新疆多浪羊IFN-γ基因地高辛探针的标记与敏感性检测

为获得多浪羊IFN-γ地高辛探针,并对其标记效率进行检测。将多浪羊pMD-18T-IFN-γ克隆菌进行PCR扩增,经切胶回收及目的基因浓缩后获得目的基因IFN-γ,然后用地高辛标记和检测试剂盒对IFN-γ基因进行标记,获得IFN-γ地高辛探针。IFN-γ的PCR扩增产物经8g/L琼脂糖电泳分离后转移至Hybond N+膜,膜上显影后进行敏感性检测并计算探针质量浓度,结果显示,IFN-γ地高辛探针在杂交液中的质量浓度为30μg/L。Southern杂交显示,Hybond N+膜上有IFN-γ基因的双链DNA,且浓缩后的DNA(2.5μg)标记的特异性探针质量浓度较高,可以在Hybond N+膜上呈现出清晰的杂交条带,证明获得的探针质量浓度符合要求。     

玉米自交系SSR标记技术的优化

选用7个玉米自交系为材料,分别研究了PCR反应体系中Mg2+浓度、d NTPs浓度、Taq DNA聚合酶量、引物浓度、模板DNA量,退火温度,PCR产物变性处理及银染方法对玉米自交系SSR标记结果的影响,优化了玉米自交系SSR标记技术。结果表明:优化后的20μL PCR反应体系为1.5 mmol/L Mg2+、0.05 mmol/L d NTPs、0.5 U Taq DNA聚合酶、0.05μmol/L引物、10倍PCR buffer 2.0μL和80 ng模板DNA,最优退火温度为60℃。PCR产物在95℃条件下变性5 min后上样电泳,电泳结束后胶板用蒸馏水快速漂洗,洗后用0.1%的硝酸银溶液银染8 min,再用蒸馏水洗30 s,最后用3%氢氧化钠与1%甲醛显影。     

基于荷正电聚合物探针的共振光散射法DNA杂交检测

荷正电高分子聚合物可以通过静电作用与DNA寡核苷酸序列进行结合,其与单链DNA和双链DNA结合后有不同的共振光散射(RLS)信号.基于此,设计了一种杂交DNA检测探针,实现了完全互补序列与单碱基错配序列及非互补碱基序列的区分,并建立了一种简单、快速、免标记的DNA杂交检测方法.在最佳条件下,在λ=470nm处,光散射强度达到最大,并且与目标DNA浓度在5.0~500nmol/L范围内呈线性,检出限为2nmol/L.     

单胞藻浓缩液制备中超滤膜清洗方法的研究

研究了浓缩单细胞藻后超滤膜的几种清洗方法,探讨了物理法清洗的持续时间,比较了3种清洗剂（5.0 mL/L HCl、5.0 g/L NaOH和5.0 g/L NaClO溶液）的清洗效果,以及水温对5.0 mL/L HCl和5.0 g/LNaClO溶液清洗效果的影响。结果表明：过滤单细胞藻后,污染超滤膜的几种清洗方法的最佳清洗时间分别为,用物理法反冲洗30 min,用5.0 mL/L HCl溶液冲洗10 min,用5.0 g/L NaClO冲洗10 min。水温小于30℃时,采用5.0 g/L NaClO溶液清洗效果较好,膜恢复率为95.1%;大于30℃时,采用5.0 mL/LHCl溶液清洗效果较好,最高恢复率为95.9%。     

用SSR分子标记检测杂交油菜秦优7号的种子纯度

杂交油菜中的主要杂株类型是母本不育株和父本恢复株。通过对100对SSR引物筛选,获得1对可将杂交油菜秦优7号及其父母本区分开来的SSR引物SA82,扩增产物杂交种表现为父母本的互补带型,在30 g/L的琼脂糖凝胶上显带清晰稳定。通过简化油菜DNA提取方法、优化反应体系、重复使用琼脂糖凝胶等,建立了适用于杂交油菜秦优7号种子纯度检测的SSR技术系统。经对大量油菜杂交种个体进行验证,证明该方法具有很好的重复性、准确性和可靠性,同时具有快速、经济的特点,可用于杂交油菜种子纯度的实际检测。     

