接种BmNPV后抗性品种和非抗性品种家蚕组织中2种酶活性的比较研究

[目的]探讨抗性品种和非抗性品种家蚕接种家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)后体内羧酸酯酶(Car E)和乙酰胆碱酯酶(Ach E)活性的变化规律。[方法]对抗性品种及其对照品种家蚕添食Bm NPV,测定并比较中肠和血液中羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活性变化。[结果]家蚕接种Bm NPV后,抗性品种的中肠中羧酸酯酶活性上升,而对照品种羧酸酯酶活性先升高,然后从第3天开始活性降低。抗性品种前2 d中肠的乙酰胆碱酯酶活性降低,而对照品种与之相反。家蚕接种Bm NPV后,抗性品种在第2天血液羧酸酯酶活性有所升高,此后基本保持不变,而非抗性品种在第3天羧酸酯酶活性升高后下降;抗性品种血液乙酰胆碱酯酶活性升高,对照品种前2 d乙酰胆碱酯酶升高后降低。[结论]抗性品种在感染Bm NPV病毒后其中肠中羧酸酯酶活性高于未感染的抗性品种,表明抗性品种对感染病毒做出了有效应答和防御;而在感染病毒后抗性品种的中肠与血液中乙酰胆碱酯酶活性均变化相对较小。据此推测,抗性品种在感染病毒后仍保持了相对稳定的代谢过程。     

云南蚕区家蚕品种资源对家蚕核型多角体病毒的抗性评价分析

[目的]全面掌握云南蚕区家蚕品种资源的抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)能力,为挖掘具有特色的家蚕抗病材料及培育适应当地的抗病品种提供参考.[方法]采用三龄起蚕经口添食相同浓度病毒、逐日调查存活率的方法,对200个家蚕品种(品系)进行BmNPV抗性评价和筛选;并通过接种后每日存活数、各发育时期存活率等指标分析云南蚕区家蚕品种资源对BmNPV的抗性水平、发病死亡规律、不同抗性品种的发病死亡时期及同一品种不同品系间抗性差异.[结果]云南蚕区家蚕品种资源中抗BmNPV的品种有731、795、854B、872A、966B、B黄肉色茧、P50、山河B、选二甲白和竹印,感病品种包括955、242A、242B、963B、DW3、锦秀A、锦秀B、日、野乙和云夏A油.各抗病品种和感病品种首次出现死亡差异的时间截点分别是接种后96和48 h,二者相差48 h;部分抗病品种在秋季对BmNPV的抗性水平低于春季;同一家蚕品种A系和B系的抗病性差异不显著(P>0.05).[结论]云南蚕区家蚕品种资源中大多数品种的抗BmNPV能力属于中等水平,其中P50为BmNPV抗性最强品种.对未知品种进行抗BmNPV测定时,可选择接种后168 h作为抗性评价的时间截点.     

BmNPV对家蚕抗氧化酶基因表达及其酶活性的影响

[目的]探究喂食家蚕核型多角体病毒(BmNPV)后家蚕血淋巴和中肠组织抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)]的活性及其基因表达变化规律,明确BmNPV侵染对家蚕抗氧化系统的影响,为解析BmNPV的致病机理提供理论依据.[方法]以五龄家蚕为研究对象,经口喂食BmNPV,分别于添食后6、12、18、24、30、36、42和48 h采集家蚕的血淋巴和中肠组织,采用实时荧光定量PCR检测两种抗氧化酶基因(Bmsod和Bmcat)的表达水平,同时以抗氧化酶活性测试盒测定SOD和CAT的活性变化情况.[结果]BmNPV侵染五龄家蚕能引起典型的血液型脓病,主要表现为蚕体环节肿胀,狂躁爬行,体壁易破,体液呈乳白色等.家蚕血淋巴和中肠组织中Bmsod和Bmcat基因均在感染BmNPV中期开始上调表达,在感染后期呈下调表达趋势,其相对表达量也呈先增加后急剧减少的变化趋势.添食BmNPV后,家蚕血淋巴和中肠组织的SOD活性在感染18和24 h时极显著高于对照组(添食等量灭菌水)家蚕(P<0.01,下同),但从感染30 h起SOD活性开始急剧下降,至感染48 h时降至最低值.家蚕血淋巴和中肠组织的CAT活性在感染早期(6 h)略有下降,从感染12 h起CAT活性开始呈上升趋势,血淋巴CAT活性在感染18~30 h极显著高于对照组,随后急剧下降且显著低于对照组家蚕(P<0.05,下同);中肠组织CAT活性仅在感染18和24 h时显著或极显著高于对照组家蚕,从感染30 h起开始持续下降,至感染48 h时降至最低值,约为对照组家蚕的18%.[结论]BmNPV侵染能影响家蚕机体相关保护酶活性及其基因转录水平,SOD和CAT活性及其基因表达量在感染中期增加,感染后期则急剧降低,提示抗氧化酶SOD和CAT在家蚕的抗病毒过程中发挥重要作用.     

