基于萤火虫荧光素酶ATP生物发光法灵敏度的研究进展

在工业化制造过程中,对微生物总数的监测至关重要,尤其是在食品、药品、电子和化妆品等产业.基于萤火虫荧光素酶的ATP生物发光法是一种快速、简便的方法.尽管在上述领域中有部分认可,但由于该法存在对环境的敏感性、微生物的检测限偏高、缺乏检测结果RLU的标准等局限性,限制其更为广泛的应用.该研究综合分析了该方法的原理、检测步骤、存在的问题,讨论了通过ATP提取方法、提高荧光素酶活性稳定性、引入扩增体系的研究作为提高方法的灵敏度的切入点,并综述了国内外在此方面的研究进展,为研制更稳定、更精确的生物发光方法提供思路.     

ATP生物发光法在快速检测物体表面清洁度中的应用

[目的]建立一种快速、准确检测物体表面清洁度的方法。[方法]以ATP生物发光微生物检测技术为指导,提取重组的萤火虫荧光素酶并配制成荧光反应试剂,测定其与ATP发光反应值的线性关系;根据ATP含量与细菌数量成正比例关系原理,测定物体表面ATP发光强度值,同时用国标平皿计数法测定其菌落总数,两者对比分析。[结果]ATP生物发光法检测的相对荧光值与物体表面的菌落总数存在良好的线性相关性,利用ATP发光法实时检测细菌总数可以很好地弥补国标法的不足。[结论]ATP生物发光法与传统的细菌总数国标平板计数法相比较具有操作简便、快速灵敏、成本低廉、绿色环保等优点,可以快速、准确地检测物体表面清洁程度。     

生物发光法在农产品安全性检测中的应用前景

综述了发光细菌法急性毒性检测、生物发光法基因毒性检测和生物发光ATP法微生物检测等农产品检测方法的特点和实际应用情况,并经过对比指出其中生物发光法作为一种速度快、操作方便、成本低廉的生物监测方法,将在农产品安全快速检测中有广泛的应用前景。     

生物发光法在农产品安全性检测中的应用前景

综述了发光细菌法急性毒性检测、生物发光法基因毒性检测和生物发光ATP法微生物检测等农产品检测方法的特点和实际应用情况,并经过对比指出其中生物发光法作为一种速度快、操作方便、成本低廉的生物监测方法,将在农产品安全快速检测中有广泛的应用前景。     

ATP生物发光技术快速测定农产品辐照灭菌效果

应用ATP生物发光技术测定待辐照样品的含菌量,从取样到ATP发光强度的测定,整个过程只需1~2 h;样品中细菌ATP的生物发光强度与含菌量之间显著相关。该方法对辐照样品的检测结果是产生了辐照产品的发光强度均高于对照的异常现象,分别从γ射线对ATP的影响、对发光动力学以及发光强度增高的途径等方面对其原因进行了研究,结果表明,发光强度的增加并非由细菌ATP所造成,而是由农产品中含有的细菌经辐照后引起的干扰所致;荧光素酶—荧光素制品中存在的能引起光辐射的物质是形成干扰的另一个方面的原因。     

优化的ATP生物发光法快速检测面粉中细菌总数

[目的]建立一种快速检测面粉中细菌总数的方法。[方法]采用优化的ATP生物发光法检测面粉中的细菌总数,考察D-荧光素（Ln）浓度、萤火虫荧光素酶（FL）浓度、Mg2＋浓度对生物发光反应的影响。[结果]Ln浓度为70 mg/L,FL浓度为50 mg/L,Mg2＋浓度为0.250 0 mmol/L时,ATP生物发光法的测定结果较理想。该法最低检测细菌总数为1.0×103cfu/ml,与传统的平板计数法具有良好的相关性（P〉0.05）,RSD为4.0%。[结论]优化的ATP生物发光法成本低、操作简便、反应迅速、准确可靠,能快速检测出食品中的细菌总数。     

ATP生物发光法快速测定生乳中微生物总数的研究

本试验对ATP生物发光法应用于生乳中微生物检测进行了初步摸索,确定了加体细胞裂解液次数为3次;乳样最佳稀释倍数为20倍;用ATP生物发光法对大批乳样进行检测,同时用国标法进行了平皿菌落培养。结果表明,乳中微生物总数对数与光值对数呈正的直线相关(r=0.9485),相关程度为显著相关(P<0.001)。     

