木聚糖酶基因umxyn10B的克隆与表达研究

从富集培养物宏基因组文库中筛选获得1个表达木聚糖酶活性的克隆pXYN12.鉴定分析表明:pXYN12上潜在的木聚糖酶基因umxyn10B大小为999 bp.编码产物与嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophi-lus)的木聚糖酶基因(GenBank索引号AAZ74783)的氨基酸序列有63%的一致性和76%的相似性,属于糖基水解酶家族10的成员.PCR扩增了umxyn10B的含催化功能域编码区的DNA序列并连接到表达载体pET-30a(+)上,构建成表达质粒在大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS中实现了表达,并对表达条件进行研究.     

独龙牛瘤胃细菌纤维素酶基因克隆

[目的]从分子生物学水平对独龙牛的瘤胃纤维素酶基因资源进行筛选及酶学特性研究,为后续开发利用新的纤维素酶提供参考依据,也为揭示瘤胃微生物降解纤维素的作用机理打下基础.[方法]提取独龙牛瘤胃微生物中的大片段基因组DNA,构建瘤胃微生物基因组文库,并进行纤维素酶活性筛选,筛选获得的高活性基因经测序后进行生物信息学分析与酶学性质研究.[结果]从独龙牛瘤胃中共获得20352个阳性克隆,白斑率达92%,构建的瘤胃微生物基因组文库容量899.6 Mb,空载率1.82%.从瘤胃微生物基因组文库筛选获得2个具有纤维素酶活性的阳性克隆(B1和B2),其中,B1基因序列长1230 bp,编码409个氨基酸,基因编码产物与来自Ruminococcusalbus纤维素酶基因编码产物(β-1,4-内切葡聚糖酶,GenBank登录号P23661.1)的覆盖率高达99%,其同源性高达97%;B2基因序列长1002 bp,编码333个氨基酸,基因编码产物与Unculturedmicroorganism纤维素酶基因编码产物(纤维糊精酶,GenBank登录号ADB80112.1)的覆盖率高达99%,其同源性为83%.B1和B2基因可在Rosetta原核表达宿主菌中成功诱导表达,B1纤维素酶的最适pH为6.0,最适温度40℃;B2纤维素酶的最适pH为6.0,最适温度40~50℃.[结论]从构建的独龙牛瘤胃微生物基因文库中筛选获得2株具有较高活力的纤维素酶(B1和B2),其中,B1为β-1,4-内切葡聚糖酶,而B2为新的纤维糊精酶,可为纤维素的体外降解提供新型材料.     

地衣芽孢杆菌GXN151的纤维素酶基因cel9A的序列分析及cel48A的定位

运用底物筛选法从地衣芽孢杆菌GXN151的基因文库中筛选到3类表达羧甲基纤维素酶活性的克隆。对克隆pGXNP11的测序表明其含有纤维素酶基因cel9A和cel48A的部分序列熏cel9A基因为1899bp熏可编码含633个氨基酸的内切葡聚糖酶cel9A熏cel9A的N-末端第21~456氨基酸形成家族9糖基水解酶催化功能域,第480~565氨基酸为家族3碳水化合物结合组件功能域,cel48A基因位于ce19A基因的下游,两者可能共用一个操纵子。cel48A基因编码一个外切纤维素酶熏通过染色体步移法将cel48A定位于4kbEcoRI片段上或10kbSalI片段上。     

黄淮白山羊瘤胃微生物Fosmid文库的构建与分析

采用CTAB法和蛋白酶K法提取黄淮白山羊瘤胃微生物总DNA,酶切获得DNA片段,大小为23～50 kb,以E.coli EPI300为宿主细胞,构建瘤胃微生物宏基因Fosmid文库。研究发现该文库共获得克隆28 800个,插入片段大小约35 kb,空载率小于2%,容量1 008 Mb。通过羧甲基纤维素酶和木聚糖酶(Xylanase)活性筛选,分别获得具有两种酶活性的阳性克隆60和32个,木聚糖酶和羧甲基纤维素酶(CMC,Carboxymethyl cellulase)共同作用阳性克隆15个。通过已测序MF3木聚糖酶阳性克隆酶学活性分析,该木聚糖酶在最适应pH 4.5, 40℃条件下,酶活力为79.287μ·mL~(-1)。为进一步研究黄淮白山羊瘤胃内纤维素酶(Cellulase)基因奠定基础。     

