冷藏原料乳中荧光假单胞菌的分离鉴定及其产蛋白酶特性研究

【目的】对冷藏原料乳中易污染的嗜冷菌进行分离筛选,为提高乳品品质、控制乳品质量提供参考。【方法】从冷藏原料乳中筛选出1株嗜冷菌,通过形态学观察、生理生化试验、16SrDNA分子生物学分析,对该株嗜冷菌进行鉴定;并采用福林-酚试剂法、蛋白酶定性检测试验、耐热性试验以及牛奶酸度、黏度影响等试验,对其产酶特性进行研究。【结果】从冷藏原料乳中分离出的该株嗜冷菌为革兰氏阴性短杆菌,与GenBank中登录的荧光假单胞菌的生理生化特征相符,二者同源性为92.5%~97.6%。对该菌产胞外酶能力的研究发现,该菌所产胞外酶为一种耐热碱性蛋白酶,最适温度为30℃,最适pH为8.0,可引起牛乳黏度增大、凝集和乳清析出。【结论】从冷藏原料乳中分离出了嗜冷荧光假单胞菌,该菌所产胞外碱性蛋白酶会引起牛乳黏度增加、凝集和乳清析出,明显缩短乳品的保质期。     

鹿茸胶原多肽复合酶水解工艺研究

【目的】对鹿茸胶原多肽进行复合酶水解,优化水解工艺,并测定水解液分子量分布。【方法】以碱性蛋白酶和胰蛋白酶为供试酶类,选用酶解时间、pH值、酶解温度、加酶量为影响因素,采用响应面试验设计优化单酶水解条件,根据响应面试验所得到的单酶水解的最适条件,确定双酶复合水解方案。通过Sephadex G25测定鹿茸胶原多肽的分子量分布。【结果】碱性蛋白酶最优水解条件为:酶解时间3.6h,pH值10.50,酶解温度55℃,加酶量4%,水解液的水解度为22.03%;胰蛋白酶最优水解条件为:酶解时间3.2h,pH值8.00,酶解温度50℃,加酶量4.4%,水解液的水解度为15.81%。复合酶水解条件:酶解温度为52.5℃,调节pH值为10.50,加入4%的碱性蛋白酶酶解3.6h;调节pH值至8.00,加入4.4%的胰蛋白酶酶解3.2h,所得水解液的水解度可达33.42%。复合酶水解胶原多肽的分子量分布在400~1 400u。【结论】确定了鹿茸胶原多肽碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合水解的工艺条件。     

D101树脂固定中性蛋白酶的条件优化及酶学性质研究

【目的】提高中性蛋白酶的固定化效果,对D101树脂固定中性蛋白酶的条件进行优化并对固定化酶的酶学性质进行研究。【方法】以D101树脂吸附法固定中性蛋白酶,分别测定不同温度、时间和加酶量条件下固定化酶的固定化效果,并对固定化中性蛋白酶和游离中性蛋白酶的酶学性质进行比较研究。【结果】D101树脂固定中性蛋白酶的最佳固定条件为:加酶量150 U/g,温度40℃,固定时间120 min,此时固定化酶的酶活回收率最高(70%)。固定化中性蛋白酶和游离中性蛋白酶的最适温度分别为46和40℃,最适pH值分别为7.4和7.2,表观米氏常数Km分别为0.22和0.20 mg/mL,最大酶促反应速度Vmax分别为0.39和0.21 mL/min。【结论】以D101树脂固定中性蛋白酶后,固定化中性蛋白酶的活力、酶活回收率以及热稳定性和pH稳定性显著提高。     

枯草芽孢杆菌MN菌株由来胶原蛋白酶的纯化与生化性质

从传统小麦粉发酵食品中分离得到一株革兰氏阳性且为兼性需氧的内生芽孢杆菌,命名为枯草芽孢杆菌MN菌株,该菌能产生胶原蛋白酶,其16S核糖体核酸序列与枯草芽孢杆菌显示99%的同源性.通过一系列的离子交换层析与分子筛层析,该菌分泌产生的胶原蛋白酶被分离纯化到单一条带,通过分子筛层析预测该胶原蛋白酶的分子量为33 kDa,其活性最适反应温度与酸碱度分别为55℃和pH 11.0,而且该酶的热稳定性与酸碱度稳定性分别为50℃和pH5.0～11.0.     

