piggyBac转座子在绒山羊基因组中的整合位点及其特征分析

【目的】构建piggyBac（PB）转座子表达载体系统,研究PB转座子在绒山羊基因组中的整合位点。【方法】构建pB-CMV-EGFP-Neo转座载体和pcDNA-Trans辅助载体,利用lipofectamine 2000介导共转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得稳定转染的转基因细胞系。提取转基因细胞基因组DNA,利用反向PCR检测piggyBac转座子整合位点。【结果】构建了转座系统并成功介导外源基因在绒山羊成纤维细胞染色体中整合,获得了转基因细胞系;反向PCR检测显示在绒山羊基因组中有21个PB转座子整合位点;整合位点TTAA毗邻一侧的5个碱基组成中,PB转座子3′倾向于插入到富含AT（58.35%）碱基的区域,PB转座子5′倾向于插入到富含GC（57.8%）。【结论】PB转座子可在绒山羊基因组中发生高效转座,获得的整合位点信息可为利用PB转座子开展绒山羊研究提供理论参考。     

基因克隆技术

综述了基因克隆常用技术包括图位克隆法、转座子或T－DNA标签法、同源序列法、表达序列标签（EST）法和差异表达基因分离方法的原理、应用、应用的潜力和限制因素。     

毛竹Phyllostachys edulis retrotransposon 7（PHRE7）转座子的克隆与鉴定

长末端重复序列（LTR）反转录转座子广泛存在于植物基因组中,本质是一段可移动的脱氧核糖核酸（DNA）序列。大多数LTR反转录转座子在外界环境变化下能够被激活转录,对环境变化做出响应。为研究毛竹基因组中的LTR反转录转座子的转录活性及在非生物环境胁迫下表达量的具体变化,克隆和鉴定了1个毛竹Phyllostachys edulis反转录转座子PHRE7。该转座子全长为6 073 bp,属于Ty1-copia家族中的Tork分支,LTR序列相似性为96.7%,插入时间为126.923万a前。对毛竹实生苗分别进行辐照（30,50,70 Gy）,甲基化抑制剂（50,100,150 μmol·L-1）,高温（42℃）,低温（4℃）,高盐（0.1,0.2,0.3 mol·L-1）等5种不同胁迫处理,通过定量荧光聚合酶链式反应（PCR）检测,PHRE7在INT,RT和RH等3个结构域中的表达量仅在辐照及0.2~0.3 mol·L-1高盐处理下随处理强度的上升而下降,其余所有处理（甲基化抑制剂、高温、低温、高盐0.1~0.2 mol·L-1）的表达量都随处理强度呈上升趋势。这些结果表明:PHRE7转座子是一个具有转录活性的LTR反转录转座子,且外界非生物环境胁迫对其表达模式有较大影响,表明PHRE7转座子能够响应外界环境变化。     

牛亚科物种转座子与串联重复序列之间的进化关系

【目的】重复序列是真核生物基因组中重要组成部分,对物种进化、基因遗传变异、转录调控等具有重要作用。研究旨在揭示牛亚科物种重复序列特征,研究转座子和串联重复序列间的进化关系,为牛亚科物种重复序列的研究提供理论支撑。【方法】以普通牛、瘤牛、牦牛、水牛、野牛以及大额牛6个牛亚科物种的基因组序列为研究对象,利用TRF和RepeatMasker软件对6个牛亚科物种基因组中的串联重复序列（tandem repeats sequence,TRs）和转座子（transposable elements,TEs）进行鉴定,并通过本地BLAST比对,分析两类重复序列间的相似性,单位点（single-locus TRs, slTRs）和多位点串联重复序列（mutiple-locus TRs, mlTRs）以及转座子内部的串联重复特征。【结果】（1）6个牛亚科物种中,重复序列在普通牛中的比例最高,为49.13%,其次为水牛46.82%、大额牛46.66%、瘤牛42.70%、野牛42.36%、牦牛42.34%;其中转座子在基因组中的比例为40.57%—45.71%,高于串联重复序列的比例（1.50%—3.42%）。（2）串联重复序列中,mlTRs的比例（76%—99%）显著高于slTRs（1%—24%）,表明mlTRs为6个牛亚科物种中串联重复序列的主要组成。（3）TE-derieved的串联重复序列分析表明,TRs中43%—84%的序列来源于转座子,其中多位点串联重复序列可高达94%。（4）TRs-related 转座子及其活性分析表明,与TRs具有相似性的转座子主要来自非长末端重复序列（non-Long Terminal Repeats, non-LTR）,包括SINE（Short Interspersed Nuclear Element, SINE）和长末端重复序列（Long Interspersed Nuclear Element, LINE）,其中SINE/Core-RTE（主要为BOV-A2）的数量（14 423—24 193）和相对丰度（4.06%—6.77%）最高,被认为是牛亚科物种中最年轻且最具活力的转座子。（5）转座子的串联重复特征分析表明,BovB在0—600 bp,L1_BT在1 500—2 700 bp的序列分别发生了大量的串联重复,与consensus序列的一致性分别达93%和87%以上,且两段区域均为非编码区。【结论】重复序列在牛亚科物种中具有相似的分布特征, non-LTR是牛亚科物种TRs-related TEs的重要来源,且SINE/Core-RTE（主要为BOV-A2）为牛亚科物种最年轻且最具活力的转座子;同时串联重复序列又可作为转座子内部结构的组成部分,表明串联重复序列与转座子在基因组的进化过程相互影响、相互作用。     

