谷关假单胞菌脂肪酶基因PgLip1的克隆和表达

低温脂肪酶在饲料、洗涤、有机合成等行业中具有重要的应用价值，然而目前已发现的低温脂肪酶数量不多，对其基因多样性了解不够深入，因此有必要从自然环境中挖掘新的低温脂肪酶基因。为了获得低温脂肪酶基因资源，通过基因组序列比对分析，从谷关假单胞菌（Pseudomonas guguanensis）中发现并克隆获得一个脂肪酶基因P. guguanensis lipase 1 (PgLip1),并对该基因进行序列分析和蛋白质预测，表达后检测PgLip1的最适底物、最适pH、最适温度，同时研究了表面活性剂、变性剂、EDTA、金属离子及有机溶剂对该酶活性的影响。结果显示：该基因片段大小为840 bp，预测编码含279个氨基酸残基的蛋白质，氨基酸序列与来源于门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）的脂肪酶相似性92.6%。该酶的最适温度为10 ℃，在0 ℃相对酶活为60.2%，是一个低温脂肪酶；其最适pH为8.5，在pH 3.0~12.0时，仍然具有62%以上的相对酶活。40 ℃处理45 min后，PgLip1还能保持72.6%的残余酶活。该酶的最适反应底物为对硝基苯基丁酸酯(pNPB)；在高浓度异丙醇、异戊醇和乙酸乙酯中的酶活反而高于相应较低浓度中，吐温-20、吐温-80和Triton X-100表面活性剂能较大程度激活PgLip1（3.2~5.9倍）。研究丰富了对低温脂肪酶生物多样性的科学认识，所获得的PgLip1是一个受表面活性剂特异激活且对部分高浓度有机溶剂耐受的低温脂肪酶，具有较好的应用前景。     

黄曲霉和黑曲霉发酵麻疯树废弃饼粕产蛋白酶的酶学性质初探

通过对黄曲霉和黑曲霉发酵麻疯树废弃饼粕所产蛋白酶的酶学性质进行初步研究,确定黄曲霉所产蛋白酶最适催化温度为45℃;最适pH值为6．0;Vmax=3333．33μg·min^-1,Km=31．25mg·mL^-1;Fe^3＋能对其活力产生强烈的抑制作用;适量有机溶剂对蛋白酶活力有一定促进作用。黑曲霉所产蛋白酶最适催化温度为50％;最适pH值为4．0;Vmax=18．05μg·min^-1,Km=2．23mg·mL^-1;有机溶剂对蛋白酶活力有一定促进作用;Na^＋和Hg^2＋对蛋白酶活力则有十分强烈的抑制作用。     

杨桃果实过氧化氢酶活性研究

【目的】探讨杨桃果实过氧化氢酶（CAT）的活性及其特性,为杨桃采后保鲜提供理论依据。【方法】以大果甜杨桃为试材,利用紫外可见分光光度计测定杨桃果实CAT活力,分析温度、pH、有机溶剂、金属离子等不同因素对杨桃果实CAT活性的影响。【结果】杨桃果实的CAT活力为0．14U／g·min,其最适温度30℃,最适pH6．6;甲醇和乙醇在低浓度时对杨桃果实CAT活性表现为激活作用,高浓度时呈抑制作用;金属离子Cu2＋对杨桃果实CAT有激活作用,而Mn^2＋和Na^＋对该酶有一定的抑制作用。【结论】杨桃果实CAT活性受温度、pH、有机溶剂和金属离子等因素的影响较明显,生产中通过低温贮藏、合理使用有机溶剂等,可有效延长其货架期。     