来源于铜绿假单胞菌GF31的氯氰菊酯降解酶的提取及其降解动力学研究

从实验室自行筛选并保藏的氯氰菊酯高效降解菌——铜绿假单胞菌GF31中提取胞外粗酶液,研究其降解氯氰菊酯的动力学特性.结果表明,在温度20～60℃,pH值5.0 ～9.0范围内,胞外粗酶液都能保持较好的降解活力,最适温度为60℃左右,最适pH为7.0左右.不同pH值和不同温度条件下,氯氰菊酯的酶促降解进程模拟都符合一级动力学模型,相关系数大于0.9.     

双酶水解黄粉虫蛋白制备生物活性肽的工艺优化

【目的】对胰蛋白酶与碱性蛋白酶Alcalase双酶组合水解黄粉虫蛋白制备生物活性肽的工艺进行优化,为获得高活性黄粉虫蛋白多肽及有效利用黄粉虫蛋白提供科学依据。【方法】以水解度和酸溶性肽得率为指标,研究了酶解时间、酶活比、料液比、加酶量、pH和酶解温度6种因素对酶解反应的影响。在此基础上设计了3因素(加酶量、pH和酶解温度)3水平的响应面试验。【结果】胰蛋白酶与碱性蛋白酶Alcalase双酶水解黄粉虫蛋白的最佳酶解条件为:酶解时间120 min,酶活比1∶1,料液比1∶3,加酶量23.41 mg/g,pH 8.77,酶解温度53.41℃。【结论】利用优化双酶水解条件制得的低分子多肽的水解度高达21.61%,酸溶性肽得率为92.09%。     

毛壳菌几丁质酶的酶学性质及抑菌活性研究

【目的】研究毛壳菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)产胞外几丁质酶的酶学性质及抑菌活性,为几丁质酶的抑菌作用机理研究提供依据。【方法】利用蛋白活性电泳方法纯化几丁质酶液,测定几丁质酶的酶学性质,并用酶液浸泡病原菌菌块,研究酶液的抑菌活性。【结果】用蛋白活性电泳方法得到几丁质酶的纯酶液,经检测为电泳纯条带,分子质量为43ku。毛壳菌几丁质酶的最适反应温度为40℃,最适pH为6,40℃以下保温30min均能保持其初始活性,在pH 5~9保温30min仍旧具有较高的活性,Ca2+和Zn2+能明显增强几丁质酶的活性,其纯酶液能抑制立枯丝核菌和烟草赤星病菌的菌丝生长。【结论】毛壳菌几丁质酶在比较温和的条件下能保持一定的活性,纯酶液对部分病原真菌有较强的抑制作用。     

杨柳田头菇YAAS711菌株F_1子代胞外酶活性分析

【目的】探究杨柳田头菇YAAS711菌株的单孢菌株及其自交个体的胞外酶活性变化规律,为其遗传育种提供理论依据。【方法】以杨柳田头菇YAAS711的18个单核体与22个自交双核体为试验材料,分别采用3, 5-二硝基水杨酸(DNS)法、福林法、愈创木酚法等测定羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、半纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、漆酶、多酚氧化酶、过氧化物酶9种胞外酶活性,并对这9种胞外酶与子代生长速度、极性和交配因子进行相关性分析。【结果】单核体和双核体绝大多数都具有较高的淀粉酶、滤纸纤维素酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、羧甲基纤维素酶及蛋白酶活性,过氧化物酶、多酚氧化酶及漆酶活性却较低。9种胞外酶平均活力与单核体和双核体的菌丝生长速度均存在一定程度的相关性,除部分类型Ⅱ单核体外,菌丝生长速度较快的单核体具有较高的胞外酶活性;反之,胞外酶活性较低。相比单核体菌丝生长速度"快-快"的组合,单核体菌丝生长速度"快-慢"的组合除半纤维素酶、蛋白酶和多酚氧化酶外,其他胞外酶活性都较高。具有类型Ⅱ单核体参与形成的双合体胞外酶活性却各不相同且无规律。多酚氧化酶对单核体菌丝生长速度的间接影响大于漆酶,但漆酶对单核体菌丝生长速度的综合作用最大;胞外酶之间的协同作用对双核体菌丝生长速度影响较小,其中漆酶对其菌丝生长速度直接作用最大。多重比较结果显示,在显著水平为0.05上,极性对胞外酶平均活力的影响大于交配因子。【结论】单核体菌丝生长速度与本极性异常和杨柳田头菇YAAS711子代个体胞外酶活性差异存在显著相关性,除部分类型Ⅱ单核体和双核体外,类型Ⅰ菌株胞外酶活性具有相同的规律。单核体菌丝生长速度、极性、胞外酶三者之间具有一定的相关性,但交配因子与胞外酶没有直接相关性。     

