大肠杆菌不耐热肠毒素A、B亚单位基因双价植物表达载体的构建

不耐热肠毒素LT是肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic E．coli，ETEC）分泌的一种热不稳定性肠毒素，由A、B两种亚单位组成的AB5型杂六聚体蛋白，是目前人们发现的最强有力的粘膜免疫原和粘膜免疫佐剂之一。本研究利用基因工程技术，从强致病菌株K88ac中，分别克隆了LTA和LTB基因，并利用高效植物表达载体pBI121、pBLG和pCAMBIA2300成功构建了带有内质网滞留信号RDEL／KDEL不耐热肠毒素A、B哑单位基因双价植物表达载体pCAMBIA2300-LTA—LTB。为研究LT全毒素在植物中的正确组装及进一步构建带有保护性抗原类全毒素嵌合植物疫苗奠定基础。     

非预增菌可视化快速检测食品中肠毒素大肠杆菌K88的研究

本研究运用肠毒素大肠杆菌K88(E.coli K88)特异的适配体结合纳米金和银增强技术,建立了E.coli K88一种可视化快速检测技术,实现约2 h检测E.coli K88达10 CFU/反应的灵敏度。通过人工模拟E.coli K88污染25 g蔬菜、牛奶或猪肉等食品原料,采用该可视化快速检测技术进行非预增菌直接检测,结果显示检测灵敏度达100 CFU/m L(或g),检测需时约2 h,在1.0×102~1.0×105CFU/m L(或g)的E.coli K88污染浓度范围内,样品A630nm吸光值与目标菌污染浓度对数值呈线性关系,相关系数R20.97以上。研究结果表明,E.coli K88可视化检测方法可用于食品样品E.coli K88污染非预增菌的快速、灵敏检测分析。     

凋亡素原核表达及纯化

为进一步研究凋亡素结构与功能和制备凋亡素单克隆抗体,本试验构建了凋亡素的原核表达载体pET-28a-VP3,并将该质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白.结果证明在E.coli BL21中正确表达了凋亡素,同时对表达蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示在1.4 kD处出现目的蛋白带与预期相符.     

重组人ICOS胞外区原核表达载体的构建及表达

构建重组人ICOS胞外区原核表达载体,并进行初步表达.根据GenBank基因库中ICOS胞外区基因序列设计引物,用RT-PCR法从人T淋巴瘤细胞Jurkat的总mRNA中扩增出ICOS胞外区基因并运用重叠延伸PCR技术扩增出ICOS胞外区同源二聚体,并将ICOS胞外区同源二聚体插入到原核表达载体PET-28a中,并对重组质粒进行鉴定.转化E.coli BL21,IPTG诱导表达目的蛋白.结果获得ICOS胞外区同源二聚体基因大小为757bp,构建的重组表达载体中目的基因序列完全正确.IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析表明目的蛋白在E.coli BL21(DE3)中高效表达,相对分子质量约为31ku.这说明成功地构建人重组ICOS胞外区同源二聚体的原核表达载体,并实现在大肠杆菌中大量表达.为下一步蛋白纯化及制备抗ICOS单克隆抗体奠定了基础.     

牛生长激素基因工程菌的构建及其诱导表达

为获得牛生长激素(BST)蛋白,构建了工程菌并进行了诱导表达.先设计2对引物,从pUCm-T-BST克隆中扩增出BST成熟蛋白编码序列,双酶切后分别插入表达载体(pET30 a和pET29 a),转化E.coliDH5α并进行阳性克隆鉴定;再将重组质粒分别转化到E.coliBL21(DE3)和RosettaTM(DE3)pLysS中,构建BST原核工程菌;最后进行诱导表达.结果表明,重组表达载体pET30 a-BST和pET29 a-BST中均插入了正确的目的基因;经IPTG诱导后,以BL21(DE3)为宿主的工程菌无目的蛋白表达,而pET30 a-BST/RosettaTM和pET29 a-BST/RosettaTM分别可见分子量约29.5,26.5 kD的融合蛋白表达,约占菌体蛋白的26%,35%.说明稀有密码子限制BST基因在E.coli中的表达,选择适宜的宿主菌可克服此障碍.     

磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达

[目的]检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达.[方法]根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以E.coliJM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]通过PCR扩增得到约1 100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27;的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7- C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带.[结论]重组表达载体转化后E.coli BL21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明 serC基因在E.coli BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础.     