高糖土壤宏基因组文库β-葡萄糖苷酶基因克隆表达及酶学性质分析

【目的】通过宏基因组技术获取土壤微生物总DNA,运用基因克隆、功能筛选、基因表达等手段挖掘新型β-葡萄糖苷酶,为新型微生物资源的开发利用提供科学依据。【方法】提取高糖土壤宏基因组DNA,构建宏基因组文库;筛选文库并对阳性克隆子亚克隆,获得β-葡萄糖苷酶基因;PCR扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌进行表达;采用镍亲和层析对重组酶纯化,研究其酶学性质。【结果】成功构建约含9.2万个克隆的高糖土壤宏基因组文库,获得一个新型β-葡萄糖苷酶基因unbgl3A。该基因大小为2241 bp,在氨基酸水平上,与Gen Bank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的一致性为73%;该酶最适pH为6.0,最适温度为50℃,对对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)的K_m值为6.45 m M,V_(max)为50μmol/(mg·min)。在15～50℃热处理1 h后仍保留90%以上的酶活力,热稳定性较好,且被多种糖激活。【结论】宏基因组技术是获取新酶有效手段,获得的Unbgl3A具有良好酶学性质,可为进一步挖掘其应用潜力及研究耐热机理奠定基础。     

中性β-葡萄糖苷酶基因表达载体的构建

利用RT-PCR方法从芽孢杆菌Bacillus Subtilis CY110中克隆出β-葡萄糖苷酶基因,将此目的基因连接到pBS-T载体后导入大肠杆菌DH5α。测序结果表明,获得的目的基因片段大小为1 398 bp,该序列与Gen-Bank中的β-葡萄糖苷酶基因ABQN01000006.1序列相比同源性达到99.8%,氨基酸序列同源性达到99.5%。将产物与pET-28 a表达载体连接,经双酶切检验,证明原核表达载体构建成功。     

黑龙江镜鲤基因组DNA文库的构建

纯化镜鲤体组织的高分子量基因组DNA,经限制性内切酶Sau3A Ⅰ部分消化后,10％-40％蔗糖密度梯度离心分离并回收9—23kb的DNA片段。以λDASHⅡ为克隆载体,与9—23kb的DNA片段进行连接和包装,构建了镜鲤的基因组DNA文库。随机选取5个独立的噬菌斑,提取DNA后用EcoR Ⅰ与BamH Ⅰ进行酶切分析,证明克隆插入率为100％。经测定,该文库的滴度是108pfu/mL,根据公式N=ln(1-P)/In(1-f),99％的镜鲤基因组包含在该基因组文库中。以鲤IGF-Ⅱ基因探针对该基因组文库进行Southem杂交,筛选到相关的阳性克隆,证明这是一个较为完整的镜鲤基因组DNA文库。     

绿色木霉β-葡萄糖苷酶的重组表达及进一步纯化

β-葡萄糖苷酶在食品风味物质形成和生物活性物质转化中发挥重要作用。以纤维素酶工业生产菌株绿色木霉Sn-9106的总RNA为模板,采用RT-PCR技术获得大小为2235bp的cDNA片段,该序列与GenBank中的U09580.1β-葡萄糖苷酶序列相比,氨基酸序列同源性达99%。经大肠杆菌原核表达,β-葡萄糖苷酶的活力达到20.3U/mg,为β-葡萄糖苷酶制剂大规模生产及在食品工业中的应用提供了理论依据。     

球毛壳菌二烯醇内酯水解酶基因克隆及序列分析

以球毛壳茵cDNA文库中获得的二烯醇内酯水解酶基因片段(GenBank Accn：BP099060)为基础,用RACE技术克隆出该基因的全长cDNA序列。序列长919bp,由450bp的3’RACE产物和608bp的5’RACE产物拼接而成。开放阅读框762bp,编码253个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为27．5kD,理论等电点为5．98。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列。序列分析表明,该基因由2个内含子和3个外显子组成,外显子与内含子剪连接区符合AG—GT规则。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY465528,AY555772,AAS66899)。     