山羊乳酪蛋白酶解工艺研究

【目的】确定山羊乳酪蛋白的酶解工艺,为制备山羊乳酪蛋白活性肽奠定基础。【方法】选用中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶,采用对比和正交试验方法,研究山羊乳酪蛋白单酶和复合酶的酶解工艺,测定山羊乳酪蛋白的总肽键物质的量,优选山羊乳酪蛋白的酶解工艺参数。【结果】山羊乳酪蛋白的总肽键物质的量为8.5379mmol/g。单酶中,胰蛋白酶和中性蛋白酶对山羊乳酪蛋白的水解度均较大,木瓜蛋白酶次之,碱性蛋白酶最小;胰蛋白酶对山羊乳酪蛋白的水解度最高,为14.67%,其适宜的酶解工艺为:加酶量2500U/g,pH7.5,50℃下酶解2h。复合蛋白酶中,中性蛋白酶和胰蛋白酶复合及中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶3酶复合时的水解度均较大,2种复合酶的水解度、平均肽链长度和平均相对分子量分别为17.34%,21.16%;5.77,4.73和692,567。【结论】在最佳酶解工艺条件下,单酶中,胰蛋白酶和中性蛋白酶对山羊乳酪蛋白水解度均较大,复合酶中,中性蛋白酶、胰蛋白酶复合及中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶3酶复合时的水解度均较大。     

蜜蜂患白垩病虫体内一株球囊菌拮抗细菌的分离与鉴定

【目的】寻找抑制蜜蜂球囊菌的拮抗菌,用于白垩病的生物防治。【方法】利用细菌纯化技术从患白垩病的蜜蜂幼虫体内分离纯化了一株对蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)有抑制作用的细菌,并结合形态学、革兰氏染色以及16S rDNA序列分析技术进行鉴定,同时通过蜜蜂体内、体外接种试验研究其对蜜蜂球囊菌的抑制作用。【结果】该细菌被初步鉴定为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus),它在培养基中能够完全抑制蜜蜂球囊菌的生长,但其发酵液对蜜蜂球囊菌的生长没有影响。将含菌饲料喂蜜蜂幼虫,蜜蜂幼虫的死亡率和生长发育没有受到影响,说明该细菌对蜜蜂幼虫没有致病性。蜜蜂幼虫体内同时接种细菌和球囊菌孢子,发现细菌对球囊菌在蜜蜂体内的萌发和初期菌丝的生长没有影响,蜜蜂依然能够患病,但生长后期该细菌能够降解球囊菌菌丝,对球囊菌子代孢子的产生表现出一定的抑制作用。【结论】 该研究结果为蜜蜂白垩病的生物防治提供了理论依据。     