多转座子载体的构建及转座特性比较研究

【目的】转座子（transposon, Tn）是染色体上可自主复制和移位的基本单位,普遍存在生物体基因组内,Sleeping beauty（SB）、piggyBac（PB）和Tol2分别来源于鲑鱼、甘蓝尺蠖蛾和青鳉鱼,是目前脊椎动物中活性较高的转座子。比较了这3种转座子在哺乳动物细胞的转染、插入和剪切效率,从而获得细胞水平上的高活性转座子系统。【方法】通过高保真PCR法分别从SB、PB和Tol2 3种转座子载体克隆3种转座子3′和5′端的转座元件,测序正确后,将各转座元件依次亚克隆至pT2-HB载体框架,构建成包含这3种转座子的多转座子载体pT3-PST。将绿色荧光蛋白表达框CAG-GFP和新霉素表达框PGK-NEO分别克隆至pT3-PST载体,获得两个表达载体pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。将这两个表达载体分别和转座酶表达质粒pCMV-SB100X、 pCMV-HAhyPBase、pCMV-Tol2以1﹕1质量比混合,经多聚阳离子PEI包裹,共转染小鼠胚胎成纤维细胞（3T3）,同时以突变失活的转座酶质粒SB△DD与转座子载体共转染作为阴性对照组。转染GFP 36 h后,用荧光显微镜进行检测GFP表达率,提取细胞基因组,以Amp基因作为内参,进行实时荧光定量PCR,检测GFP插入拷贝数;根据被剪切位置上下游序列设计引物,进行实时荧光定量PCR,检测3种转座子的剪切效率。细胞转染NEO 48 h后,用浓度为500 µg·mL^-1的G418进行耐药性筛选,至正常细胞基本全部死亡（10 d）,将细胞进行吉姆萨染液染色,统计耐药细胞数,从而比较各组转座活性。【结果】成功构建了多转座子载体PT3-PST、pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。实验组转染细胞效率均大于50%,且差异不显著（P＞0.05）。SB组GFP相对拷贝数高于Tol2和PB组,但差异不显著（P＞0.05）,均显著高于对照组（P＜0.05）。SB和PB组剪切效率显著高于Tol2组（P＜0.05）,但SB和PB组之间差异不显著（P＞0.05）。pT3-PGK-NEO与转座酶共转染3T3细胞,G418抗性筛选结果表明,SB组耐药细胞数显著高于PB和Tol2组（P＜0.05）,但PB和Tol2两组差异不显著（P＞0.05）,此3组均极显著高于阴性对照组（P＜0.01）。【结论】SB转座子系统在细胞水平的转座效率优于PB和Tol2,为细胞水平的转基因研究提供有效基因转移工具。     

植物中Ac/Ds转座子的研究与应用

Ac/Ds转座子作为研究较为深入的植物转座子,已被广泛应用于植物功能基因组研究.利用Ac/Ds标签系统构建插入突变体库是研究功能基因组学的有效途径,也是进行基因克隆及功能分析的有利工具.结合课题组利用Ac/Ds转座子标签分离基因并进行基因功能验证方面的研究工作,综述了Ac/Ds转座子在植物基因组中的插入特点、转座机制以及转座子标签法的应用与发展前景,为更有效的利用Ac/Ds转座子提供参考依据.     