β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因在粟酒裂殖酵母中的表达及功能分析

【目的】克隆绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因,并在粟酒裂殖酵母细胞中进行表达分析。【方法】利用PCR技术,从绿色木霉中克隆纤维素酶β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,再通过XhoⅠ和NotⅠ2个酶切位点与粟酒裂殖酵母表达载体pREP5N连接,构建酵母真核表达载体,利用电转化方法转化粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞,并在SP-Q01中进行表达分析,最后采用DNS法测定表达产物的酶学活性。【结果】PCR扩增得到2 380bp的bglⅠ基因序列,包括完整的CDS序列和信号肽序列,编码序列与已报道的里氏木霉纤维素酶基因序列相似性为100%;对酵母转化子进行诱导培养后,SDS-PAGE电泳检测得到大小为76ku的目的蛋白条带,在SP-Q01细胞中重组酶活性最高达155U/mL,最佳培养时间为72h,产生酶活的最适温度为60℃。【结论】成功克隆出了绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,该基因能在粟酒裂殖酵母细胞中成功表达,为绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的深入研究和应用奠定了基础。     

秦岭辛家山不同林分土壤酶活性的剖面分布特征

土壤酶是土壤生态系统的重要组成成分，在土壤物质循环和能量交换过程中发挥着重要作用。调查了秦岭辛家山林区红桦（纯林）、云杉（纯林）和灌木3种天然次生林，分析了不同土层（0~10、10~20、20~40 cm和40~60 cm）β-1,4-木糖苷酶、β-1,4-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶和β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶活性的分布状况，并采用相关分析法分析了4种酶活性与土壤养分的相关关系。结果表明:1）红桦林土壤β-1,4-葡糖苷酶和β-1,4-木糖苷酶活性均高于云杉林和灌木林，云杉林土壤纤维素二糖水解酶活性高于红桦林和灌木林，而灌木林土壤β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶活性高于云杉林和红桦林；2）除云杉林的纤维二糖水解酶外，3种林分土壤β-1,4-葡糖苷酶、β-1,4-木糖苷酶、纤维素二糖水解酶和β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶活性均在0~10 cm达到最大值，且随着土层的加深而减少；3）相关分析表明，3种林分类型β-1,4-葡糖苷酶、β-1,4-木糖苷酶、纤维素二糖水解酶和β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶活性均与土壤SOC、EOC、DOC和MBC显著正相关。表明酶活性在土壤的剖面变化不仅受到林分类型的影响，土壤养分含量同样是影响其分布的重要因素。     

奶牛瘤胃微生物BAC文库中脲酶克隆的筛选与分析

利用脲酶选择性培养基,从奶牛瘤胃微生物BAC文库的15 360个克隆中筛选得到了12个脲酶克隆.利用酚-次氯酸法对脲酶克隆子的酶学性质分析,表明均具有不同的尿素分解能力,酶的活力范围是30～2 466 U/mg.脲酶阳性克隆插入片段大约是60 kb,限制性内切酶Hind Ⅲ酶切图谱表明,各个克隆具有不同DNA片段,其中脲酶Urease 1、Urease 3、Urease 4和Urease 9的最适pH8.0,最适温度为60℃.本研究从奶牛瘤胃微生物BAC文库中筛选到了具有脲酶酶活特性的克隆.     

黑龙江镜鲤基因组DNA文库的构建

纯化镜鲤体组织的高分子量基因组DNA,经限制性内切酶Sau3A Ⅰ部分消化后,10％-40％蔗糖密度梯度离心分离并回收9—23kb的DNA片段。以λDASHⅡ为克隆载体,与9—23kb的DNA片段进行连接和包装,构建了镜鲤的基因组DNA文库。随机选取5个独立的噬菌斑,提取DNA后用EcoR Ⅰ与BamH Ⅰ进行酶切分析,证明克隆插入率为100％。经测定,该文库的滴度是108pfu/mL,根据公式N=ln(1-P)/In(1-f),99％的镜鲤基因组包含在该基因组文库中。以鲤IGF-Ⅱ基因探针对该基因组文库进行Southem杂交,筛选到相关的阳性克隆,证明这是一个较为完整的镜鲤基因组DNA文库。     