不同培养条件对球孢链霉菌JK-1生长及其产生抗菌物质的影响

[目的]研究不同培养条件对球孢链霉菌JK-1生长及其产生抗菌物质的影响,明确该菌生长及其产生抗菌物质的最适培养条件.[方法]在不同培养条件下分别测量球孢链霉菌JK-1的菌体干重,并以稻瘟菌为指示菌,采用菌丝生长速率法测定不同培养条件下JK-1发酵液的抑菌活性.[结果]在供试的7种培养基中,LB培养基最有利于菌体生长,PSB培养基最有利于产生抗菌物质.JK-1在10~35℃范围内均可以生长并产生抗菌物质,25℃为菌体生长和产生抗菌物质的最适温度.JK-1在PSB中培养5d菌体干重可达最大值,培养7d抑菌活性可达到最大值.适宜于JK-1生长及其产生抗菌物质的pH值范围为6~8,最适为pH 7.JK-1能够有效利用多种碳源和氮源进行生长和产生抗菌物质,其中分别以甘油为碳源和酪氨酸为氮源时生长最好;以麦芽糖为碳源和硫酸铵为氮源时发酵液的抑菌活性最强.[结论]球孢链霉菌JK-1生长和产生抗菌物质的最佳培养条件为pH 7的PSB培养基,25℃条件下培养7d,甘油和酪氨酸最适于该菌的菌体生长,麦芽糖和硫酸铵最适于产生抗菌物质.     

米糠蛋白提取工艺的优化及其特性研究

 【目的】建立米糠蛋白在较弱碱性和较低温下保持其特性的高效提取工艺并明确其理化特性。【方法】采用二次通用旋转正交组合设计优化米糠蛋白提取的最佳工艺条件;米糠蛋白特性分别考察其在不同pH、温度、离子强度下的溶解性、乳化性和起泡性,其中,溶解度的测定采用凯氏定氮法,乳化性的测定采用离心法,起泡性的测定采用体积法。【结果】建立米糠蛋白的最佳提取条件为：以pH 11的弱碱性水溶液为溶剂,提取温度40℃,提取时间120 min,在此条件下蛋白提取率可达80.93%。米糠蛋白的溶解度在等电点附近达到最低并随温度升高而增大,离子会降低其溶解度;pH、温度、离子强度对乳化性的影响与其对溶解性的影响表现一致性,蛋白浓度越高其乳化性越好;等电点附近米糠蛋白具有最低的起泡性和最强的泡沫稳定性,适当的热处理可以增强其起泡能力,且随着离子和蛋白浓度的升高起泡能力明显增强。【结论】在较弱碱性（pH 11）和低温度（40℃）条件下提取米糠蛋白的得率可达80.93%,且所得米糠蛋白特性良好,显示出较好的应用前景。     

不同营养和培养条件对向日葵黑茎病菌生长特性的影响

[目的]对向日葵黑茎病菌Phoma helianthi Taberosi生态适应性中的营养和培养条件进行研究,以期建立常规生物学检测方法,以便采取有效检疫处理措施.[方法]不同营养和培养条件下(包括培养基、碳源、氮源、温度、酸碱度、光照),对该菌培养7 d,测量其菌落直径大小和观察其生长状况.并用SPSS 12.0软件进行相应的计算处理、统计分析.[结果]向日葵黑茎病菌在PDA、HLA培养基上生长较好,在WA培养基上生长较慢.该病菌能充分利用可溶性淀粉和硝酸钾.在温度4-32℃均能生长,最适生长温度为24-28℃,适宜生长的PH4.0-8.0,最适PH5.0-7.0;在全光照培养条件下有助于菌丝的生长.[结论]通过不同营养和培养条件下的生长情况,可知该病菌的最适生长条件,有助于对该病菌进行有效的检疫处理.     

牡丹多酚氧化酶的酶学特性

【目的】研究影响牡丹试管苗多酚氧化酶（PPO）酶学特性的因素,为牡丹的高效组培提供参考。【方法】以牡丹品种“乌龙捧盛”为供试材料,采用分光光度计比色法,研究温度、pH值、PPO提取液添加量及底物的类型和浓度对牡丹PPO活性的影响。【结果】以邻苯二酚为底物时,牡丹PPO的最适反应温度与最适pH分别为25 ℃和6.0,最适PPO提取液添加量为1 mL。牡丹PPO的最适作用底物为咖啡酸,其最适浓度为0.08 mol/L。【结论】通过选择合适的pH值和培养温度,同时结合化学抑制剂调控牡丹PPO活性,可以达到在牡丹组织培养中减少褐化现象、提高试管苗生根率的目的。     