桔梗RAPD-PCR体系的正交优化及引物筛选

【目的】建立桔梗RAPD-PCR反应的最佳体系并应用于桔梗遗传图谱的构建。【方法】以2个桔梗亲本GS16和GS106的叶片DNA为模板,对桔梗DNA的提取及对影响桔梗RAPD-PCR扩增的重要参数进行优化试验,并从530个随机引物中筛选出在2个亲本间具多态性的引物。【结果】叶片研磨后用蒸馏水预洗及2次沉淀时加入3 mol/L NaCl(pH 5.2)溶液,提取的基因组DNA纯度较高。优化的最佳反应体系总体积为25μL,内含ddH2O12.4μL、10×buffer 2.5μL、引物0.3μmol/L、dNTPs 200μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5 U、DNA模板40 ng;反应程序为:94℃预变性4 min;94℃30 s,35.3℃1 min,72℃2 min,40次循环;72℃10 min。按此优化RAPD条件成功地从530个随机引物中筛选出了115个在两亲本间具多态性的引物。【结论】改良的CTAB法能成功用于桔梗基因组DNA提取,建立的最佳反应体系可用于桔梗遗传图谱的构建。     

利用可视化膜芯片检测9种转基因玉米

建立了一种可同时检测9种转基因玉米(Zea mays L.)的可视化膜芯片检测方法。该方法利用紫外交联技术,将9种转基因玉米特异性探针及内源性玉米醇溶蛋白基因(Zein)探针和杂交质控探针固定于尼龙膜表面制成检测芯片。通过多重PCR同时扩增多重靶标片段,生物素化产物与检测芯片杂交。阳性结果由链酶亲和素-碱性磷酸酶及显色底物NBT/BCIP的显色反应在芯片表面形成裸眼可见的点。应用商业化转基因玉米(Bt176、Bt11、MON810、GA21、T25、TC1507、DAS-59122、NK603、MIR604)、转基因棉花(MON1445、MON15985)、转基因大豆及非转基因材料检验了芯片的性能,结果表明,制备的检测芯片具有良好的特异性和重复性,检测限为0.5%。芯片鉴定结果与PCR产物测序结果一致。     

RNAi转基因大豆品系‘B5C9123-5’的RPA可视化检测技术

为开发RNAi转基因作物的田间可视化鉴定方法,以DNA嵌合染料SYBR Green I为材料,采用设置重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)特异性引物的手段,建立了一种快速、低成本、可视化的RPA用于转基因大豆‘B5C9123-5’的检测。结果表明,在靶标不存在时,RPA体系中游离的SYBR Green I染料使溶液呈现较弱的黄色荧光。在靶标存在的情况下,RPA扩增产生的双链DNA与SYBR Green I结合导致溶液从黄色转变为绿色并使荧光迅速增强。通过对RPA扩增时间和温度进行优化,阳性结果可在20 min内用肉眼鉴别,检测限为1.00 ng/μL。通过设置不同RPA引物,该方法可用于现场快速检测多种RNAi转基因作物。     

一种简易的拟南芥幼苗微量DNA提取方法

报道了一种简易的拟南芥幼苗微量DNA提取方法。陔方法可在常温下进行DNA提取，而且样品用量少，仅需10mg左右，用100μL重蒸水回溶DNA沉淀所获得的粗提液可直接用于PCR检测。结果表明：应用该法提取的DNA完整性好，PCR效果佳，适用于拟南芥转基因植株鉴定。     

QuEChERS-气相色谱串联质谱法检测诺丽酵素原液中12种农药残留

建立了QuEChERS净化结合气相色谱串联质谱测定诺丽酵素原液中12种农药残留的方法。样品采用乙腈溶液提取,提取液中加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠脱水和缓冲,振荡分层后吸取上层清液,再经PSA净化离心后上机。结果表明,50 mg PSA能够满足方法的净化要求,12种农药均采用外标法定量,基质标准溶液在0.005～0.960 mg/L线性良好;在0.012、0.080、0.400 mg/kg 3个添加水平下回收率为84.2%～113.0%,RSD均小于15%,大部分农药定量限为0.012 mg/kg。该方法前处理简单快速,准确度和精密度符合检测要求,可满足诺丽酵素原液中的乙烯菌核利、腐霉利、联苯菊酯等12种农药残留的同时检测。     