秦岭辛家山不同林分土壤酶活性的季节性分布特征

季节更替是影响森林土壤生物活性循环的重要因素,然而关于秦岭辛家山不同季节对土壤酶活性的影响及影响因素的研究鲜有报道。本研究中,我们调查了秦岭辛家山林区云杉(Picea asperata Mast.)、红桦(Betula albosinensis)和灌木林3种典型林分,比较分析了不同土层(0～10, 10～20, 20～40和40～60 cm)β-1,4-木糖苷酶、β-1,4-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶和β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶活性的季节性分布特征,并采用相关分析法分析了4种酶活性与土壤养分及环境因子的相关关系。结果如下:1)土壤β-1,4-葡萄糖苷酶和β-1,4-木糖苷酶活性在四个季节均表现为红桦林(Betula albosinensis)高于云杉林(Picea asperata Mast.)和灌木林,而纤维二糖水解酶和β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶酶活性在四个季节均为云杉林(Picea asperata Mast.)高于红桦林(Betula albosinensis)和灌木林。2)3种林分土壤β-1,4-葡萄糖苷酶、β-1,4-木糖苷酶、纤维二糖水解酶和β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶活性的垂直变化均表现0～1010～2020～4040～60 cm。3)土壤酶活性呈现出显著的季节性变化趋势,3种林分土壤酶活性均表现出夏、秋季高于冬、春季的特征。4)相关分析表明,3种林分β-1,4-葡萄糖苷酶、β-1,4-木糖苷酶、纤维二糖水解酶和β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶活性均与土壤有机碳、易氧化有机碳、可溶性有机碳、微生物量碳、土壤含水量和土壤温度显著正相关。上述结果说明秦岭山区土壤酶活性的季节性分布特征不仅与土壤养分相关,土壤水、热条件也是影响其分布的重要因素。     

海蓬子DnaJ-like基因片段的表达和生物信息学分析

从盐生植物海蓬子的抑制消减杂交文库中克隆了DnaJ-like基因的长609 bp的DNA序列,编码1个202 aa的开放阅读框,Northern B loting显示该基因在检测子(200 mmol/L NaC l)中的表达显著增强。生物信息学分析表明,在蛋白质水平上,该片段与拟南芥和水稻的同源性分别为6 e-68和1 e-58;在核酸水平上,该片段与拟南芥的同源性为3 e-24。保守区分析显示,该片段含有DnaJ-like基因完整的J功能域(J-Dom ain,66 aa),功能域在蛋白质水平与GenBank两种相关类型的J功能域的同源性分别为1 e-11和9 e-15。这为该基因的克隆及研究其在植物逆境胁迫中的作用奠定了基础。     

东北马鹿鹿茸软骨组织cDNA文库构建及IGF2基因克隆与结构分析

 【目的】从功能基因组学角度深入研究鹿茸软骨组织生长发育机理,探讨胰岛素样生长因子-II（IGF2）在鹿茸软骨组织生长发育过程中的作用。【方法】利用SMART技术构建了东北马鹿鹿茸软骨组织全长cDNA文库,并设计IGF2基因保守引物对该文库进行筛选。【结果】构建的未扩增文库滴度为1.8×106 pfu•ml-1,文库重组率大于89.8%;插入片段平均长度约为1.2 kb;扩增文库滴度为1.4×1010 pfu•ml-1;克隆东北马鹿IGF2基因（GenBank登录号：EF177491）CDS区为540 bp,编码179 aa长度的多肽,与GenBank中检索得到的猪、马、牛、羊、人、小鼠和大鼠IGF2基因进行比对分析显示,马鹿IGF2多肽无色氨酸（Trp）,组氨酸（His）与苏氨酸（Thr）含量在8个物种中最高;重建系统树结果显示,东北马鹿IGF2与牛和羊IGF2基因具有最高的相似性。【结论】成功构建东北马鹿鹿茸软骨组织cDNA文库并克隆到IGF2基因。     

