抗真菌α-硫堇蛋白DB_4基因导入苹果的研究

［目的］利用转基因的办法提高苹果（Malus domestica Borkh）对叶部病害和幼果期侵染果实病害的抵抗能力。［方法］利用农杆菌介导的遗传转化方法将绿色组织特异表达的菠菜核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶的激活酶（Rubisco activase）启动子（RCAP）驱动下的α堇蛋白DB4基因转入到“皇家嘎啦”苹果叶片外植体中。［结果］ PCR、Southern blotting分析及GUS检测结果表明,目的基因已经整合到苹果基因组上。［结论］获得了转α堇蛋白DB4基因的转基因苹果。     

花粉育性基因MS2的克隆与RNAi载体构建

［目的］研究MS2基因的功能。［方法］采用RT-PCR克隆棉花花粉育性（MS2）基因cDNA片段,将MS2反义基因、与陆地棉chinase基因第一个内含子和MS2正义基因3个片段串联在一起,经鉴定后,插入到植物表达载体中PBI121中。［结果］成功构建了MS2基因的RNAi载体p35S12MSIn。［结论］该载体的构建为棉花不育材料的遗传转化创造了条件。     

香蕉Ran家族基因的全基因组分析

Ran是一类在多种基本细胞活动中扮演者重要角色的小GTP酶。从香蕉基因组中鉴定出9个MuRan家族基因成员,并对其染色体分布、基因结构、蛋白理化性质、结构域和系统进化等进行分析。结果表明:MuRan家族基因不均匀的分布在第1、4、5、6号等4条染色体上。MuRan蛋白与其它植物Ran蛋白的氨基酸序列都有很高的同源性,带有GTP水解结构域、Ran GAP结合结构域和酸性尾巴等Ran蛋白的典型结构域,与拟南芥AtRan蛋白亲缘关系较近。为进一步研究香蕉MuRan家族基因的生物学功能提供参考。     

日本夹竹桃化学成分及细胞毒活性研究

［目的］研究日本夹竹桃枝的化学成分,并对分离得到的化合物进行细胞毒活性测定。［方法］采用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱等方法对日本夹竹桃进行分离纯化,根据理化性质和波谱数据进行结构鉴定。［结果］从夹竹桃枝中分离并鉴定了4个化合物,分别为东莨菪内酯（1）、对羟基苯乙酮（2）、白桦脂酸（3）和齐墩果酸（4）。化合物1～3均为首次从日本夹竹桃中分离得到,化合物3、4对人体肺癌细胞模型VA-13和人体肝癌细胞HepG2有一定的细胞毒活性,化合物3显现出一定的抗癌活性。［结论］该研究结果为日本夹竹桃的临床应用提供理论依据。     

玉米CCCH基因家族鉴定及分析

CCCH锌指蛋白与植物生物和非生物胁迫、生长发育及抗病性密切相关。以玉米为材料,应用在线工具与公共数据库,共鉴定出63个CCCH基因,命名为Zm CCCHs,进一步对玉米与水稻、拟南芥、小立碗藓的CCCH基因进行生物信息学分析。结果表明:玉米的CCCH家族基因在染色体上呈不均匀分布,蛋白质氨基酸序列长度在110～962 aa之间。Zm CCCHs基因具有相对保守的结构,即包含CCCH结构域、WD40结构域、C2H2结构域、C3HC4结构域,CCCH蛋白结构中含有2个α螺旋和4个β折叠结构域。进化树分析表明玉米CCCH蛋白与水稻CCCH蛋白序列具有较高的同源性。上述结果为深入研究该基因家族的功能与表达调控提供了参考信息。     