石英砂研磨法快速提取顶头孢霉染色体DNA

本研究的目的是改进头孢菌素C产生菌顶头孢霉基因组DNA的提取方法。采用氯化苄法、液氮研磨法以及石英砂研磨法进行比较,从提取的DNA数量及纯度来分析,石英砂法要好于液氮研磨法,与氯化苄法效果相当,但避免了氯化苄的毒性。提取液的pH对结果影响不大,当pH为9.0～10.0之间时,收率稍高;EDTA浓度应大于40 mmol/L。经石英砂研磨破壁,获得了较高质量的染色体DNA,该法与液氮研磨法、氯化苄法相比廉价、快速、安全,且不影响其后续的分子生物学操作。     

磁珠分离法快速提取大肠杆菌质粒DNA

以单分散羧基功能化纳米磁性粒子为固相载体,PEG/NaCl为结合液,对大肠杆菌(Escherichia coli)裂解液中的质粒DNA进行了纯化研究.结果表明:PEG8000质量分数7.5％,NaCl浓度1.25 mol/L,磁珠用量0.9 mg时,在室温下,从1.5 mL大肠杆菌菌液中提取到的质粒DNA量为8.3μg...     

黑麦特异性PCR反应体系的建立（摘要）

[目的]建立黑麦特异性PCR反应优化体系。[方法]以普通小麦＂中国春＂、S165、黑麦、八倍体小黑麦、六倍体小黑麦为试验材料,研究了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2＋浓度、TaqDNA聚合酶用量及退火温度对黑麦特异性PCR反应体系的影响。[结果]采用改良的CTABDNA微量提取法可以得到高质量的基因组DNA,满足PCR反应模板的要求,黑麦特异PCR扩增反应体系为：在25μl反应体系中,10×缓冲液,1.5mmol/LMgCl2,200μmol/LdNTP,40ng引物,40～60ng模板DNA,1UTaq酶。[结论]建立了适宜的黑麦特异PCR扩增反应体系,可为小麦背景下黑麦外源种质的检测奠定基础。     

家兔RAPD分析反应体系的优化

以家兔的基因组ＤＮＡ 为模板,研究影响家兔ＲＡＰＤ 扩增的因素。实验结果表明,Ｔａｑ酶、随机引物和Ｍｇ２ ＋ 浓度及模板ＤＮＡ 的纯度对ＲＡＰＤ 扩增影响较大。本实验建立了适于家兔ＲＡＰＤ 分析的反应体系：反应体积为２０μｌ,其中含有１ ×扩增缓冲液,２ ．０ｍ ｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２ ,０ ．１ｍ ｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ,０－２μｍｏｌ／Ｌ 随机引物,１ ．５ＵＴａｑ 酶,９０ｎｇ 模板ＤＮＡ     

茶藨子总DNA提取及ITS-PCR体系的优化

利用Tiangen DP305试剂盒对茶藨子(Ribes L.)总DNA进行提取,应用单因子试验分析了DNA模板、dNTPs、引物和Taq酶对ITS-PCR扩增结果的影响,并建立了茶藨子ITS-PCR扩增反应的优化体系,最优反应体系为:25μL体系中,10×PCR buffer 1μL、Mg2+0.4 mmol/L、引物浓度0.5μmol/L、dNTP浓度为1 mmol/L、Taq酶的用量1.0 U、DNA模板用量为50 ng。优化后的反应体系可作为茶藨子属植物ITS-PCR的基本反应体系,为进一步开展茶藨子属的分类和系统发育研究奠定基础。     

