七彩山鸡养殖场铜绿假单胞菌的耐药性、多位点序列分型及遗传进化分析

【目的】探究广东省七彩山鸡养殖场中铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa的流行特点、耐药性、多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)及遗传进化背景,为临床合理用药提供参考。【方法】从广东省3个规模化七彩山鸡养殖场收集孵化死胚及周围环境样本进行铜绿假单胞菌的分离鉴定,采用K-B纸片扩散法测试其对22种抗菌药物的敏感性,利用MLST分析铜绿假单胞菌分离株的分子流行特点。将各ST型的7个管家基因序列按顺序拼接,用MEGA7软件对拼接好的序列进行遗传进化分析。【结果】在采集的514份样本(死胚样本405份、环境样本109份)中共分离到铜绿假单胞菌145株(分离率28.2%),其中,24株来源于环境样本(分离率22.0%,24/109),121株来源于死胚样本(分离率29.9%,121/405)。145株铜绿假单胞菌除对氨苄西林、卡那霉素和萘啶酸天然耐药外,对复方新诺明、氯霉素和四环素的耐药性较强,耐药率分别为100%、80.0%和77.2%,其次为头孢噻肟(耐药率23.4%)。除天然耐药外,多重耐药的铜绿假单胞菌占比达73.1%(10...     

圈养林麝养殖场内铜绿假单胞菌的分布及其耐药性分析

从陕西镇坪、四川宝兴两个林麝养殖中心共采集124份样品进行铜绿假单胞菌的分离鉴定,并采用微量肉汤稀释法检测其耐药情况。结果显示,共分离出60株铜绿假单胞菌,其中镇坪34株,宝兴26株。两个养殖场铜绿假单胞菌检出率由高到低依次为伤口脓汁>死亡林麝组织器官>伤皮>鼻拭子>土壤>粪便>尿液>空气,且镇坪比宝兴的总检出率高。所分离的60株铜绿假单胞菌耐药表型趋于一致,都对阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星敏感,对亚胺培南中等敏感,对多西环素、四环素、磺胺异恶唑严重耐药。     

一株山羊源2型溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】分离鉴定四川某规模化山羊场引起山羊大规模呼吸道疾病和死亡的病原菌,并分析其致病和耐药机制。【方法】将病原分离纯化后,依次进行生化试验、小鼠致病性试验、药敏试验、16S rRNA序列分析及荚膜血清分型,并通过全基因组测序对分离菌株进行物种分型以及基因功能分析。【结果】从病死山羊鼻液、气管、肺脏和肝脏中分离出同一种菌,经鉴定为荚膜血清2型的溶血性曼氏杆菌,命名为MHLB002;对小鼠的LD50值为4.4×107 CFU/mL;药敏试验结果表明:该溶血性曼氏杆菌对头孢类、β-内酰胺类、磺胺类和喹诺酮类药物敏感,对部分大环内酯类和氨基糖苷类药物耐药;全基因组序列分析显示该菌基因组大小为2 580 488 bp,序列类型为ST-43,与MH1475菌株同源性最近,且2菌株基因组ANI值达98.60%;MHLB002菌株全基因组中共有19个ORF编码与致病性相关的基因,9个ORF编码耐药基因。【结论】本试验所分离出的荚膜血清2型溶血性曼氏杆菌,是引起该养殖场山羊大规模呼吸道疾病和死亡的致病菌,同时为预防和治疗山羊溶血性曼氏杆菌病提供理论依据。     