水杨酸对低温胁迫下藜豆种子萌发和幼苗生理特性的影响

【目的】研究外源水杨酸（SA）对低温胁迫条件下藜豆种子萌发和幼苗生理特性的影响。【方法】将用蒸馏水浸种的藜豆种子置于15,20,25,30,35,40 ℃可控温培养箱中培养,4 d时测定发芽势,7 d时测定发芽率、发芽指数及幼苗的芽长、主根长、侧根数,确定其适宜的萌发温度。分别用0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mmol/L的SA浸泡藜豆种子,然后进行培养,萌发时温度控制在15 ℃,幼苗生长温度控制在20 ℃,4 d时测发芽势,7 d时测定发芽率、发芽指数,2片真叶时测定幼苗叶绿素、丙二醛（MDA）含量及过氧化物酶（SOD）和超氧化物歧化酶（POD）活性。【结果】（1）藜豆种子萌发适宜的温度为25～35 ℃。（2）低温胁迫下,随外源SA浓度的增大,藜豆种子的发芽率、发芽势、发芽指数以及幼苗叶片的POD和SOD活性均呈先上升后下降的变化趋势,在SA浓度为1.5 mmol/L达最大值,而MDA含量呈现先下降后上升的变化趋势;藜豆幼苗叶片叶绿素含量在不同SA浓度之间差异不显著。【结论】实际生产中,应将藜豆种子萌发的温度尽可能控制在25～35 ℃。外源SA能提高藜豆的抗寒性,其浸种浓度以1.5 mmol/L为宜。     

山药根腐病菌(Fusarium solani)的生物学特性

【目的】对四川雅安山药根腐病主要致病菌腐皮镰孢菌[Fusarium solani]的生物学特性进行研究。【方法】研究不同温度、pH、光照、碳源、氮源和微量元素对该病原菌菌丝生长、分生孢子产生和萌发的影响。【结果】结果表明,腐皮镰孢菌菌丝适宜生长温度为10～40℃,最适温度为30℃;适宜pH范围为4～10,最适碳源为蔗糖,最适氮源为蛋白胨,且在连续光照条件下生长较佳。不同微量元素对菌丝生长和孢子萌发产生作用不同,Mg2+有利于病菌产孢,Zn2+抑制菌落生长和产孢。孢子萌发最适温度为30℃,连续光照,分生孢子和菌丝的最低致死温度为60℃,处理时间为10min。【结论】该病原菌对酸碱度不敏感,不同微量元素对病原菌生长有促进或抑制的作用,生物学特性的研究结果为进一步防治山药根腐病奠定了理论基础。     

预处理及培养方法协同作用对新铁炮百合种子萌发的影响

【目的】 研究不同预处理方式下培养方法协同作用对新铁炮百合种子萌发的影响。【方法】 以新铁炮百合雷山1号种子为材料,采用三因素四水平正交试验设计,研究不同水平的预处理方式、培养温度、培养方式对新铁炮百合雷山1号种子萌发的影响,以及不同温度下种子萌发过程中可溶性糖和过氧化物歧化酶(SOD)的动态变化规律。【结果】 培养温度是影响新铁炮百合雷山1号种子萌发的主要因素,其次是预处理方式和培养方式。雷山1号种子的最佳预处理方式是4℃浸种7 d,最佳培养温度是21℃,最佳培养方式是土壤播种,发芽率为99.18%,播种后第9 d发芽指数为4.65。不同温度处理下,种子萌发过程中超氧化物歧化酶(SOD)活性表现出先增加后下降的趋势,可溶性糖含量则呈现出先下降再上升的趋势,其中21℃处理下种子的抗逆性和贮藏物质的转化利用要高于15、18和25℃处理下的种子,21℃为适宜温度。【结论】 雷山1号种子的最佳处理方式为4℃浸种7 d于21℃下土壤播种。     