一株碱性淀粉酶产生菌的分离及酶学特性分析

[目的]筛选出能用于生物印染的碱性淀粉酶产生菌。[方法]利用Horikoshi培养基从农田土壤中分离碱性淀粉酶产生菌,并采用DNS法和碘量法测定粗酶液中淀粉酶的酶学性质。[结果]共分离到9株碱性淀粉酶产生菌,对其中水解圈最大的菌株703进行16S rDNA序列同源性比对,结果显示其与嗜碱性芽孢杆菌Bacillus pseudofirmus OF4的16S rDNA序列一致性达100%。对该菌发酵粗酶的酶学性质研究表明该碱性淀粉酶的最适温度为50℃,最适pH为9.5,50℃下处理30 min后酶活残存74.7%。[结论]该研究筛选出了能用于生物印染的碱性淀粉酶产生菌,所产淀粉酶热稳定性较好,且具有强的碱耐受性,表明该酶具有应用于生物印染的潜在利用价值。     

蟹源副溶血弧菌胞外蛋白酶的纯化与特性分析

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE—Cellulose离子交换柱层析等方法,从中华绒螯蟹Eriocheir sinensis弧菌病病原菌——副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的胞外产物中分离纯化出两种具有致病作用的胞外蛋白酶。相对分子质量为39600的蛋白酶是一种金属蛋白酶,EDTA可抑制其活性,金属离子Cu^2＋、Mg^2＋、Fe^2＋对该酶有抑制作用,而Ca^2＋对其则有一定程度的激活作用;该酶在50—60℃下热稳定性最好,最适pH为9。而相对分子质量为20000的蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶,EDTA对其酶活力几乎没有影响,但苯甲基磺酰氟（PMSF）可抑制其酶活性;该酶的最适温度为50℃,最适pH为8。     

香荚兰根腐病原茄类镰刀菌的生物学特性

茄类镰刀菌Fusarium solani是香荚兰根腐病的主要病原菌之一，为对该病害进行有效的防治提供试验数据，主要从温度、pH值、光照等条件对其菌落生长及孢子萌发的影响进行了研究。结果表明，茄类镰刀菌在8—36℃内菌丝能生长，分生孢子能萌发，且菌落生长和孢子萌发的最适温度均为28℃，菌落直径达7．39cm．孢子萌发率为5．51％；分生孢子致死温度为58℃ 10min；该菌可生长在pH值为2—12的酸碱范围内，菌落生长最适pH值为6．5，菌落直径可迭6．92cm，孢子萌发最适pH值为4，萌发率为2．98％；全光照对菌落生长有抑制作用，光暗交替有利于菌落生长。     

南方亚麻微生物脱胶技术及其理论研究Ⅵ.酶学特性及脱胶试验

为提高亚麻酶法脱胶的效率，对环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）A6以亚麻为碳源产生的酶制剂特性及脱胶条件进行了研究．结果表明，A6菌是1株高效的脱胶菌，摇瓶振荡加菌脱胶，12h即能完成，其产生的酶制剂包含大量的果胶酶，酶作用的最适反应pH为9．0，酶作用的最适反应温度为50～60℃，酶在pH7～8，30℃条件下能保持稳定，高温（30℃以上）下易失活，利用酶液进行亚麻脱胶的纤维光泽明亮，颜色呈黄白色，纤维表面残留物少，手拉纤维强度大于水沤法脱胶纤维．     

耐有机溶剂低温碱性脂肪酶产酶条件优化及其酶学性质

[目的]研究沙雷氏菌JXJ-54胞外脂肪酶的产酶条件以及粗酶酶学性质。[方法]以沙雷氏菌JXJ-54为出发菌株,采用单因素分析优化其产胞外脂肪酶的条件并对该酶进行酶学性质研究。[结果]该菌株的最佳产酶条件为牛肉浸膏10 g/L、K_2HPO_4 2 g/L、菜籽油乳化液体积分数2.25%,初始pH 9.0、培养温度20℃、装样量40 mL、接种量2%、发酵时间20 h。JXJ-54脂肪酶的最适底物为对硝基苯酚辛酸酯和对硝基苯酚葵酸酯,在30℃、pH 8.5～9.5时酶活力最高,且具有一定的热稳定性和较好的pH稳定性;酶样品受到多数供试金属离子和EDTA的抑制,在供试表面活性剂和有机溶剂中具有良好耐受性,甚至处于激活状态。[结论]该菌株能利用简单的发酵培养基达到较好的产酶效果,其所产胞外脂肪酶为低温碱性脂肪酶,具有一定的热稳定性和较好的pH稳定性,在供试表面活性剂和有机溶剂中具有良好的耐受性,在食品加工、洗涤剂、低温环境修复等低温碱性环境的工业领域中有一定的应用潜力。     