转座子标签在植物基因组学研究中的应用

转座子因其插入突变的特征可用于基因的分离和克隆,转座子标签法克隆基因是近年来发展起来的一种分子生物学技术。主要介绍了转座子家族的概念,植物内源转座子标签和异源转座子标签的研究,转座子陷阱技术以及在植物基因组学研究中的应用。     

反刍月形单胞菌乙酸生成缺陷株的构建及相关酶活性分析

[目的]构建反刍月形单胞菌乙酸生成的缺陷株并分析其发酵特性。[方法]应用转座子标签法,通过转座子供体菌E.coliS17-1/pZJ25∷Tn5对受体菌反刍月形单胞菌进行转座子诱变,采用含卡那霉素和氟乙酸纳的选择性培养基筛选接合子。[结果]共筛选出稳定的对卡那霉素和氟乙酸具有抗性的转座工程菌7株。对反刍月形单胞菌的突变株进行16S rRNA鉴定和Tn5的PCR鉴定,及乙酸激酶（AK）和磷酸乙酰转移酶（PTA）酶比活力分析,确定突变株属于pta基因缺失型氟乙酸抗性菌株。[结论]该研究为进一步研究反刍兽瘤胃微生物乙酸的细胞代谢网络和调控奠定基础。     

玉米Mutator转座子系统的应用及展望

转座子标签法是近年来发展起来的一种非常有效的分子生物技术,是一种利用TEs插入高等植物基因组中造成基因突变,然后通过分离TEs插入的旁邻序列,克隆出突变基因的策略。这种策略在高等植物的功能基因组学研究中十分有用。玉米转座子系统主要有En/Spm系统、Ac/Ds系统和Mutator系统三大类。其中Mutator转座子易于插入到基因内部及基因周围,引起的正向突变频率为10~(-5)~10~(-4),比野生玉米高出近30倍,所引起的突变大部分为隐性突变。由Mutator转座子引起的突变,可以通过TAIL-PCR的方法,对相关的突变基因进行克隆。当前通过这种方法,已经克隆出一些重要的基因。本文主要介绍了Mutator转座子的应用,并对Mutator转座子系统的研究前景进行了展望。     

转座子的分类与生物信息学分析

转座子是真核物种基因组的重要组成部分,对宿主的基因结构、基因拷贝数和基因表达都有很大的影响。本文介绍了一个依据转座子复制机制、序列相似性和结构关系的分类系统和命名规则。另外,我们也讨论了转座子的生物信息学分析方法,包括转座子分类、数据库构建以及数量动力学分析。这些标准和方法将促进转座子的比较研究并能更深入地了解转座子的进化信息。     

大豆根构型在玉米/大豆间作系统中的营养作用

 运用根构型不同的大豆品种与玉米进行间作，比较大豆根构型在玉米/大豆间作系统中的营养作用。结果表明，玉米与大豆间作具有明显的间作优势，间作作物的生物量、氮磷含量都显著好于单作。玉米与浅根型大豆品种巴西10号间作，间作优势大于与深根型大豆品种本地2号。说明大豆根构型在玉米/大豆间作系统中具有十分重要的作用。间作系统的氮磷养分竞争比率表明，玉米/大豆这类豆科/禾本科间作组合的优势主要来自对氮的优势性吸收，而玉米与不同基因型大豆间作的优势差异则主要来源于对土壤磷吸收的差异。浅根型大豆品种不仅有利于两种间作作物对土壤磷的吸收，同时还有利于对氮的吸收。     

西瓜根际土壤酶及微生物对小麦伴生的响应

连作障碍是限制设施西瓜生产的重要因素,合理地运用地上部生物多样性是解决连作障碍的有效手段。为探讨连作西瓜根际土壤酶活性和微生物对小麦伴生的响应,采用连作西瓜土壤进行盆栽试验,设置D₁₂₃小麦伴生西瓜、D₁₂₅小麦伴生西瓜、西瓜单作和无苗对照4个处理,研究土壤酶活性、微生物区系和微生物生物量碳、氮、磷对小麦伴生的响应。结果表明,D₁₂₃小麦伴生处理的根际土壤微生物总数和放线菌数量分别比西瓜单作增加了45.21%和130.20%,根际土壤放线菌的比例比西瓜单作增加了7.6%;D₁₂₅小麦伴生处理的根际土壤细菌数量比西瓜单作增加了40.89%,根际细菌的比例比西瓜单作增加了10.81%。同时,两种小麦伴生处理均降低了西瓜根际土壤真菌的比例,提高了西瓜根际微生物生物量碳、氮、磷含量,降低了微生物生物量碳氮比,提高了多酚氧化酶和蔗糖酶活性。可见,连作西瓜根际对小麦伴生产生了积极的响应。     