猪源肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定及致病性

【目的】从临床病死仔猪体内分离肠外致病性大肠杆菌,研究猪群中流行菌株的毒力基因分布、耐药性、致病性情况.【方法】病死仔猪肠外组织分离大肠杆菌,然后进行16S rDNA PCR测序鉴定、种系发育分群、毒力基因检测、抗菌药物的药敏试验、小鼠致病性试验、全基因组测序验证.【结果】共筛选到30株猪源肠外致病性大肠杆菌,其中A群4株、B1群15株、B2群5株、D群6株;毒力基因检测结果发现vaT、iutA、kpsMII、hlyD基因检出率分别为70.0%、33.33%、23.33%、20.0%;药敏试验结果显示:菌株都对多粘菌素B较敏感,对氨苄西林、林可霉素、杆菌肽以及利福平的耐药率为100%;获取了Ex-P27菌株基因组序列图谱,构建了该菌株基因组圈图.【结论】肠外致病性大肠杆菌分离株主要分布在B1群,对氨苄西林、林可霉素、杆菌肽以及利福平均耐药,为指导猪源肠外致病性大肠杆菌的防治与临床用药提供依据.     

2株林麝肺源铜绿假单胞菌毒力及致病性比较

【目的】比较表型差异的林麝肺源铜绿假单胞菌ZP-1株（不产绿脓菌素）和BX-1株（产绿脓菌素）的毒力表达情况以及在小鼠急、慢性肺部感染时的致病性,为林麝化脓性肺炎的治疗与防控提供依据。【方法】比较ZP-1株和BX-1株的毒力因子表达差异,利用无创式气管插管滴注和制备琼脂糖包埋株的方法,建立ZP 1和BX 1株的小鼠急、慢性肺部感染模型,并检测小鼠急性、慢性感染肺脏残留铜绿假单胞菌数、白细胞总数和细胞因子含量,观察病理组织学变化。【结果】在体外培养条件下,ZP-1株的脓青素和胞外多糖表达量显著高于BX-1株（P<0.05）;BX-1株的胞外蛋白酶（LasA、LasB）活性高于ZP-1株,但二者差异不显著（P>0.05）;BX-1株鼠李糖脂表达量显著高于ZP-1株（P<0.05）;ZP-1株与BX-1株的脂多糖结构具有明显差异,特别是核心多糖处。小鼠急性肺部感染12 h时,ZP-1组小鼠肺组织铜绿假单胞菌残留数、白细胞总数和细胞因子水平均高于BX-1组小鼠;感染24 h时,BX-1组小鼠IL-1β、IL-6含量超过ZP-1组。随着慢性肺部感染时间的延长,ZP-1组和BX-1组小鼠肺组织铜绿假单胞菌残留数、白细胞总数和IFN-γ含量均逐渐降低,IL-1β和IL-6含量均逐渐升高;除感染后第3天外,其余感染时间段ZP-1组小鼠肺组织白细胞总数均高于BX-1组;除感染后第14天外,其余感染时间段ZP-1组小鼠肺组织IL-1β、IL-6含量均高于BX-1组;在同一感染时期ZP-1组和BX-1组小鼠肺组织IFN-γ含量无明显差异。【结论】林麝肺源铜绿假单胞菌ZP-1株对肺部感染的小鼠致病性更强。     

貂源铜绿假单胞菌耐药性及生物学特性

为了解貂源铜绿假单胞菌流行株基本特性,对分离的20株铜绿假单胞菌进行药物敏感性试验、血清型鉴定、ToxA基因检测、强毒株筛选及绝对致死量(LD_(100))测定。结果表明,铜绿假单胞菌分离株耐药现象比较严重,对氨苄西林、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻吩、头孢噻肟、头孢西丁、头孢唑林和四环素不敏感,对妥布霉素敏感率为95%;铜绿假单胞菌分离株的血清型为G型和B型,分别占85%和15%;20株铜绿假单胞菌均能检测出毒素基因ToxA;小鼠致死性试验表明,铜绿假单胞菌分离株之间毒力差异很大,少数菌株如ZHDL9、ZHDL6等均表现出较强的毒力。以菌株ZHDL9为代表株建立小鼠鼻腔感染模型,采用建立的感染模型测定得菌株ZHDL9对小鼠的LD_(100)为5×10~7 cfu。由此可见,分离的20株铜绿假单胞菌对临床常用抗生素耐药严重,对妥布霉素的敏感率为95%,提示该种抗生素可用于临床治疗水貂出血性肺炎,而菌株ZHDL9可作为生物制品研发的候选菌株。     

