬坡方向和变化步长,确定响应面的中心点,逼近最佳值区域,最后采用central composite design (CCD)响应曲面法,建立多元二次回归方程来拟合各因素与效应值之间的关系,并对影响发酵生物量的各因素及其交互作用进行响应面分析和评价,确定对西花蓟马(Frankliniella occidentalis)毒力较高的球孢白僵菌菌株SDDZ-9液体发酵的最优培养条件。【结果】培养温度、装样量、转速和浓度是影响发酵生物量的主要因子,一定范围内的pH变化对此菌株的液体发酵影响较小。在自然pH下,当培养温度27.08℃、装样49.72 mL（250 mL三角瓶）、摇床转速205.45 r/min、接种浓度1.122×10⁷孢子/mL时,发酵48 h产生的生物量最大。在优化发酵条件下进行液固双相发酵试验,得到的球孢白僵菌液体发酵生物量为14.769 g·L^-1,与模型预测生物量相符,固体发酵后产孢量为20.16 g·kg^-1,含孢量1.84×10¹¹孢子/g。【结论】在优化发酵工艺条件下进行发酵,可显著提高球孢白僵菌的产孢量,此液体发酵工艺为球孢白僵菌的规模化生产奠定了基础。     

富硒酵母培养条件的优化

对1株经过DES(硫酸二乙酯)、紫外线和氯化锂复合诱变后的产朊假丝酵母进行富硒发酵条件的研究,通过单因素及正交试验,确定葡萄糖为培养基的最佳碳源,添加4%～5%时可得到最高生物量与硒含量;蛋白胨和尿素的复合氮源为最佳氮源.分别添加蛋白胨0.5%,尿素0.9%,辅助氮源酵母膏0.4%,硒 25 μg /mL,摇瓶(250 mL)装液量30 mL,转速200 r/min,培养温度 28 ℃,pH 5～6,培养时间40 h,此条件下酵母生物量达到7.942 g/L,总硒含量达到16 486.48 μg /L.     

副溶血性弧菌磁性试纸条层析体系的优化

为能够快速检测水产品中副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus),本研究首先制备了副溶血性弧菌多克隆抗体,然后将其标记在磁珠上形成特异性磁纳米探针,再分别以副溶血性弧菌多克隆抗体和山羊抗兔Ig G作为检测线T线和质控线C线,建立了双抗夹心模式的磁性免疫层析试纸条。利用正交试验设计的方法,从Tween-20、BSA、蔗糖3种因素对层析体进行优化分析,结果表明这3个因素对层析检测的影响效果为Tween-20BSA蔗糖;当Tween-20含量为5%(V/V),BSA浓度为0.2 mg/m L,蔗糖浓度为0 mg/m L时,阳性信号最强,检测的准确性和灵敏度达到最优,通过单纯的肉眼观察,可在5~10 min实现1.6×104CFU/m L副溶血性弧菌的检测,通过T线所捕获磁信号的定量检测,可在30~40 min内实现4.1×103CFU/m L副溶血性弧菌的检测,为今后食源性致病菌的快速鉴定、诊断和检测提供了一种新途径。     

Development of a sandwich Dot-ELISA for detecting bovine viral diarrhea virus antigen with E2 recombinant protein

The IgG antibodies of rabbit anti-E2 protein of the bovine viral diarrhea virus were prepared by a general method from high efficiency serum immunized by E2 recombinant protein antigen expressed in E. coli prokaryotic expression system and were labeled to make enzyme-labeled antibody with the method of NaIO₄. A sandwich Dot enzyme-linked immunosorbent assay (Dot-ELISA) for the detection of BVDV was developed. The optimal reaction conditions of Dot-ELISA were determined. The results show that optimal coating antibody was 300 μg·mL⁻¹, the working concentration of HRP-labeled antibody was 1:50. The optimal blocking reagent and time were 5% bovine serum and 45 min. The minimum detection of the content of antigen reached 1.35 μg·mL⁻¹. Compared with the routine IDEXX ELISA test kit with the whole virus, its specificity, sensitivity and coincidence rate were 90.48%, 96.55% and 95.24%, respectively. Compared with the sandwich Dot-ELISA with the negative staining electron microscope and RT-PCR, the coincidence rates were 90.9% and 93.1%, respectively. In addition, Bovine viral diarrhea virus (BVDV) antigen of 178 samples collected from cow farms in the Hebei Province, China, were detected by the developed Dot-ELISA and the IDEXX BVDV antigen Test Kit simultaneously, BVDV antigen positive rate was 39.89%–41.01%. The result of detecting clinical samples demonstrated that the established method showed its specificity, sensitivity and repeatability, whereas the results were easily interpreted without an ELISA reader.     

铜暴露对草鱼幼鱼代谢行为的影响

为了探讨水体中铜污染对鱼的生态毒理效应和游泳能力的影响,在实验室条件下,测定了铜暴露草鱼(Ctenopharyngodon idella)幼鱼半致死浓度、不同浓度铜暴露(0、0.025、0.050、0.075、0.10 mg·L~(-1))96 h后组织(肝、鳃、肌肉)铜累积量、相对临界游泳速度(U_(crit))以及耗氧率(MO_2)。结果表明:与对照组比较,铜暴露对组织(肝、鳃、肌肉)铜累积量无显著影响(P0.05),铜对草鱼幼鱼的安全浓度为0.008 mg·L~(-1)。铜暴露草鱼幼鱼相对临界游泳速度受抑制显著(P0.05),不同浓度暴露后U_(crit)分别较对照组下降了18.4%、21.8%、33.8%和38.1%。随着游泳速度的增加,其速度-代谢率关系为MO_2=a+b×U~c,随着暴露浓度增加,速度参数c值增加,不同浓度铜暴露后c分别比对照组增加了37.78%、33.33%、56.67%和61.11%,表明游泳能量利用率下降。铜暴露导致草鱼幼鱼有氧代谢范围增加,0.1 mg Cu·L~(-1)时有氧代谢范围比对照组增加了37.48%。铜暴露对草鱼幼鱼的游泳能力以及氧代谢行为产生影响,尤其是导致游泳效率降低、抑制游泳能力。     

Research Progress on the Large-scale Culture Technology of Mammalian Cells

The culture of mammalian cells is closely related to the development of biotechnology, which has been used extensively in the research and application fields of biology and medical science. In this article, various factors affecting cell cultivation and the application of microcarrier and bioreactor on large-scale culture of mammalian ceils were reviewed.     

肉品发酵剂松鼠葡萄球菌SL4冻干菌粉的制备

为提高葡萄球菌冻干菌粉的活菌数,制备高活性肉用葡萄球菌发酵剂。以前期研究获得的1株优良肉用发酵剂菌株松鼠葡萄球菌SL4为研究对象,对其菌体收集条件、冷冻干燥保护剂及初始菌悬液活菌数进行优化。结果表明:松鼠葡萄球菌SL4最适离心收集条件为离心转速6 000r/min,离心时间10min;冷冻干燥保护剂配方为脱脂奶粉100g/L,甘油23.56mL/L,甘露醇50g/L,海藻糖51.68g/L;初始菌悬液活菌数为109 CFU/mL。经以上条件优化后松鼠葡萄球菌SL4冻干存活率可达95%。