大麦TIFY基因家族成员鉴定及表达分析

【目的】对大麦TIFY基因家族成员进行鉴定及表达分析,为进一步探究TIFY基因家族在大麦生长发育与胁迫响应中的作用机理打下基础。【方法】基于TIFY家族蛋白的保守域特征,利用HMMER从大麦中鉴定TIFY基因家族成员,利用采用生物信息学软件对其理化性质、保守基序、特征结构域、顺式作用元件、基因结构、系统进化及表达模式进行预测分析。【结果】从大麦中鉴定出15个HvTIFYs基因（HvTIFY1～HvTIFY15）,分布于5条染色体上,且大多数基因在染色体上成簇分布。15个HvTIFYs蛋白均具有TIFY家族蛋白的特征结构域（TIFY）,根据所含保守结构域的不同,可分为ZML（4个）和JAZ亚族（11个）,且亲水性蛋白（14个）和偏碱性蛋白（11个）居多,但均定位于细胞核;二级结构相似度较高,均由α-螺旋、β-转角和无规则卷曲组成,除HvTIFY7蛋白外,其余蛋白二级结构所占比排序:无规则卷曲>α-螺旋>β-转角。HvTIFYs基因结构存在明显差异,其中,JAZ亚族11个基因的内含子数为0~6; ZML亚族4个基因的内含子数为6～7个,系统发育进化树上相邻分支的基因具有较相似的基因结构。HvTIFYs基因启动子区域富含光、激素和胁迫等顺式作用元件,种类及分布均呈多样性。5个物种的79条TIFY蛋白分为4个组,恰好与TIFY家族的4个亚族对应,其中,ZML、TIFY和JAZ亚族包含单、双子叶植物的TIFY蛋白,而PPD亚族仅含有双子叶植物的TIFY蛋白。15个HvTIFYs基因在不同组织器官中的表达量存在明显差异,其中HvTIFY1、HvTIFY2和HvTIFY8基因在8个组织中的表达量均较高,HvTIFY10和HvTIFY15基因表达量中等,HvTIFY6基因表达量较低; HvTIFY11基因不表达。15个基因在根的不同组织中对盐胁迫的敏感程度不同。【结论】从大麦中鉴定出的15个HvTIFYs基因存在一定的功能分化,具有明显的组织和时空特异性,推测其在大麦逆境响应和激素调节中具有重要调控作用。     

鹅坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅰ的原核表达及免疫原性鉴定

【目的】明确鹅坦布苏病毒（GTUMV）E蛋白结构域I的原核表达及免疫原性,为进一步研究GTMUV E蛋白结构的生物学特性、免疫学功能等奠定基础。【方法】通过人工合成方法获得GTMUV E蛋白结构域I的编码基因（EI基因）,并与携带GST标签的p GEX-4t-1载体连接,转入大肠杆菌后经诱导表达获得融合蛋白,并以Western blotting鉴定融合蛋白是否有免疫原性。【结果】合成获得的E1基因片段为411 bp,将其插入p GEX-4t-1载体可构建重组表达质粒p GEX-4t-1-EI。阳性重组菌经1 mmol/L IPTG诱导5 h后,融合蛋白的表达量达最高峰,且以包涵体形式存在,分子量约41.0 k Da。Western blotting鉴定结果显示,融合蛋白与GST标签抗体和E蛋白阳性血清均可发生特异性反应,检测到预期的目的条带。【结论】GTMUV E蛋白结构域I可在大肠杆菌中成功诱导表达,且获得的融合蛋白具有良好的免疫原性,可用于GTMUV血清学检测试剂盒的研发。     

基于CHD基因序列分析的帝企鹅性别鉴定研究

［目的］分析帝企鹅（Aptenodytes forsteri）CHD基因序列,以鉴定性别。［方法］采用苯酚∶氯仿抽提法提取6只未知性别的帝企鹅血液中的基因组DNA,运用P2/P8引物扩增CHD基因片段,将PCR产物克隆到T Vector,利用NCBI的Blast 程序,以短趾鹰（Circaetus gallicus）同源序列为比对参照,将帝企鹅CHD基因片段序列与GenBank 中的基因片段序列进行同源性比较分析,鉴定帝企鹅的性别。［结果］测序结果表明,CHDZ和CHDW基因的PCR产物大小分别为378、387 bp,雌雄结果并不明显,不易区分开来。Blast比对结果表明,帝企鹅LD、EK、ZF为雄性,帝企鹅DG、YA、YY为雌性。［结论］结合PCR扩增和测序分析CHD基因,是单态性鸟类性别鉴定的有效和准确的方法。     