林麝肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及其kp05372基因的生物信息学分析

【目的】对1株疑似肺炎克雷伯氏菌进行分离鉴定及全基因测序分析,并对发现的新基因kp05372编码产物进行生物信息学分析。【方法】采用传统的细菌鉴定方法和分子生物学方法,分别对采自麝粪便的1株病原菌的生理生化特征及16SrRNA序列进行测定;以小鼠感染试验和半数致死量(LD50)测试该病原菌的致病性;用全基因组测序方法对病原菌基因组进行测序分析,并对发现的新基因编码产物进行生物信息学分析。【结果】经生理生化试验和16SrRNA序列分析发现,分离菌株为肺炎克雷伯氏菌,命名为GPKP,其对小鼠致死的LD50为6.3×107CFU/mL。该菌基因组大小为4 879 707bp,包含5 490个开放阅读框,共注释到22组COG功能。kp05372基因编码产物由302个氨基酸组成,无信号肽,是一种不稳定的、在细胞内发挥生理作用的亲水性蛋白。【结论】分离的细菌为肺炎克雷伯氏菌,kp05372基因编码产物属于典型的LysR家族转录因子(LTTR)。     

2株猪圆环病毒2型的分离鉴定及全基因组序列分析

【目的】对河南部分地区疑似猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染猪进行病毒分离鉴定,并对分离株的全基因组序列进行分析。【方法】对郑州、焦作两地疑似PCV2感染的猪淋巴结、脾脏和肺脏组织进行PCR检测,对检测为阳性的病料进行PCV2的分离,利用间接免疫荧光试验和PCR扩增进行初步鉴定。用PCR扩增PCV2全基因,经克隆、测序后,用MEGA5.1软件对克隆的序列与GenBank上获取的其他PCV2全基因组进行序列比对。【结果】分离到2株病毒,分别命名为ZHENGZ-12株和JIAOZ-12株。间接免疫荧光试验结果显示,感染病毒的细胞出现了特异的亮绿色荧光。2个分离株全基因组长度均为1 767bp,与国内外PCV2参考毒株核苷酸序列同源性为92.6%~99.9%,2个毒株之间的核苷酸序列同源性为96.0%,与PCV1核苷酸序列同源性分别为74.6%和77.7%。系统进化树分析结果显示,2个PCV2分离株同国内外分离株的亲缘关系很近;PCV2核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性。【结论】初步证实分离病毒为PCV2,ZHENGZ-12株基因型为PCV-2a,JIAOZ-12株基因型为PCV-2b。     

景天三七对多重耐药铜绿假单胞菌的抑菌作用

目的研究景天三七醇提物和水提物对多重耐药铜绿假单胞菌的体外抗菌作用。方法采用试管稀释法测定景天三七醇提物和水提物对20株临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果景天三七醇提物和水提物对20株临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌有不同程度的抗菌作用,醇提物对铜绿假单胞菌的MIC50为0.125g.mL-1,水提物对铜绿假单胞菌的MIC50大于0.5g.mL-1。结论景天三七醇提物体外对铜绿假单胞菌有较强的抗菌作用。     

铜绿假单胞菌噬菌体裂解酶LysYH6的表达与活性

以耐药性铜绿假单胞菌为宿主菌分离并筛选出1株烈性噬菌体YH6,根据电镜下的形态特征,YH6为短尾噬菌体家族的成员。通过对YH6的全基因组序列测定和分析,确定了其裂解酶基因,并通过原核表达获得了噬菌体的裂解酶Lys YH6。菌落计数及浊度下降法表明:该裂解酶在EDTA(25 mmol/L)存在的条件下对铜绿假单胞菌表现出了显著的抑菌活性。具有抑菌活性裂解酶Lys YH6的获得为治疗和预防耐药性铜绿假单胞菌引起的感染开辟了新思路。     