辐照对脱水胡萝卜中微生物ATP生物发光的影响

以脱水胡萝卜为试验材料,经高压灭菌和添加菌液的前处理,研究辐照对脱水胡萝卜中微生物ATP生物发光的影响。辐照处理设5个不同剂量处理,将脱水胡萝卜经高压灭菌后,制成添加菌液的脱水胡萝卜,测量微生物ATP生物发光值。结果显示:脱水胡萝卜初始含菌量较低,当辐照剂量为4.0 kGy时,菌落总数、霉菌和大肠菌群含量均未检出;脱水胡萝卜中微生物ATP生物发光值随辐照剂量的增加而增大,在经高压灭菌的脱水胡萝卜样品中分别添加杂菌、霉菌和大肠菌群后,3种菌的ATP生物发光值随辐照剂量变化的趋势基本相同,都是随辐照剂量的增加呈先降低再增加的趋势;前处理和辐照处理对微生物ATP提取液的本底发光都没有明显影响。     

季铵盐类表面活性剂对细菌ATP提取作用的研究

通过研究几种季铵盐类表面活性剂在ATP生物发光法中不同浓度、不同提取时间对细菌ATP的提取效果,确定了浓度为0．2％的苯扎氯铵（BAC）提取细菌ATP2min,检测发光值效果最佳;与传统的TCA法进行对比,BAC法对细菌ATP的提取率更高。     

利用ATP生物发光法测定西湖水体微生物量

介绍了ATP生物发光法的基本原理和测量方法,将该方法应用于西湖水体微生物量的实际测量,得到西湖水体微生物浓度为106～107个·mL-1,总体分布为近岸高于湖心,夏季高于春季,旅游、垂钓等人为活动对西湖水体微生物的分布有较大影响,另外,饭店养鱼池附近的微生物浓度较高,但对西湖主体并没有明显的影响,引水工程对西湖水体有一定的稀释作用,有利于净化水质.     

快速检测技术在果蔬食品安全控制上的研究应用进展

介绍了目前我国果蔬类食品中存在的主要食品安全问题,综述了化学比色、酶抑制技术、生物传感器、免疫学、分子生物学、生物芯片、ATP生物发光等食品安全快速检测技术在果蔬食品安全控制上的研究应用现状及发展趋势。     

纳米荧光素酶的表达、纯化及性质鉴定

由荧光素酶(luciferase)催化的一大类发光反应被统称为生物发光(bioluminescence),该反应具有背景低、灵敏度高、线性范围广等特点,是高灵敏检测的发展方向之一。课题组在近期的研究中全基因合成了一种纳米荧光素酶(nano luciferase),研究清楚了其理化性质的基础上,将其作为一种新型的生物发光检测工具。将荧光素酶基因克隆至原核高表达载体上,通过自动诱导系统进行了表达。通过Ni-NTA亲和层析纯化和分子筛将重组纳米荧光素酶进行纯化,其产量可稳定达到每升菌25.3 mg,纯度超过98%;通过酶活实验鉴定了纳米荧光素酶的活性,在1.0×10~(-4)~1.0×10~(-7)mg/m L的范围内,该酶均具有良好的线性反应,其线性检测下限低至1.0×10~(-7)mg/m L(约5pmol)。纳米荧光素酶具有灵敏度高、数据重复性好、操作简便、稳定性高、易于保存等多重优点,可利用其作为基础平台,开发具有应用前景的超灵敏新型生物发光探针。     

试分析食品工程中ATP生物发光技术的应用

随着科学技术的快速发展以及食品检测技术的不断进步,AIP生物发光技术在食品检测领域得到不断普及和推广。本文以ATP生物发光原理以及特点作为出发点,分析了ATP技术在食品生物检测中的应用以及在RMDS系统中的应用,以期为不断推广ATP生物发光技术提供一些参考和意见。     

牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测

【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763~-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763~-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。     

低温保存对4种作物种子ATP含量与种子活力的影响

对低温保存不同年份小麦、大豆、玉米、水稻种子的发芽率和发芽势进行测定,利用荧光素酶-荧光素生物发光法结合标准ATP样品曲线对相应作物种子的ATP含量进行测定,之后再用DPS软件对ATP含量与发芽势数据进行回归分析。结果表明:4种作物种子的发芽率和发芽势均随保存时间延长而降低,其中发芽势降低更为明显;同一品种不同保存年限的种子ATP含量差异明显,即随着保存年限的延长,ATP含量明显降低;大粒种子前期降低速率快后期相对平缓,小粒种子一直呈平缓降低状态;利用DPS软件对4种作物种子的ATP含量与发芽势数据进行回归分析,显示其回归系数均达到显著或极显著水平。因此可通过ATP含量测定结果有效预测作物的种子活力。     

3种肺癌肿瘤模型活体成像的系统优化与技术研究

通过优化荧光素酶的生物发光及荧光发光报告体系,结合光谱拆分技术,进一步提高活体成像技术在肿瘤检测中的灵敏性,并探寻肿瘤监测成像的最佳方法.利用建立的肺癌肿瘤转移模型、肺癌原位肿瘤模型和肺癌皮下肿瘤模型等小鼠肿瘤模型,并用小动物活体成像仪对这3种肿瘤模型小鼠进行荧光成像和生物发光成像比较.结果 表明:毛发对活体成像有干扰,且对荧光成像影响较大.在小鼠肺癌转移模型和原位肿瘤模型中,荧光成像自发荧光高,信噪比低,适合用生物发光进行研究,但利用光谱拆分技术能有效去除自发荧光,可得到与生物发光成像相似的结果;而在小鼠肺癌皮下肿瘤模型中,荧光成像即可满足对肿瘤连续、动态的监测.总体而言,利用光谱拆分技术可实现荧光成像对体内不同肿瘤模型的监测.     