牛生长激素基因工程茵的构建及其诱导表达

为获得牛生长激素（BST）蛋白，构建了工程菌并进行了诱导表达．先设计2对引物，从pUCm—T-BST克隆中扩增出BST成熟蛋白编码序列，双酶切后分别插入表达载体（pET30a和pET29a），转化E．coli DH5a并进行阳性克隆鉴定；再将重组质粒分别转化到E．coli BL21（DE3）和RosettaTM（DE3）pLysS中，构建BST原核工程菌；最后进行诱导表达．结果表明，重组表达载体pET30a—BST和pET29a—BST中均插入了正确的目的基因；经IPTG诱导后，以BL21（DE3）为宿主的工程菌无目的蛋白表达，而pET30a—BST／Rosetta^TM和pET29a．BST／Rosetta^TM分别可见分子量约29．5，26．5kD的融合蛋白表达，约占菌体蛋白的26％，35％．说明稀有密码子限制BST基因在E．coli中的表达。选择适宜的宿主菌可克服此障碍．     

鸡传染性贫血病毒VP1基因的原核表达

根据GenBank上公布的鸡传染性贫血病毒VP1的基因序列设计一系列引物,通过基因扩增得到了鸡传染性贫血病毒(CAV)VP1基因的全长片段和一系列不同N末端截断的VP1基因片段,分别将这些片段插入表达质粒载体pET28a的多克隆位点上,构建成4种重组表达工程菌(E.coli BL21/pET-28-CAVVP1、E.coli BL21/pET-28-CAVVP1Nd29、E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56、E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd137),研究了4种不同长度VP1片段在重组大肠杆菌中的表达,并通过SDS-PAGE电泳筛选最佳表达方式。结果表明:E.coli BL21/pET-28-CAVVP1Nd29能表达分子质量为44ku的可溶性蛋白,E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56能表达分子质量为40ku的不可溶性蛋白,而在E.coli BL21/pET-28-CAV VP1和E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd137的诱导表达产物中未见明显的表达蛋白出现。其中可溶性的CAV VP1Nd29蛋白将有可能用于研制CAV诊断抗原和亚单位疫苗研究。     

人核糖体40S亚基RPS11蛋白的原核表达和纯化

RPS11是核糖体小亚基40S的组成部分,属于核糖体蛋白S17p家族,由RPS11基因所编码,主要存在于真核生物中。本研究通过PCR扩增RPS11基因,构建pET43a-RPS11和pGEX-4T-1-RPS11原核表达载体。将重组质粒转入E.coli DH5α,序列测定正确后,将其转入E.coli BL21(DE3),加入IPTG诱导表达。表达蛋白经SDS-PAGE分析后,利用亲和层析法纯化蛋白。结果成功克隆RPS11基因,构建了原核表达载体pET43a-RPS11和pGEX-4T-1-RPS11,转化宿主菌E.coli BL21(DE3)中进行了表达。SDS-PAGE分析证实表达目的蛋白正确。通过Ni-TNA和GSH-Sepharose层析柱获得纯化蛋白,为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。     

产肠毒素大肠杆菌k88ac基因原核融合表达载体的构建

利用PCR技术扩增出菌毛K88ac基因片段,并将其插入到原核表达载体pET32a( )的多克隆位点上。测序结果表明:与Genbank中序列比对同源性达到99%以上,成功构建了原核表达载体。为进一步的研究工作,奠定了基础。     

大肠杆菌K88菌毛蛋白faeG亚基基因克隆及表达

利用PCR技术,从致仔猪黄痢的大肠杆菌中扩增不含信号肽序列的K88菌毛蛋白faeG亚基基因片段,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,构建该基因的原核表达载体pGEX-FaeG,通过测序证明序列正确后,导入大肠杆菌BL21,得到工程菌株PGEX-FaeG。IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,融合蛋白（约53ku）在大肠杆菌BL21中得到高效表达,表达产物约占菌体蛋白的35％,免疫印记结果表明此融合蛋白与K88单抗反应。     

刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3的克隆与原核表达

根据Genbank中编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术对刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3进行克隆、表达及鉴定.结果表明:克隆的MIC3基因的开放阅读框与Genbank收录的MIC3基因在核菌酸和氨基酸水平上高度一致,说明弓形虫MIC3蛋白的高度保守性;构建的原核细胞表达质粒PET-MIC3表达产物分子量为46 ku,且经Western-blot显示可被猪抗弓形虫免疫血清识别.     

小鼠Nanog基因原核表达载体的构建及表达

【目的】构建小鼠Nanog基因原核表达载体并进行表达，以期得到大量GST融合蛋白。【方法】根据GeneBank中的Nanog序列及pGEX-KG中的多克隆位点设计引物，以含有Nanog基因片段的pNA992重组质粒为模板，经PCR扩增出918 bp的DNA片段。将所得片段与pGEX-KG载体连接，转化TGⅠ大肠杆菌，筛选阳性克隆，其扩增片段测序结果与原序列一致，表明原核表达载体pGEX-KG-Nanog已构建成功。提取pGEX-KG-Nanog质粒转化到BL21（DE3）表达菌株中，经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定，并优化其表达条件。【结果】在大肠杆菌中获得Nanog基因融合表达，主要以包涵体形式存在；融合蛋白的分子量为63 kD；以IPTG终浓度为0.8 mmol•L-1，诱导5 h后融合蛋白产量最高。【结论】小鼠Nanog基因在大肠杆菌中获得了高效表达，为今后Nanog蛋白的多克隆抗体制备奠定基础。     

H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在原核系统中的表达

应用带有His6尾的pET原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达,将禽流感A/Turkey/Wisconsin/66(HgN2)的HA基因克隆至原核表达载体pET-30a中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入,并且阅读框正确,获得重组质粒pET30a-H9.将此重组质粒转化到宿主菌BL21中,用诱导剂异丙基硫代...     