4种蝴蝶雄性生殖系统形态学研究

【目的】明确4种蝴蝶雄性生殖系统的形态学结构。【方法】将新鲜标本剪下腹部,在Motic SMZ168-BL型显微镜下观察解剖,用Q Imaging Retiga 2000R(CCD)显微成像系统照相,采用Montage图像叠加软件进行图像处理。【结果】描述了4种蝴蝶的雄性生殖系统,其中外生殖器的差异主要表现在囊形突、钩突、背兜、阳基轭片等上,而内生殖器的主要差异表现在精巢、复射精管、单射精管及附腺上。【结论】4种蝴蝶雄性生殖系统的各部分结构特征存在较大差异。     

新疆南疆部分地区3种璃眼蜱的分子生物学鉴定

旨在对新疆南疆部分地区璃眼蜱属的蜱进行分子生物学鉴定,了解其分布情况。采集新疆南疆部分地区蜱,通过形态学鉴定将璃眼蜱属蜱作为样本,通过12SrDNA和16SrDNA基因扩增、测序及序列分析进行蜱种类鉴定。13个采样点共559只璃眼蜱属蜱,鉴定为3种,分别为小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱。     

两株白粉寄生孢的生物学特性比较

对L9和L3两个白粉寄生孢菌株的生物学特性研究表明,它们的生长适温为10～30℃,其中最适生长温度分别为25℃和20℃;适宜生长的pH为4～10,其中最适pH均为8.有利于L9菌株菌落生长的碳、氮源分别为可溶性淀粉、乳糖和牛肉膏;有利于L3菌株菌落生长的碳、氮源分别为葡萄糖、乳糖和蛋白胨;改良查氏培养基有利于两者菌落的生长.     

摘除眼柄与注射眼柄粗提物对凡纳滨对虾性腺发育相关基因表达的影响

利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。     

两种药用植物残渣堆肥浸提液对黄瓜3种病害防治效果

通过室内孢子萌发试验和盆栽试验测定了药用植物砂地柏和马齿苋残渣堆肥浸提液对黄瓜灰霉病、霜霉病和炭疽病的活性.孢子萌发试验结果表明,马齿苋残渣堆肥浸提液对黄瓜灰霉病菌和炭疽病菌孢子萌发具有显著的抑制作用,抑制率分别达到78.69%和60.28%,对黄瓜霜霉病菌孢子萌发的抑制效果较差;砂地柏残渣堆肥浸提液对黄瓜炭疽病菌孢子萌发具有显著抑制作用,抑制率达到59.75%,对其他两种病原菌孢子萌发的抑制效果较差.盆栽试验结果表明,两种药用植物残渣堆肥浸提液对黄瓜3种病害的防治效果随浸提液含量的增加而增大,当使用浸提液原液时,砂地柏残渣堆肥浸提液和马齿苋残渣堆肥浸提液对黄瓜灰霉病的防治效果最好,保护和治疗效果分别为66.30%、61.02%和78.72%、76.75%,其次为黄瓜霜霉病,对黄瓜炭疽病的防治效果较差.     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00 cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033 bp,其完整开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14 kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域;与大麦的亲缘关系最近,其次是与乌拉尔图小麦,与水稻最远。4)亚细胞定位结果表明,该基因定位在细胞核内。5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比,软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调,而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著;且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’(P<0.01)。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR与该基因表达量模式相似。综上,青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守;该基因定位在细胞核内,符合转录因子特性;HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR相似,在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。     

瑞香狼毒对菜粉蝶生物活性的研究

采用叶蝶法、夹毒法和点滴法，测定了瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.)提取物对菜粉蝶（Pieris rapae L.)的生物活性。结果表明，这些提取物对菜粉蝶5龄幼虫具有很强的拒食、胃毒、生长抑制作用，但是其触杀作用较差。根乙醇粗提物（简称SCEE）对菜粉蝶5龄幼虫24h的AFC50（拒食中浓度）为381.28μg/mL；胃毒作用的LD50（致死中量）为22．42μg/头；其浓度为500μg/mL时，处理2d后幼虫的体重为49．38mg,7d后的校正死亡率为100％。氯仿萃取物浓度为300μg/mL时，处理24h后，对菜粉蝶5龄幼虫的拒食率分别为93．58％，7d后幼虫的死亡率为82．76％。当瑞香亭、伞形花内酯与狼毒色原酮的浓度为500μg/mL时，处理24h后，它们对菜粉蝶5龄幼虫的拒食率分别为80．45％、83．79％和70．03％，7d后幼虫的死亡率分别为75．87％、79．31％和65．52％。SCEE对菜粉蝶5龄幼虫触杀作用LD50的值为52．48μg/头。     