女贞ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用单因子试验,测试了女贞ISSR-PCR反应体系中的主要影响因子。经过优化实验,建立了一套适合于女贞的稳定的ISSR-PCR反应体系:10×buffer2.5μL,2.0mmol·L-1的MgCl2,200μmol·L-1的dNTPs,1.5U的Taq酶,0.4的μmol·L-1的引物,10ng的DNA模板。PCR扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性40s,52～62℃退火45s,72℃延伸120s,进行35个循环,72℃延伸8min,4℃保存。应用该优化的ISSR-PCR实验体系对12份女贞种质材料进行了扩增,均能扩增出丰富稳定的条带。     

巴旦杏RAPD-PCR反应体系的正交优化

以巴旦杏DNA为模板,利用L25(56)正交设计,研究了dNTPs、DNA模板、Mg2+、Taq酶和随机引物5种RAPD反应组分浓度变化对扩增结果的影响.量化的分析结果表明,正交试验的方法可以较为准确地反映各个因素在不同水平上对RAPD-PCR的影响.试验研究建立的巴旦杏RAPD-PCR最佳反应体系为:25 μL PCR反应体系中, 10×Taq Buffer 2.5 μL, 2.0 mmol/L Mg2+,0.25 mmol/L dNTPs,模板DNA为30 ng,随机引物0.8 μmol/L,Taq聚合酶1.5 U.     

PVP对烟草基因组DNA提取的影响

为克服烟叶组织中蛋白质、糖类、色素、烟碱及酚类等物质对烟草基因组DNA提取的干扰,防止DNA产生褐变,获得质量高且适于SRAP-PCR反应需要的DNA,采用改良CTAB法探讨了在提取液中添加不同浓度PVP对烟草基因组DNA提取质量的影响.结果表明:在1%、2%、4%PVP浓度下提取烟草DNA样品的OD260/OD280值均在1.7～1.9之间,OD260/OD280值随着提取液中PVP浓度的提高而增大,DNA褐化程度明显降低,获得的DNA能满足SRAP分析要求.     

珍稀濒危竹种筇竹(Qiongzhuea tumidinoda)RAPD反应条件的优化

以宜宾筇竹为材料建立了筇竹RAPD反应优化体系,用于筇竹遗传多样性分析,以改进的CTAB法提取筇竹叶片总DNA,分别测试了镁离子浓度、dNTP浓度、引物浓度、模板DNA含量、DNA聚合酶量对反应结果的影响。通过对各因子的组合比较,建立了筇竹RAPD反应优化体系:20μL PCR反应体积,10×Taq酶配套缓冲液(2μL);1.25 U Taq酶;75 ng模板DNA;45 ng引物;1.88 mmol/L MgCl2;0.19 mmol/L dNTP。     

不同pH磷酸缓冲液对冬小麦花后干旱胁迫的减缓效应研究

为进一步明确pH缓冲液对冬小麦抗逆性的影响效应与机制,在温室盆栽环境下,于花后设置正常水分和干旱胁迫两种条件,考察了pH 5.5和pH 7.5磷酸缓冲液处理对干旱胁迫下旗叶的相对电导率、光合性状、抗氧化酶活性等指标及产量的影响。结果表明:干旱胁迫显著增加了旗叶相对电导率,但pH 5.5和pH 7.5缓冲液处理下旗叶相对电导率增加幅度较小,其质膜相对较稳定;2种缓冲液处理均减轻了干旱对旗叶光合性能的影响,表现在处理后叶片光合速率、叶绿素荧光参数(Fv/Fm)、SPAD值均显著高于喷水对照,特别是pH 5.5缓冲液处理效应更为明显;干旱胁迫诱导增强了旗叶CAT、POD和SOD等抗氧化酶活性,两种缓冲液处理进一步提高了CAT和POD的活性,其中pH 5.5缓冲液处理对CAT、pH 7.5缓冲液处理对POD相对影响效应更明显;干旱胁迫显著降低了穗粒重,但两种缓冲液处理的穗粒重降低幅度较小,其产量均显著高于喷水对照。综合研究认为,pH缓冲液处理能稳定细胞膜,增强旗叶抗氧化能力,能在一定程度上维持干旱胁迫下叶片的光合能力,减轻干旱胁迫对产量的不利影响。