虫生广布拟盘多毛孢蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶产生水平及其毒力关系研究

[目的]了解虫生广布拟盘多毛孢GXSTYJ03菌株侵染和杀死松突园蚧过程中酶活性变化及作用机理.[方法]通过Folin-酚法、DNS法和对硝基苯酚法分别测定含1×104、1×105、1×106、1×107和1×108个孢子/mL系列浓度的GXSTYJ03菌株孢子悬浮液产生的蛋白酶、几丁质酶和脂肪酶活力及其对松突圆蚧的致死率.[结果]GXSTYJ03菌株孢子含量越高,其产蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶的活力也越高;蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶的产酶高峰期和产酶活性均不相同,蛋白酶的产酶高峰期出现在发酵后第5d、几丁质酶出现在发酵后第6d、脂肪酶出现在发酵后第4~5d,GXSTYJ03菌株的蛋白酶活性远大于几丁质酶和脂肪酶活性;GXSTYJ03菌株5种孢子浓度产蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶活性与对松突圆蚧毒力呈极显著正相关.[结论]1×107个孢子/mL的GXSTYJ03菌株孢子悬浮液是产酶及杀虫的最佳使用量.蛋白酶、几丁质酶、脂肪酶活性越高的菌株毒力越强,用于侵染和致死松突圆蚧的效果越好.     

分子标记技术检测家蚕品种抗BmNPV性能

通过经口添饲家蚕核型多角体病毒BmNPV,比较家蚕新品种871C、872C及其杂交种和871、872及其杂交种对BmNPV抵抗性的强弱,结果表明,家蚕新品种具有很强的抗BmNPV性能。用分子标记技术对不同品种进行辅助选择,抗性品种871C、872C显示为阳性,而易感品种871、872显示为阴性;并在抗病品种中扩增出长度为999 bp的DNA片段,推测该分子片段与家蚕品种的抗BmNPV性能相关。     

抗性家蚕血液中与BmNPV抗性相关铜化合物的分离方法研究

[目的]探究家蚕血淋巴中与BmNPV抗性相关铜化合物的分离方法。[方法]选取对BmNPV具有抗性的家蚕品种和非抗性品种为研究对象,对它们进行添食BmNPV病毒处理。提取家蚕的血淋巴,运用SEC-ICP-MS对2组样品中Cu化合物进行分离和检测。[结果]筛选出优化的体积排阻色谱分离条件:Yarra TM SEC-2000分离柱,30 mmol/L Tris-醋酸为流动相(pH 7.4),流速0.5 mL/min。建立了分离与检测家蚕血液中Cu化合物的SEC-ICP-MS联用技术。BmNPV抗性和非抗性家蚕血液中Cu化合物主要的差异是位于7.6 min的组分。[结论]制备了葡聚糖G100凝胶柱分离并收集可能与BmNPV抗性相关的家蚕血液分离液,为家蚕金属蛋白的分离提供更简便有效的方法。     

不同抗性茭白感染纹枯病菌后4种酶活性的变化

选择3个对纹枯病抗性不同的茭白品种,研究其生物酶活性与抗性的关系。结果表明：抗性强的品种过氧化氢酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性高于抗性弱的品种;人工接种以后,各品种间过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性都有不同程度的提高,抗性强的品种峰值高,抗性弱的品种苯丙氨酸解氨酶的活性增幅较大。     