Cloning and Analysis of the Promoters of Two OsRhoGDIs Genes from Rice

OsRacD, belonging to rice （Oryza sativa L. ssp. japonica） Rho family of the small GTPases, is a pivotal gene involved in rice photoperiod fertility conversion of photoperiod sensitive genic male sterile rice which influences the rice fertility via controlling the pollen tube growth. Using OsRacD as bait, two GDP dissociation inhibitor genes designated as OsRhoGDI1 and OsRhoGDI2 were screened by yeast two-hybrid system. To further study the regulation mechanism of OsRhoGDIs, and also the relationships between OsRhoGDIs and OsRacD, the upstream regulation sequences of OsRhoGDI1 and OsRhoGDI2 were cloned by PCR, and the cis-elements in the promoters were predicted using internet tools in this study. The results showed that there were several kinds of response elements, such as phytohormone response elements, lightregulated elements and adversity induced elements in the promoters of OsRhoGDIs, some of which were similar. Comparing with the promoter of OsRacD, several pollen tube germination related elements were found. On one hand, the expression and regulation mechanism of OsRhoGDIs were complex, they may be regulated by several signaling pathways commonly, and the regulation mechanisms were similar to some extent. On the other hand, it was suggested that the fertility of photoperiod sensitive genic male sterile rice may be controlled by the cooperative expression of OsRhoGDIs and OsRacD.     

孟加拉鲥、美洲鲥和中国鲥形态学比较分析

观察、解剖107尾孟加拉鲥Tenualosa ilisha、美洲鲥Alosa sapidissima和中国鲥Tenualosa reevesii,详细记叙了孟加拉鲥外部形态和内部结构,运用传统形态学方法比较分析了3种鲥鱼的形态差异.三者形态7项可量性状比值的聚类分析结果显示,孟加拉鲥和中国鲥先聚为一类,再和美洲鲥聚为一类,这与它们的分类地位相一致.外观上,孟加拉鲥臀鳍鳍条短,被1层薄鳞覆盖;美洲鲥的纵列鳞数及体长/体高、体长/头长都大于其他2种鲥鱼.可数性状上,第一外鳃弓鳃耙和脊椎骨数目能明显区分3种鲥鱼.孟加拉鲥、中国鲥和美洲鲥的第一外鳃弓鳃耙数分别为181～219+153～224、95～131+170～175和24～31+47～55;脊椎骨数分别为46～48、37～39和55～57.在内部结构上,根据胃的形状、盲囊部的大小、幽门垂的长短和数量、肠道的弯曲数目及相对长度可以准确鉴定这3种鲥鱼.孟加拉鲥肠道最长,中国鲥次之,美洲鲥肠道最短.3种鲥鱼在消化道结构的差异,预示食性已产生分化.     

扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin部分片段克隆及不同体节mRNA转录水平分析

旨在初步了解丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用。采用分子克隆获得扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因部分片段,应用MEGA软件对其进行进化分析。同时以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异,最终克隆获得749bp的serpin基因片段。进化分析表明,扩展莫尼茨绦虫serpin基因与多方棘球蚴serpin基因有较近的亲缘关系。标准曲线分析显示,serpin和beta-Tubulin基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时试验结果显示,serpin基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异,从高到低依次为孕节、头节、成节、幼节。由此初步推测,此基因可能在扩展莫尼茨绦虫虫卵发育为六钩蚴的过程中发挥一定作用。