高产碱性纤维素酶细菌的筛选鉴定及其酶学特性与发酵条件研究

【目的】从自然环境中分离筛选高产纤维素酶的菌株,开展碱性纤维素酶的酶学特性分析,为该菌株及所产纤维素酶的综合开发利用打下基础。【方法】采用羧甲基纤维素钠（CMC_Na）平板筛选法筛选纤维素酶高产菌株,利用生理生化分析结合分子生物学法对菌株进行鉴定,并通过3, 5-二硝基水杨酸（DNS）法研究其活性特征与发酵条件。【结果】在长期覆盖枯树叶的土壤中分离获得1株高产碱性纤维素酶的菌株,经鉴定该菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）,名称为B. cereus strain CQNUX 3-1。酶活性分析显示该菌株胞外分泌液具有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶的活性,其酶活力分别达107.7、33.1和155.6 U/mL。酶学特征分析表明3种酶组分均具有较好的耐碱和一定的耐高温能力。其中,内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的最佳反应温度分别为70、60和40℃;最佳反应pH分别为8.0、9.0和9.0;Fe3+能增加3种酶的酶活力,而β-葡萄糖苷酶具有较好的EDTA、尿素和Cu2+耐受性。发酵条件对菌株产酶的分析结果表明,该菌株发酵温度在37℃较适宜;发酵第4 d时的酶活力达最大值;该菌株能在碱性发酵环境下生长并产酶,在初始pH为7.0时发酵酶活力最高。【结论】筛选获得的纤维素酶高产菌株B. cereus strain CQNUX 3-1所生产的纤维素酶具有较高的反应温度适用性和较强的碱耐受性,菌株发酵产酶温度适中,且有较宽的发酵pH适用范围,可作为碱性纤维素酶生产资源菌株,具有应用于纤维素酶制剂制备与生产、纤维素资源综合利用等领域的潜力。     

赛买提杏多酚氧化酶特性的研究

[目的]多酚氧化酶(PPO)会对杏加工生产产生重大影响,它不仅影响杏加工产品如杏酱等的色泽,而且也影响其品质,特别是在制作杏茶、杏汁饮料的过程中更为突出.所以,准确测定PPO活性,具有重要的生理和现实意义.[方法]以新疆主栽赛买提鲜杏为原料,对杏组织中PPO的特性进行了研究.[结果]杏多酚氧化酶最适反应pH为6.0,最适反应温度为25℃;杏多酚氧化酶的最适反应波长为400 nm,最适反应时间为6 min,当酶加入量为0.4 mL时,酶活性最大;60～80℃处理10 min,酶基本失活.[结论]丙酮粉与pH为6.0的磷酸缓冲液反应6 min,离心后制得粗酶液;一定量的磷酸缓冲液和邻苯二酚在25℃下保温10 min,添加0.4 mL酶液,在400 nm波长下,测定的PPO活性较为准确.     

棉铃红粉病鉴定及气候条件对病菌生长和孢子萌发的影响

【目的】 研究新疆棉铃红粉病致病菌,分析不同温度、湿度和光照条件对该菌生长、产孢量及孢子萌发的影响。【方法】 通过对病菌的分离培养、致病性测定、形态学观察以及病原菌rDNA-ITS序列分析进行病原鉴定。设置不同温度、湿度和光照,对该菌菌落生长、产孢量及孢子萌发进行测定。【结果】 引起新疆棉铃红粉病的病原菌为Trichothecium roseum;该菌在10~35℃均可生长,生长最适温度为25℃左右,在5℃以下及40℃以上时不能生长;完全黑暗和光暗交替有利于产孢;最适孢子萌发温度为20~25℃,小于5℃或大于40℃均不能萌发;孢子在完全黑暗、完全光照和光暗交替的条件下均可萌发,完全黑暗最适萌发;80%以上的相对湿度萌发率最高。【结论】 棉铃红粉菌的致病菌是T. roseum。温度在25℃左右、完全黑暗和光暗交替有利生长和产孢;温度为20~25℃、完全黑暗、80%以上的相对湿度有利于孢子萌发。