广西家蚕血液型脓病发病因子及其病原分子系统发育分析

[目的]明确病原[家蚕核型多角体病毒(BmNPV)]、寄主(家蚕品种)和环境条件(温湿度)的相关性并掌握BmNPV的感染力差异及传播规律,为蚕业生产上有效防控家蚕血液型脓病提供科学依据.[方法]测定从广西不同蚕区和不同季节收集的BmNPV毒株在不同温湿度条件下对不同家蚕品种的半数致死浓度(LC50),调查病原、寄主和环境条件三者对家蚕血液型脓病发生的影响;并基于bro-a和bro-c基因序列构建不同来源BmNPV毒株的系统发育进化树及进行相似性和遗传距离分析.[结果]15株不同来源BmNPV毒株对家蚕品种两广二号的LC50为2.1×106~4.2×106多角体/mL,毒株间的差异不显著(P>0.05);不同BmNPV毒株在不同环境条件[春季(温度25℃和湿度90%)、夏季(温度35℃和湿度95%)、秋季(温度30℃和湿度85%)]下对家蚕的LC50排序均表现为春季>秋季>夏季,在夏季和秋季条件下,不同蚕品种对BmNPV的感染抵抗力排序为桂蚕N2>两广二号>桂蚕2号,桂蚕N2对BmNPV的感染抵抗力显著高于两广二号和桂蚕2号(P<0.05).不同BmNPV毒株在基于bro-a和bro-c基因序列构建的系统发育进化树上均聚在同一分支上,不同BmNPV毒株间的bro-a基因序列相似性很高、遗传距离较小,但不同BmNPV毒株间的bro-c基因序列相似度相对低、遗传距离相对较大.[结论]温湿度条件是广西蚕区家蚕血液型脓病发生的重要因子,且血液型脓病的发生流行与家蚕品种抗性也有密切关系.     

BmNPV对家蚕不同组织ALP活性及其基因表达的影响

【目的】探究家蚕感染BmNPV后,不同组织碱性磷酸酶(ALP)及其基因表达变化规律,为阐明BmNPV的侵染机制及培育抗NPV蚕品种的选育提供借鉴和思考。【方法】通过经口添食BmNPV,检测分析家蚕中肠、血淋巴和脂肪体ALP基因的表达水平及其编码的碱性磷酸酶活性变化情况。【结果】家蚕中肠ALP基因在感染BmNPV后6、9和12 h呈现上调表达趋势,其编码的碱性磷酸酶活性显著高于对照组,在感染24 h基因表达被抑制,同时酶活性显著降低。血淋巴碱性磷酸酶及ALP基因对BmNPV的响应略晚于中肠,ALP基因在感染9 h开始上调表达,在12 h表达量最高,在24 h表达量急剧降低。碱性磷酸酶活性在9和12 h极显著高于对照组,而在24 h急剧减弱,显著低于对照组。脂肪体ALP基因表达量及碱性磷酸酶活性仅在感染12 h显著高于对照组。【结论】家蚕感染BmNPV后,中肠、血淋巴和脂肪体ALP基因表达水平及碱性磷酸酶活性变化均是呈现先升高后急剧减弱的趋势。基因的表达情况与酶活性变化规律一致,这与家蚕感染BmNPV后,其自身机体的生理代谢进程存在紧密联系,暗示碱性磷酸酶在家蚕抗病毒过程中发挥了重要作用。     

利用印度家蚕品种2041和2042改良现行家蚕品种山河×锦绣性状的研究

鉴于引进家蚕品种山河×锦绣多年推广使用后,出现退化,特别是品种抗性下降明显,巴经严重影响其在生产上的应用,需要对其进行复壮.本研究以家蚕数量性状遗传规律为理论依据,采用杂交导入的方法,利用抗性强的印度家蚕品种2041和2042改良现行家蚕品种山河×锦绣的性状,以期达到在保持山河×锦绣的优良性状的同时提高其抗性的目的.试验结果表明,通过改良后获得的改良系(山河B改×山河A)×锦绣,在品种改良的各个阶段品种性状都有不同程度的改进,综合成绩表现符合试验设计目标.     