抗菌肽MagaininⅡ的原核表达与抗菌活性分析

根据MagaininⅡ氨基酸序列,选用大肠杆菌偏爱密码子,化学合成了2个DNA片段,利用重叠区互补PCR法得到MagaininⅡ的基因序列.构建了融合表达载体pET21 b-MagaininⅡ,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,在5.1 kD处可见目的蛋白条带,...     

产肠毒素大肠杆菌F5菌毛基因的克隆与表达

应用PCR方法从产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)中扩增出不含信号肽序列的F5菌毛抗原基因片段,克隆测序后将其连接到大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,转化工程菌BL21,经IPTG诱导表达。经SDS-PAGE和Western Blot分析,重组蛋白在BL21中得到表达并与F5菌毛单因子血清发生明显反应。     

苦瓜核糖体失活蛋白MAP30基因的克隆及原核表达

以载有银田牌长白苦瓜MAP30基因(YT-MAP30,Genebank accession No:DQ643968)的质粒DNA(pMD-YT-MAP30)为模板,PCR扩增其成熟肽编码区YTm-MAP30,与原核表达载体pET-30a(+)连接构建重组表达质粒pET-YTm-MAP30,酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS感受态细胞,菌落PCR筛选鉴定阳性菌落。30℃培养阳性菌落,IPTG诱导表达不同时间,其表达产物用SDS-PAGE检测并进行可溶性分析。DNA测序结果表明重组质粒pET-YTm-MAP30中YTm-MAP30的序列和插入位点正确。SDS-PAGE分析结果显示IPTG诱导4 h后在35 kD处出现一条增加的表达蛋白条带,且以可溶形式表达。为应用原核表达系统生产MAP30蛋白提供了实验依据。     

萝卜抗菌肽基因AFP的克隆及其在大肠杆菌中的诱导表达

试验采用RT-PCR方法,从萝卜叶子中克隆得到抗菌肽基因AFP(antifungal protein)。该基因全长240个碱基,79个氨基酸。经测序证明克隆所得基因与GeneBank中发表的原序列一致。将此抗菌肽基因克隆到E. coli表达载体pET28a,在IPTG的诱导下表达出含有AFP的11.99 ODD,证明该AFP基因在原核表达系统中可以正常表达。     

Construction of Prokaryotic Expression Vector of Mouse Nanog Gene and Its Expression

The aim of this study is to construct a prokaryotic expression vector of mouse Nanog gene and to express it in E. coli. A pair of primers was designed according to digestion sites in plasmid pGEX-KG and the Nanog gene sequence published by GenBank. The DNA fragment of 918 bp was amplified by polymerase chain reaction （PCR） from the pNA992 recombinant plasmid with Nanog gene, then cloned into pGEX-KG and transformed into the host E. coli strain TG Ⅰ. The sequence of the fragment was matched with the original sequence of pNA992. It indicated that fusion expression vector, pGEX-KG- Nanog, was constructed successfully. The pGEX-KG-Nanog plasmid was extracted from E. coli strain TG Ⅰ and was transformed into BL21（DE3） for expression. After induction by isopropyl-β-D-thiogalactoside （IPTG） at 37℃, the expression product of Nanog gene was identified by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）, and the expression condition was optimized. Nanog fusion protein was successfully expressed in the form of inclusion bodies. The molecular weight of the inclusion body was 63 kDa. Meanwhile, the optimum condition for the expression of Nanog fusion protein was induced with 0.8 mmol L^-1 IPTG for 5 h. The mouse Nanog gene was successfully expressed in E. coli, which laid a foundation for the purification of Nanog protein and for the preparation of polyclonal antibody.     

纳豆激酶基因的克隆和高效表达

为了克隆纳豆激酶(Nattokinase,NK)基因,实现纳豆激酶在大肠杆菌中的表达,并对其表达条件进行研究,首先以从枯草芽孢杆菌中提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增包括信号肽、前导肽、成熟肽序列的前纳豆激酶原基因,将其克隆到载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-NK,成功转化大肠杆菌BL21(DE3);然后优化影响该基因表达的温度、时间和IPTG添加量等因素。结果表明,重组菌株BL21(DE3)-NK在20℃下培养、IPTG添加量为0.4 mmol·L-1、培养20 h时表达产物的纤溶活性最大,可达到81.73 U·mL-1,SDS-PAGE检测观察到1条38 kDa的蛋白条带,与预期相符。