脱水香菇细菌污染的生物发光快速检测试验

利用ATP生物发光分析技术对脱水香菇细菌污染情况进行了快速检测试验。结果表明,非细菌ATP因发光强度对总体发光强度的影响小于0.9%,可忽略不计;采取Tris/EDTA加热法提取细菌ATP,提取时间确定为90 s;整个检测过程可在1～2h内完成,与标准的细菌培养方法有良好的相关性,且不需要复杂的设备,可用于食品的快速筛选和现场检测,是一项值得广泛推广应用的新技术。     

航空煤油污染微生物检测方法

航空煤油的微生物污染严重威胁其储存安全和飞机的飞行安全,其准确检测尤为重要。介绍了目前应用于航空煤油污染微生物的主要检测方法,包括传统微生物培养法、分析化学法、分子生物学法及间接检测法等,不同的检测方法在实际应用中各有利弊。存储状态下的航空煤油中存在大量的污染微生物,应联合应用多种检测方法,以得到准确的污染微生物信息。     

基于核酸适配体-荧光染料EvaGreenTM快速检测ATP的研究

目的利用荧光嵌入染料EvaGreenTM在单双链DNA溶液中不同的荧光性质构建基于核酸适配体的ATP检测体系,建立一种简单、高效的检测ATP的新方法。方法利用ATP核酸适配体双链DNA(dsDNA)和核酸绿色荧光染料Eva GreenTM嵌合作用,实现了对ATP的检测。考察了ATP的孵育温度、pH、浓度等因素对荧光强度的影响,并对该方法的特异性进行了验证。结果反应体系在12℃,pH 7.5条件下具有最佳实验效果,在最优条件下,最低能检测10-6mol/L的ATP,并具有较高的特异性。结论本研究为ATP的快速检测提供了一种易于操作、低成本的新方法。 更多还原     

不同来源ATP表征冷鲜羊肉新鲜度

【目的】通过系统研究冷鲜羊肉不同来源的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP。包括肉中ATP、微生物ATP、肉表面ATP）在贮藏期间的变化规律,筛选能够表征冷鲜羊肉新鲜度变化的ATP指标,构建菌落总数和挥发性盐基氮预测模型,探究冷鲜羊肉新鲜度的预测新方法。【方法】以小尾寒羊背最长肌为试验材料,在空气密封包装0℃条件下分别贮藏0、1、3、5、7、9、11、13、15、17和21 d,分析冷鲜羊肉贮藏期间新鲜度指标（pH、色泽、挥发性盐基氮、菌落总数）与3种来源ATP（肉中ATP、微生物ATP、肉表面ATP）的变化,利用数据统计评价不同来源ATP的变化规律,并构建新鲜度指标的预测模型。【结果】冷鲜羊肉贮藏期间新鲜度指标菌落总数、挥发性盐基氮均呈现上升趋势,并均在贮藏17 d时超过国家标准限值;肉中ATP呈现不断下降趋势,微生物ATP与肉表面ATP均呈现上升趋势,与新鲜度指标变化趋势保持一致;冷鲜羊肉贮藏期间,肉中ATP、微生物ATP、肉表面ATP含量与菌落总数、挥发性盐基氮的相关系数（R）分别为-0.399、0.910、0.943和-0.357、0.725、0.907。肉表面ATP预测冷鲜羊肉菌落总数的最优模型为Boltzmann拟合模型,其公式为TVC（lg cfu/g）=7.649-4.069/(1+exp(x-5.807)/0.632)（R ²=0.903,P<0.001）,肉表面ATP预测冷鲜羊肉挥发性盐基氮的最优模型为Expedc1拟合模型,其公式为TVB-N（mg/100 g）=2.493*exp(x/3.745)+3.057（R ²=0.888,P<0.001）。【结论】本研究明确了冷鲜羊肉表面ATP与菌落总数、挥发性盐基氮存在显著正相关性,确证了肉表面ATP可以作为冷鲜羊肉新鲜度表征指标;并构建了菌落总数和挥发性盐基氮最优预测模型,为冷鲜羊肉新鲜度快速检测提供了新的思路。