"循化红"线辣椒SRAP-PCR反应体系的优化与建立

[目的]建立适合于“循化红”线辣椒基因组的SRAP-PCR优化扩增反应体系。[方法]采用L16（4^5）正交试验设计,对“循化红”线辣椒SRAP反应体系中的Mg^2＋浓度、Taq聚合酶、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度进行5因素4水平正交优化。[结果]“循化红”线辣椒的最佳SRAP—PCR反应体系为：Mg^2＋浓度为2．0mmol／L,dNTPs为0．5mmol／L,Taq酶0．5U,引物浓度为0．4μmol／L,模板DNA浓度为1．0ng/μl,总体积20μl。[结论]该体系的建立为SARP标记技术应用于“循化红”线辣椒种质资源的收集与利用,品种的鉴定、标记辅助育种等方面奠定了良好的试验基础。     

麻疯树cpSSR标记技术的建立与体系优化研究

[目的]建立麻疯树cpSSR—PCR反应的最佳反应体系。[方法]对影响麻疯树cpSSR—PCR反应体系的5个因素（细DNA聚合酶、DNA模板、Mg2＋、dNTP、引物）进行优化试验,筛选各反应因素的最佳水平。[结果]20山反应体系各组分的最合适浓度分别为10XBuffer、2．00mmoL／LMg2＋、2U／μlTagDNA聚合酶、0．2mmol／LdNTP、0．2μmol／L引物、35ng／μlDNA模板。[结论]最佳的退火温度为52℃：该反应体系的稳定性和可重复性均较好。     

野生大麦ISSR-PCR反应体系的正交优化研究

利用SPSS建立正交试验体系,从Taq酶、Mg2+离子、dNTP、模板、引物的浓度5个水平对大麦ISSR反应体系进行优化,确定了适合大麦的快速高效ISSR反应体系。试验结果表明,在25μl反应体系中各反应成分为:0.5 U Taq酶,1μmol/L Mg2+,0.2μmol/LdNTP,0.3μmol/L引物,50 ng模板DNA。这一反应体系的建立对利用ISSR-PCR进行大麦种质资源的分类和新基因资源的挖掘打下了坚实的基础。     

油茶SSR-PCR反应体系的优化研究

[目的]优化油茶（Camellia oleifera）SSR-PCR反应体系。[方法]应用改良CTAB法提取油茶基因组DNA,采用L16（45）正交设计试验,对影响油茶SSR-PCR反应体系的5个因素（Taq聚合酶浓度、模板浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Mg2＋浓度）在4水平上进行筛选。PCR结果经统计分析软件DPS分析,并对退火温度进行了摸索,确立了油茶SSR-PCR的优化体系。[结果]油茶SSR-PCR的优化体系总体积为20μl,包括Taq聚合酶量为1.0 U/20μl,模板浓度75 ng/20μl,dNTPs浓度为0.15 mmol/L,引物浓度为0.40μmol/L,Mg2＋浓度为1.50 mmol/L,退火温度为50℃。[结论]该研究确定的优化体系可以为油茶资源遗传多样性分析奠定技术基础。     

均匀设计优化杨属的SRAP—PCR反应体系

采用均匀设计方法,对影响杨属SRAP-PCR体系的MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板浓度等因素分别进行了U16(45)和U12(35)两轮优化,建立了适用于杨属的SRAP-PCR反应体系。在25μL反应体系中,MgCl23.5mmol/L、dNTPs0.20mmol/L、引物0.44μmol/L、TaqDNA聚合酶1.50U、模板浓度28ng/L为最适条件。在此基础上又对退火温度进行了摸索,结果发现,扩增结果对退火温度变化不敏感。最后运用优化体系对杨属3派10个种共16个单株的DNA进行扩增验证,结果获得的DNA条带清晰,多态性比较丰富。说明这一优化的SRAP-PCR反应体系可用于杨属不同种间亲缘关系、系统进化和遗传多样性等方面的研究。     