家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展

追踪研究蚕体内的抗家蚕核型多角体病毒（Bombyxmori nuclearpolyhedrosis virus,BmNPV）基因与蛋白,了解家蚕抗BmNPV的机制,对减轻甚至解除血液型脓病、促进桑蚕产业发展具有重要意义。文章就家蚕抗BmNPV基因和蛋白的研究进展进行综述,提出今后对家蚕抗BmNPV的研究策略应是运用多种技术同时从DNA、RNA、蛋白质水平上进行研究,鉴定家蚕抗BmNPV基因或蛋白及其与抗BmNPV的相关性;再采用RNA干涉、转基因技术对家蚕进行基因操作,改变其对BmNPV的抵抗能力,确认这些基因、蛋白的抗病毒功能。另外,使用免疫组化、免疫共沉淀,ELISA等技术探索基因一蛋白、蛋白一蛋白间的相互作用,找到基因或蛋白的上、下游作用因子,解释清楚家蚕抗BmNPV的详细机制,为最终解除家蚕脓病危害、促进蚕业发展提供参考资料。     

可感染茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒的构建

【目的】构建能够感染家蚕和茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒（rBmNPV）,解决EoNPV扩增困难而不易获得的难题。【方法】通过Bac-to-Bac系统构建具备BmNPV的多角体蛋白基因（polh）表达盒和EoNPV的解旋酶基因（hel）表达盒的重组家蚕核型多角体病毒。【结果】家蚕或家蚕细胞扩增的rBmNPV可以感染茶尺蠖并致病,表明rBmNPV的宿主域拓展至茶尺蠖。【结论】成功构建了能够感染茶尺蠖的rBmNPV,为利用家蚕作为宿主来生产重组病毒杀虫剂打下基础。     

异源多角体蛋白包装对重组家蚕核型多角体病毒感染性的影响

 将 Ac MNPV的 polh基因克隆到缺失 polh基因的 Bm NPV(API4)基因组中 ,得到被 Ac MNPV多角体蛋白包埋并可表达慈菇蛋白酶抑制剂的重组病毒 Bm NPV(OAc- API4)。发现它的芽生型病毒能感染家蚕细胞和经皮下注射感染家蚕幼虫 ,但包埋型病毒不能经口感染家蚕幼虫。     

高温胁迫下家蚕基础品种抗性选择

[目的]明确家蚕的耐高温特性与其机体本身抗性的关系。[方法]在高温条件下饲养家蚕,调查其全龄经过、家蚕体质、结茧情况以及其血液中SOD、CAT、POD活性。[结果]不同家蚕品种在高温条件下各个性状表现差异很大。血液中酶活较高的家蚕品种可以保持高的经济性状,这些品种可作为基础品种进行组配强健性家蚕品种。[结论]家蚕品种521、574和576不仅体质强健,而且茧质优良,在比较恶劣的环境下,仍保持较高的生产能力,可作为选育的基础品种。     

利用家蚕生物反应器生产有用蛋白的研究

就家蚕/BmNPV表达系统的原理及生产流程、外源基因在该系统中的表达及表达产物的药物开发作了较为详细的阐述,介绍了利用家蚕大量生产有用蛋白的技术开发状况,展望了家蚕生物反应器的发展前景。     