鸡干扰素调节因子7的分子特征及其组织表达特性分析

【目的】明确鸡干扰素调节因子7 （chIRF7）的分子特征及chIRF7基因在不同发育阶段各组织中的表达特点,为后续开展IRF7基因调控鸡相关组织发育和抗病毒研究打下基础。【方法】利用RT-PCR扩增chIRF7基因编码区（CDS）并构建其重组真核表达载体,通过SOPMA、SWISS-MODEL及BioEdit等在线软件预测分析chIRF7蛋白的二、三级结构及结构域保守性;以重组真核表达载体转染鸡胚成纤维细胞系（DF-1）,观察融合蛋白的亚细胞定位情况及分析过表达融合蛋白对新城疫病毒（NDV）复制的影响;采用实时荧光定量PCR检测chIRF7基因在鸡胚发育第14 d（E14d）及鸡出壳第1 d（H1d）、第7 d（H7d）和第14 d（H14d）不同组织中的表达情况。【结果】将从鸡外周血淋巴细胞中扩增获得的chIRF7基因CDS序列插入真核表达载体pEGFP-C1的酶切位点即成功构建获得重组真核表达载体pEGFP-chIRF7。chIRF7蛋白二级结构由无规则卷曲（占51.12%）、α-螺旋（占26.48%）、延伸链（占16.70%）和β-转角（占5.70%）组成;鸡与其他禽类、人类和哺乳动物的IRF7氨基酸序列相似性均较低,且5个功能结构域不保守。经聚肌胞苷酸［Poly （I:C）］或NDV处理DF-1细胞后,可使融合蛋白EGFP-chIRF7由细胞质定位转变为细胞核定位;而在细胞内过表达融合蛋白EGFP-chIRF7可降低NDV的复制能力和细胞致病性。chIRF7基因在鸡不同发育阶段各组织中均有不同程度的表达,且以肺脏中的相对表达量最高,其次是肝脏和腺胃,在腿肌中的相对表达量较低;从E14d发育到H14d,chIRF7基因在肺脏中的表达呈先下降后趋于稳定的变化趋势,在肝脏、腺胃、心脏和腿肌中呈先下降后上升再下降的变化趋势,在脑组织中呈先稳定再下降的变化趋势,在胸肌和眼球中的表达则趋于稳定。【结论】 IRF7在不同物种中的相似性较低且结构域不保守,经外界刺激诱导表达的chIRF7会发生细胞核移位而具有抗病毒感染效果。IRF7基因在鸡不同发育阶段的肺脏、肝脏和腺胃中高表达,说明对这3个组织的发育可能具有调控作用。     

延边黄牛转铁蛋白受体2基因克隆与序列分析

【目的】克隆延边黄牛转铁蛋白受体2（transferrin receptor 2,TFR2）基因,并分析该基因在不同组织器官中的表达分布。【方法】通过提取肝脏组织总RNA,采用RT-PCR及RACE方法克隆延边黄牛TfR2基因,采用生物信息学软件进行序列分析,用半定量PCR（SqRT-PCR）方法分析TfR2基因在不同组织器官中的表达分布规律。【结果】①成功克隆出了延边黄牛TfR2基因完整ORF区及3′UTR区（GenBank登录号：GU553087）,该基因全长2 901 bp,ORF区2 412 bp,编码803个氨基酸;②延边黄牛TfR2基因核苷酸序列与其它物种的同源性在80%以上,不同物种间TfR2基因氨基酸序列,尤其是影响其功能的关键氨基酸位点高度保守;③各物种TfR2蛋白功能结构域同样高度保守;④牛TfR2基因主要在肝脏中表达,其它组织,如脾脏、心脏、肾脏和肠道（十二指肠）中也存在少量表达。【结论】不同物种间TfR2基因具有高度同源性,功能结构域及组织分布规律具有高度保守性。     