不同配置对辽西玉米‖花生间作系统氮素吸收利用的影响

【目的】通过研究不同配置条件下玉米‖花生间作系统地上部氮含量和吸收量,结合间作系统花生结瘤固氮和土壤有效氮分布,明确不同配置下玉米‖花生间作体系对氮素的吸收利用特征,为玉米‖花生间作氮高效利用模式的区域筛选提供依据。【方法】本试验于2015—2016年在国家农业环境阜新观测实验站进行,设置玉米单作（M）、花生单作（P）、2行玉米4行花生间作（M2P4）和4行玉米4行花生间作（M4P4）模式,玉米单作及每种间作模式下设3种不同玉米种植密度（6、9和12株/m²）,共10个处理,分析不同配置（行比和密度）玉米‖花生间作系统氮素吸收利用特征和优势。【结果】与单作相比,间作玉米和花生植株氮浓度变化并不明显,受作物占地比例影响,间作模式下玉米和花生的产量、氮产量均低于相应单作,且氮产量与间作生物产量表现相一致。玉米‖花生间作可以显著提高系统氮的吸收利用（氮吸收当量比NER>1）,且主要归因于玉米的养分吸收优势（pNER_m为0.63—0.80）。随着玉米行比和密度的增加NER也随之增大,其中M4P4模式（NER 1.06—1.22）的氮吸收要显著高于M2P4模式（NER 1.0—1.06）。在玉米‖花生间作系统中,玉米比花生更有竞争力（A_mp>0）,且竞争吸收氮养分能力也更强（CR_mp>1）,M4P4行比以及玉米增密有助于增强玉米对氮营养的竞争,增加系统氮养分吸收优势（△NU>0）以及间作养分对产量的贡献（C）。与玉米间作可促进花生结瘤固氮,M4P4行比配置下花生根瘤数量、单株根瘤重量和单个瘤重均高于M2P4配置,且以中、低密度处理为优。间作系统中土壤有效氮含量（N_min）表现为花生条带土壤N_min高于玉米条带,且单作花生土壤N_min高于间作花生,而单作玉米土壤N_min低于间作玉米。【结论】玉米‖花生间作可显著提高系统氮的吸收利用,其中玉米对系统氮吸收的贡献较大,适度增加玉米行比和密度有助于增加系统氮素吸收当量比、增强玉米对氮营养的竞争以及间作养分对产量的贡献。综合分析认为,本研究中M4P4-6和M4P4-8为玉米‖花生间作较佳配置,玉米花生种间互作对间作系统干物质量和花生生物固氮的促进,以及玉米在吸收氮养分上的强竞争能力是玉米‖花生间作具有氮素吸收利用优势的重要原因。     

污水土地好氧生物过滤系统反冲洗效果研究

[目的]研究反冲洗对污水土地好氧生物过滤系统的影响。[方法]在流量1.4 m~3/d和曝气量1.8 m~3/h的条件下,以海泊河污水厂初沉池出水为试验进水,系统19 d完成挂膜。在气冲强度13.9 L/(m~2·s),水冲强度0.1 L/(m~2·s)的条件下,研究系统不同反冲洗周期(4、8 d)和反冲洗时间(1、2、4、6 min)下进出水COD和氨氮含量。[结果]4 d周期反冲洗4、2、1 min对系统生物膜破坏较小,平均出水COD含量为76.0 mg/L,出水氨氮含量均在5 mg/L以下,维持系统连续运行28 d。在8 d反冲洗周期中,反冲洗1、2、4 min后平均出水COD含量为93.0 mg/L、氨氮含量为6.8 mg/L,与4 d周期时出水相比略高;反冲6 min后,系统生物膜受到一定程度的破坏,出水COD和氨氮分别上升至130.8和14.1 mg/L,系统恢复需要4 d。[结论]建议对类似系统4~8 d进行1次4 min的反冲洗,如果出现堵塞可进行6 min反冲洗。     

柑橘转基因成分多重PCR检测体系的建立(英文)

[目的]建立柑橘转基因成分的多重 PCR 检测体系。[方法]根据 GenBank 中 pBI121 质粒序列和柑橘(Citrus.)Actin 基因序列,分别设计CaMV35S 启动子、NOS 启动子、NOS 终止子特异引物和 Actin 基因的特异引物,建立能同时检测出 4 种序列的多重 PCR 检测体系,同时通过正交试验确定该体系的最佳引物浓度和比例及 PCR 反应体系中各因素的浓度及反应程序,并对该方法的灵敏度进行验证。[结果]试验得到的最佳MPCR 反应体系为:10×buffer 2.5 μl,25 mmol/L MgCl22.0 μl;dNTP Mixture (2.5 mmol/L each)2.0 μl,10 μmol/L 的 Actin 基因、35S 启动子、NOS 启动子、NOS 终止子引物分别加入 1.0、1.0、1.5、0.5 μl,模板 DNA 0.1 μg,Taq DNA 聚合酶 1.25 U,加 ddH2O 至 25 μl。PCR 反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s,64.1 ℃ 45 s,72 ℃ 50 s,31个循环;72 ℃ 10 min。试验中,经正交优化后的4重PCR反应灵敏度达0.1%。[结论]该研究建立的MPCR检测体系,理论上已能满足柑橘或其深加工产品的转基因成分检测。