枯草芽孢杆菌MN菌株由来胶原蛋白酶的纯化与生化性质

从传统小麦粉发酵食品中分离得到一株革兰氏阳性且为兼性需氧的内生芽孢杆菌,命名为枯草芽孢杆菌MN菌株,该菌能产生胶原蛋白酶,其16S核糖体核酸序列与枯草芽孢杆菌显示99%的同源性.通过一系列的离子交换层析与分子筛层析,该菌分泌产生的胶原蛋白酶被分离纯化到单一条带,通过分子筛层析预测该胶原蛋白酶的分子量为33 kDa,其活性最适反应温度与酸碱度分别为55℃和pH 11.0,而且该酶的热稳定性与酸碱度稳定性分别为50℃和pH5.0～11.0.     

纤维素分解菌的筛选和酶学性质分析

从腐烂枯叶及附近土壤筛选到纤维素分解菌并研究其酶学特性。采用改进的赫奇逊分离法筛选纤维素分解菌。结果表明，共分离得到两株产纤维素酶的菌株。经菌落形态观察,初步鉴定一株为真菌（F 1）,另一株为细菌（B 1）。酶学性质初步研究显示,这两株菌的纤维素酶在酸性条件下具有较高的酶活（真菌F 1最适pH为5.5,细菌B 1最适pH为4.5）,酶最适反应温度分别为45 ℃和35 ℃,且真菌纤维素酶的耐热性较强;Ca2+对酶反应有抑制作用。如该纤维素酶通过生物酶工程进行工业化生产改造,那么在环境净化方面,尤其是酸性环境下的废物处理中,将会具有很大的应用价值。     

中度嗜盐菌S61生防因子分析及其对马铃薯干腐病的防效

【目的】测定中度嗜盐菌S61对马铃薯干腐病病原菌的抑菌活性及对干腐病的防效，为马铃薯干腐病的生物防治及绿色防控提供科学依据。【方法】以来源于青海察尔汗盐湖的1株中度嗜盐菌S61为材料，采用形态学、生理生化特征及分子生物学方法对菌株S61进行鉴定。通过对峙培养法和马铃薯活体试验，进行菌株S61及其发酵液有机溶剂萃取物抑制马铃薯干腐病病原菌活性测定及对储藏期马铃薯安全性评价。采用平板透明圈法和排油圈法，分别测定菌株S61发酵液分泌抑菌蛋白和产生脂肽类物质的能力。【结果】结合菌株S61的形态特征、生理生化特征和系统发育进化树分析结果，将菌株S61鉴定为特氏盐芽孢杆菌（Halobacillus trueperi）。其发酵液能产生蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶，并能产生脂肽类物质。菌株S61及其有机溶剂萃取物对3株马铃薯干腐病病原菌（青9A-4-13、青9A-5-2和65B-2-6）均有不同程度的抑菌活性，其中对青9A-4-13的抑菌活性最强，对峙培养7 d后的抑制率为55.67%。菌株S61发酵液不同浓度（1、5、10和20 mg/mL）正丁醇萃取物对青9A-4-13的抑菌活性最高，抑制率分别为61.50%、63.00%、64.00%和66.00%。菌株S61发酵液及其正丁醇萃取物对马铃薯储藏安全。【结论】中度嗜盐菌S61在体外和马铃薯活体上均对干腐病病原真菌具有抑制作用，其发酵产物的正丁醇萃取物活性最高，并存在生防因子，能产生一些具有抑菌活性的次级代谢产物，具有较好的马铃薯干腐病生物防治潜力。     