暗纹东方中BAFF基因相关序列的性质探讨

[目的]为探索暗纹东方基因组中是否存在BAFF基因。[方法]通过比对人、小家鼠、野猪、原鸡的BAFF基因cDNA序列,获取高度保守的同源片断。根据红鳍东方基因组文库序列设计引物,从野生暗纹东方肌肉样品中提取总DNA进行PCR扩增,并进行PCR产物的克隆与测序。[结果]通过PCR扩增获得3条特异性条带,大小分别为542、349、221 bp。在红鳍东方基因组文库中未找到与542 bp序列匹配的片段。349和221 bp序列在暗纹东方和红鳍东方中是保守的。暗纹东方与红鳍东方序列比对结果表明,碱基突变的主要方式为插入或缺失。[结论]3个扩增条带为BAFF基因相关序列的可能性较小。在鱼类生物体中很可能不存在与哺乳类、鸟类BAFF同源基因。     

不同土壤水分测定方法的比较研究

[目的]为正确使用TDR法和FDR法测定土壤水分含量提供理论依据。[方法]以铝盒烘干法为标准,通过对TDR法和FDR法进行校验,明确它们的优缺点及土壤温度对测定结果的影响。[结果]室内模拟试验结果表明：3条曲线具有相同的变化趋势;横坐标在3.0~23.0时,θT比θF更接近真实值（θv）;横坐标在18.0~23.0时,θT与θv基本一致;横坐标大于23.0时,θv、θT和θF之间的差距甚小。田间试验结果表明：除了2、3、4和8点,FDR的测定结果与θv的差距都很大;TDR的测定结果与θv的差距都很小。综合分析结果表明：FDR的曲线在最下面,与θv的曲线始终保持一段距离,它们之间只有2个交点;TDR和θv的曲线都在上面,它们距离很小,有7个交点,说明TDR的测定准确度比FDR的高。[结论]用TDR法测定土壤含水量准确、方便、快捷。     

副溶血性弧菌的检测研究

[目的]对toxR进行副溶血性弧菌特异性检测,探讨toxR靶基因能否准确检测副溶血性弧菌,从而消除其他研究者对该基因特异性的疑虑。[方法]采用SN/T1870—2016中副溶血性弧菌toxR的引物探针对副溶血性弧菌和其亲缘关系接近的弧菌标准菌株进行检测。[结果]采用实时荧光PCR方法证实该引物探针只能扩增出副溶血性弧菌,其他弧菌诸如溶藻弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌等未得到扩增。[结论]证实SN/T1870—2016中toxR的引物探针特异性高。该研究可为各检测机构提供数据支持,为副溶血性弧菌的检测与研究奠定更为坚实的基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白2的生物信息学分析

[目的]为临床上构建PRRSV的拮抗性小肽及相关疫苗设计提供理论参考。[方法]对NCBI上国内分离的PRRSV毒株(FJ175688.1)Nsp2的氨基酸序列进行生物信息学方法分析,并对其组分、理化性质、跨膜结构域、二级结构、糖基化位点、磷酸化位点和B细胞抗原表位进行预测。[结果]Nsp2含有7段的跨膜区域,二级结构中自由卷曲含量最高(57.64%),同时含有4个糖基化位点和76个磷酸化位点。综合分析表明,Nsp2具有大量的抗原决定簇。[结论]通过对Nsp2的生物信息学分析,可为PRRSV疫苗设计提供理论基础。     

保定苜蓿锌离子跨膜转运蛋白的生物信息学分析(英文)