家蚕DNA甲基转移酶功能预测及其在BmNPV感染下的表达特征

【目的】明确家蚕DNA甲基转移酶基因(BmDNMT)生物信息学基本特征及其在家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染前后的表达情况,揭示DNA甲基化在家蚕抗病毒免疫方面的作用机制,为挖掘家蚕抗病毒标志基因和药物靶标蛋白等提供理论依据。【方法】通过OrthoDB、MultiLoc2、SherLoc2、PSORTII、SMART、SWISS-MODEL及Schr?dinger等在线生物信息学分析软件进行BmDNMT蛋白氨基酸同源比对、系统进化分析、亚细胞定位、功能结构域预测、三级结构同源建模及小分子配体对接口袋预测,并采用实时荧光定量PCR分析BmDNMT基因在家蚕感染BmNPV后不同时间不同组织中的时空表达特征。【结果】BmDNMT基因包含BmDNMT1和BmDNMT2,分别位于家蚕8号染色体和11号染色体上,其推导BmDNMT氨基酸序列均与烟草天蛾DNMT氨基酸序列的亲缘关系最近。BmDNMT1蛋白大量存在于细胞核,少量分布在细胞质;而BmDNMT2蛋白大量存在于细胞质,少量分布在细胞核及线粒体。BmDNMT1蛋白的功能结构域多于BmDNMT2蛋白,二者均含有DNA甲基化酶功能结构域,且具有潜在药物结合口袋。BmNPV感染会影响BmDNMT1和BmDNMT2基因在家蚕不同组织中表达差异,BmNPV感染4 h后这2个基因在家蚕中肠的表达差异已非常明显,说明家蚕DNA甲基化可能在病毒感染早期已发生,且中肠可能是最早响应的组织。BmNPV感染后,BmDNMT1和BmDNMT2基因的相对表达量和表达趋势并不一致。【结论】BmDNMT1和BmDNMT2基因的染色体位置、亚细胞定位及功能结构域等存在差异,BmNPV感染后二者在家蚕不同组组织中的相对表达量和表达趋势也不一致,推测BmDNMT1和BmDNMT2基因在家蚕DNA甲基化过程中行使不同的功能。BmDNMT1和BmDNMT2蛋白三维结构具有潜在的药物结合口袋,可能是直接影响DNA甲基化状态的药物靶标。     

家蚕抗逆性与若干品种性状的因子分析

[目的]了解家蚕品种性状与抗逆性的关系。[方法]应用因子分析方法对15个家蚕品种的3个抗逆性状及若干品种性状进行分析。[结果]所分析的这些性状可以综合为4个主因子性状群:抗逆性状因子、经济性状因子、茧质性状因子和生长发育因子;通过提高家蚕品种的虫蛹率,可以增强家蚕的耐氟性和耐高温多湿性,但不利于改良家蚕的耐吃湿叶性,对家蚕幼虫生命率、全茧量和茧层量的提高只能协调改良。[结论]由于因子间具有独立性,可依据该群体因子的相对重要性,采取有重点的逐步改良方法,以提高育种效率。     

普安银鲫胚胎发育过程消化酶活性变化研究

采用生物化学方法测定和分析了普安银鲫(Carassius auratus)未受精卵与受精卵及胚胎发育过程中消化酶活性及其变化。结果显示,受精卵与未受精卵相比,5种酶活力均高于未受精卵,未受精卵与受精卵消化酶活力顺序均为:淀粉酶>胰蛋白酶>脂肪酶>胃蛋白酶>纤维素酶。胚胎发育不同时期,5种消化酶各自出现不同的变化模式,淀粉酶活力呈波浪式下降趋势,胰蛋白酶、脂肪酶、胃蛋白酶、纤维素酶活力均呈升高趋势。     

家蚕核型多角体病毒LAMP可视化检测技术的建立

[目的]建立针对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的环介导等温扩增(LAMP)可视化检测技术,为生产现场进行家蚕血液型脓病早期诊断提供技术支持.[方法]以BmNPV多角体蛋白基因po如为扩增靶标,分别设计5组内/外引物和5条环引物,根据扩增效率筛选最佳引物组合;优化LAMP反应条件,并进行LAMP检测的特异性、敏感性及临床样本检测试验;使用羟基萘酚蓝(HNB)染色对结果进行比色观察,对简化样品处理的条件进行摸索.[结果]使用环引物后LAMP对BmNPV基因组DNA的最低检测浓度为7fg/μL,检测灵敏度得到有效提高,且反应时间缩短.建立的LAMP检测方法对靶标DNA扩增具有特异性,对样本的检出率高于常规PCR,其最低检测限是常规PCR的100倍.在反应前加入HNB,结果易判断且能减少交叉污染.感染家蚕血淋巴进行100℃煮沸处理后即可直接用于LAMP反应,既简化了操作步骤,又降低了检测成本.[结论]针对BmNPV建立的LAMP可视化检测技术具有灵敏、快捷、可靠的特点,适合用于生产现场的BmNPV感染早期诊断.