一株抗多种植物病害菌株的筛选、鉴定及其活性成分研究

从农田土壤中分离得到1株对多种植物病原真菌有拮抗作用的菌株Loq18,经生理生化及分子鉴定确定为一株枯草芽孢杆菌,其无菌发酵液经硫酸铵沉淀得抗菌粗蛋白.为明确此抗菌粗蛋白的理化性质,研究了温度、pH变化、UV照射、有机溶剂和蛋白酶对抗菌蛋白稳定性的影响.结果表明,该抗菌粗蛋白具有良好的热稳定性,121℃高压灭菌处理20min后仍具有对照活性的95%以上;对酸碱不敏感,在pH值4～11范围内相对稳定;对紫外线穗定,在紫外光下照射10h以上时,其活性基本不受影响;经乙醚、丙酮等有机溶剂处理后仍具有对照活性的90%以上;对蛋白酶较稳定.     

短短芽孢杆菌DFG对金黄色葡萄球菌的抑制效果

为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)DFG菌株的开发应用提供参考,采用不同化学物质处理方法结合琼脂打孔法研究不同培养基、接种量和发酵时间对其发酵液抑菌活性的影响,并在此基础上研究温度、蛋白酶、酸碱、紫外线照射和反复冻融等因素对其抑菌物质稳定性的影响。结果表明:NA培养基培养的DFG菌株其发酵液对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制作用最强,抑菌圈直径达2.4cm;发酵液经100℃处理30min,抑菌率仍达65%;对酸碱也具有较强的稳定性;经紫外线照射和反复冻融后性质稳定;对胃蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K不敏感,可用有机溶剂对短短芽孢杆菌DFG菌株抑菌物质进行部分萃取。     

芽孢杆菌LP-3抗菌物质的初分离及抑菌活性测定

内生芽孢杆菌LP-3对多种植物真菌具有抑制作用,为分析其分泌的抗菌物质的抑菌活性,分别采用5种有机溶剂对抑菌物质进行萃取,比较了抗菌粗提物与两种杀菌剂对梨黑斑病菌的抑菌效果,测定了粗提物对9种植物病原菌的毒力,结果表明,甲醇萃取物对梨黑斑病菌的抑制效果最佳,抑菌率可达68.4%,对病菌菌丝及孢子的EC50分别为1.18mg.L-1和3.61mg.L-1,介于腐霉利和异菌脲之间,显示出良好的抑菌活性,而且该物质抗菌谱广,对9种植物病原菌的EC50在1.18mg.L-1～67.93mg.L-1之间。     

鲶鱼内脏鱼油的提取工艺研究

本文探讨了鲶鱼内脏中提取鱼油的工艺条件。以鱼油的感官质量和提取率为观察指标,以几种常用有机溶剂为提取剂,以中性蛋白酶为水解酶,通过单因素和正交试验确定提取溶剂的种类和酶解工艺参数。结果表明:提取剂以正己烷-异丙醇(3︰2)最好;提取的工艺条件为:先以中性蛋白酶进行酶解,设定料液比为1︰6,加酶量为1 400 u/g,酶解温度为45℃,酶解时间为2 h;经过滤后,按料液比1︰5加入正己烷-异丙醇(3︰2),振荡萃取25 min。在此条件下,鱼油的提取率为25.3%,产品为淡黄色、澄清透亮的液体;经测定,鱼油的酸价(mg KOH/g)、过氧化值(g/100 g)、碘价(g I2/100 g)分别为3.88、0.067 1、127.4。所以,采用有机溶剂和中性蛋白酶处理相结合对鱼油进行提取,鱼油的感官质量好,提取率高。     