烟草糖基转移酶基因NtGT3的克隆与生物信息学分析

为了给烟草糖基转移酶的生物学功能研究奠定基础,根据在GenBank上登录的烟草糖基转移酶基因NtGT3的CDS序列,以烟草栽培品种K326为材料,采用PCR的方法,对目的基因进行克隆,并测序。根据测序的结果,采用各类分析软件,对所获得的DNA片段进行生物信息学分析。结果通过PCR的方法,成功克隆了烟草糖基转移酶基因NtGT3的全长CDS序列。生物信息学分析结果表明,该基因CDS全长1 449 bp,所编码的蛋白质包含482个氨基酸。其分子量为54.15 ku,等电点为5.53。在二级结构上,α-螺旋和无规则卷曲为蛋白的主要结构形式。在三级结构上,具有42%的α-螺旋以及15%的β-折叠。NtGT3蛋白是一个亲水性蛋白质,含有2个糖基化位点,不含信号肽。NtGT3蛋白广泛分布于细胞中,在细胞膜、微体、高尔基体及内质网膜的分布分别达到了79%、31.9%、30%及20%。功能结构域分析结果证实,该蛋白包含有糖基转移酶家族的功能保守域PLN03015,属于GTB类型的糖基转移酶超级家族。同源性分析结果表明,NtGT3蛋白与枸杞、睡茄、甘薯、可可、猕猴桃、杨树、葡萄、野生大豆及拟南芥等的糖基转移酶有较高的序列相似性。NtGT3基因的成功克隆,为该基因功能的深入研究提供了理论支撑。     

基于序列宏基因组学技术的芳香聚酮抗生素的发现

[目的]本文旨在筛选土壤微生物来源的芳香聚酮抗生素。[方法]通过宏基因组学技术,利用基于酮基合成酶基因(KSα)保守序列设计的简并引物筛选土壤宏基因组文库,获得含有芳香聚酮生物合成基因簇的阳性克隆。对阳性克隆质粒测序并通过BLASTx同源比对分析其所包含的芳香聚酮生物合成基因簇。通过接合转移方法将基因簇整合进异源表达宿主白色链霉菌基因组中,培养发酵接合子,利用高效液相色谱技术确定克隆特异性产物并对发酵产物进行抑菌活性检测。[结果]从珠穆朗玛峰土壤宏基因组文库第493号混合文库中扩增得到了1个KSα片段ZF493,蛋白序列分析显示其与酮基合成酶同源,文库筛选得到了含有其对应芳香聚酮生物合成基因簇的阳性克隆cos493。对cos493的测序分析显示其插入片段大小为34 kb,包括酮基合成酶基因(KSα,orf 21)、链长因子基因(KSβ,orf 20)、酰基载体蛋白基因(ACP,orf 19)、环化酶基因(CYC,orf 17和orf 18)、糖基转移酶基因(orf 12)、单加氧酶基因(orf 16)等芳香聚酮合成相关基因。ORF 21与化合物calixanthomycin A聚酮合酶的KSα有67%的相似性,ORF 20与化合物griseorhodin A的KSβ有49%的相似性。通过接合转移使含芳香聚酮合酶基因簇的cos493整合进白色链霉菌宿主基因组中。高效液相色谱分析发酵粗提物发现了2个克隆特异化合物峰,紫外光谱分析显示化合物1在223、296和420 nm处有特征吸收峰,化合物2在214、261和447 nm处有特征吸收峰,特异峰具备芳香聚酮化合物的紫外吸收特征。对发酵粗提物的抑菌活性检测发现,其对金黄色葡萄球菌有抑制作用。[结论]本研究运用基于序列的宏基因组学技术,在链霉菌宿主中表达了来源于土壤微生物的芳香聚酮合酶基因簇并产生了具有抗菌活性的化合物。     

山羊β-酪蛋白基因调控区的克隆及启动子活性的检测

为了克隆山羊β-酪蛋白基因的调控区并检测5′调控区的启动子活性,利用Long PCR技术对西农莎能奶山羊β-酪蛋白基因(CSN2)5′和3′调控区进行了克隆(5′调控区分两段进行克隆,3′调控区进行直接克隆)、测序,将克隆的5′调控区的两个片段通过共有的单一性酶切位点HindⅢ融合成一个长为6.7 kb的片段,用其替代表达载体pEGFP-C1上原来的启动子CMV,指导报告基因绿色荧光蛋白(GFP)在山羊乳腺上皮细胞中的瞬时表达。结果表明,克隆的GC 3.3、GC 4.3、GC 6.6 3个片段与GenBank中登录的山羊CSN2基因相应序列相比,同源性均为99%,其包含了TATA box、GC island、CAAT box、SAR、AP1、Oct-1、Sm、Glyco、Pu-1、CAC等复合元件和转录翻译调节因子的作用位点,并且5′调控区可以有效指导报告基因的表达,从而初步验证了所克隆的山羊CSN2基因5′调控区的有效性,表明克隆的调控区可用于乳腺生物反应器的研究。