白曲霉酸性蛋白酶在黑曲霉中表达

研究分析固态发酵酸性蛋白酶生产菌株及其产品,ITS序列鉴定结果表明,该菌株为曲霉属,质谱分析结果表明其产品为Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I(EC.3.4.23.18)。根据Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I基因序列pep1(GI:473517)设计引物,以固态发酵酸性蛋白酶生产菌株基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增获得pep1基因。序列分析结果表明,扩增片段与白曲霉Aspergillus kawachii酸性蛋白酶基因组序列相似性为99%,其编码蛋白与白曲霉Aspergillus kawachii酸性蛋白酶(GAA90749.1)相似性为100%,将该基因命名为pep B。构建黑曲霉表达载体p SZHG-pep B,通过农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462,筛选得到在gla A位点发生同源重组纯合转化子。经摇瓶发酵后,对产物进行SDS-PAGE、酶活检测以及酸性蛋白酶酶学性质和酶稳定性研究。结果表明,纯合同源重组菌株经SDS-PAGE检测时在47 ku左右处有明显目的蛋白条带,其发酵产物酸性蛋白酶酶活达5 543 U·m L-1,为出发菌株152倍。对菌株所产酸性蛋白酶酶学性质研究发现,该酶最适反应温度为50℃,最适反应p H 3.0,在4℃和25℃条件下,酶在p H 3.0~4.0时较稳定。     

1株蛋白酶产生菌的分离及生理特征研究

采用平板透明圈法,经初筛和复筛从高黎贡山土样中分离出1株产蛋白酶活性较高的菌株CM8,并对其形态和生理生化特征进行研究。结果表明,CM8菌株的菌落呈不规则形,乳白色,表面湿润,边缘整齐;在光学显微镜下,菌株呈杆状,具运动性,革兰氏染色阳性。经测定,其最适生长温度为32℃,最适生长pH值为7.5,菌株可在酪素平板上产生清晰可见的透明圈,透明圈直径和菌落直径的比值为3.71。菌株产高温蛋白酶的酶活力可达34.24 U/m l。     

金枪鱼肉降解用高产蛋白酶菌株的筛选及鉴定

采用透明圈法从舟山普陀白山土壤中筛选出3株能分泌胞外蛋白酶的菌株,并对蛋白酶活力最高的菌株进行分子鉴定及最适宜生长条件分析。选择福林酚试剂法测定其蛋白酶活力,对蛋白酶活力最高的菌株进行16S r RNA基因测序,用MEGA软件构建系统发育树,并考察其接种量、温度、时间对该菌株产酶活力的影响。结果表明,zjoub-1菌为高产蛋白酶菌属,并确定为枯草芽孢杆菌。该菌株用于金枪鱼暗色肉发酵时的最适宜条件为接种量2%、pH 7.4、温度37℃、时间48 h。在此生长条件下,菌株产蛋白酶活力最高,为49.21 U/m L,能够有效地降解金枪鱼暗色肉。     

烟叶类胡萝卜素提取最佳条件的研究*

 在不同溶剂、提取时间、温度、料液比和提取次数等条件下,通过正交实验,对烟叶类胡萝卜素提取最佳条件进行了研究。结果表明：最佳提取工艺条件是用石油醚-丙酮(1∶1,V/V)混合溶剂浸提,料液比为1∶15(g/mL),在40 ℃条件下浸提3 h,浸提2次,其提取液的吸光度最高。     

一株源于红树林土壤芽孢杆菌的鉴定 及其蛋白酶学性质研究

从湛江红树林土壤中分离出一株产蛋白酶的芽孢杆菌,通过细菌形态观察、生理生化试验及16S rRNA 基因序列进行分类鉴定,并研究了温度、pH 值、金属离子、EDTA 和吐温80 等因素对该菌株发酵产蛋白酶的酶学性 质的影响。结果表明,该菌株为解淀粉芽孢杆菌,命名为解淀粉芽孢杆菌y-6（Bacillus amyloliquefaciens strain y-6）; 该菌株产生蛋白酶的最适温度为55益,最适pH 为7.0~7.5,40益时,酶活性稳定,保温3 h仍有95%以上的相对酶活 力,pH 为5.5~11 时,酶活性稳定,相对酶活力均在90%以上;Ca2+、Zn2+和吐温80 对蛋白酶有一定的激活作用,Mn2+、 Fe3+、Cu2+及EDTA 对酶有一定的抑制作用,其中EDTA 对酶的抑制作用最强。