[目的]对保定苜蓿锌离子跨膜转运蛋白(Zinc transporter,ZnT)进行生物信息学分析。[方法]利用保定苜蓿锌离子跨膜转运蛋白氨基酸序列,应用生物信息学软件预测了该蛋白质的理化性质、分子表面亲/疏水性及二级结构,并利用不同的在线工具对其跨膜区域结构进行了对比预测。[结果]ZnT蛋白是一个整体疏水性蛋白,含有408个氨基酸,理论等电点为5.94;3种不同的跨膜预测工具预测得到相同的结果,即其存在7个可能的跨膜疏水区域,二级结构中α-helix(Hh)占48.04%、Extended strand(Ee)占9.56%、Random coi(lCc)占42.40%。这与其跨膜蛋白的性质相一致。[结论]mZnT属于锌离子跨膜转运蛋白的CDF家族,负责将细胞膜内的Zn2+转运出细胞,从而降低Zn2+的浓度与毒害。     

新疆出口主要农产品转基因成分检测

[目的]通过对2005～ 2011年共计7年新疆出口农产品的转基因成分进行检测,了解新疆出口农产品中有无转基因产品.[方法]用试剂盒法提取供试样品的核酸,采用中国出入境检验检疫行业标准SN/T 1204- 2003、SN/T 1943 - 2007、SN/T 2584 - 2010、SN/T 2668 - 2010的实时荧光PCR法进行转基因成分检测.[结果]共检测新疆出口农产品16种513批次,所有样品中均未发现含有转基因成分.[结论]新疆出口农产品均无转基因产品,新疆出口植物产品转基因成分检测以番茄制品为主,共计409批次,占79.8;,新疆生产加工的番茄制品遭受到转基因污染的风险很低.     

动物组蛋白H3K4三甲基化转移酶MLL3的生物信息学分析

[目的]对动物组蛋白H3K4三甲基化转移酶MLL3进行生物信息学分析。[方法]利用生物信息学的方法,对小鼠MLL3的基因结构、氨基酸序列、系统进化树、染色体定位和共线性等问题进行分析。[结果]编码合成的小鼠MLL3蛋白质一级结构包括7个锌指结构域、1个HMG-box(高迁移率族蛋白)、1个FYRN(N-末端富含苯丙氨酸或酪氨酸区域)、1个FYRC(C-末端富含苯丙氨酸或酪氨酸区域)、1个SET域和1个postSET域;从序列对比和同源性上发现,该研究中的19种动物都基本上具有这些结构,说明这些结构在进化上是相对保守的,其中SET域具有高度的保守性,是维持组蛋白甲基化酶活性所必须的;从系统发生上看,19种动物在进化树上的位置与其分类地位相一致;在共线性分析中,虽然小鼠和人的MLL3基因位于不同的染色体上,但其上游和下游具有相同的基因,说明小鼠和人的MLL3基因具有共线性。[结论]不仅揭示了MLL3的核苷酸序列及其氨基酸序列的一级结构,为以后研究其高级结构和蛋白质的功能奠定了基础;同时也为后期进行小鼠MLL3基因的引物设计、启动子分析、基因的克隆、定位和表达的调控模式研究奠定了基础。     

山葡萄北冰红VvCOR413-I1基因克隆及生物信息学分析

[目的]从山葡萄北冰红中克隆耐寒基因COR413,并对其功能进行生物信息学分析。[方法]利用RT-PCR法克隆山葡萄北冰红基因COR413,并利用生物信息学对其进行分析。[结果]它包括630 bp完整的开放阅读框,推测编码210个氨基酸,蛋白的分子量(MW)为59.18 k D,等电点(p I)值为10.74。其蛋白结构以α-螺旋、延伸链为主,其次为无规则卷曲,β-转角所占比例最少,含有4个跨膜结构域。多重序列比对表明VvCOR413-I1与其他植物COR413的氨基酸序列相似性为63.00%~68.33%。[结论]该研究为深入了解VvCOR413-I1功能奠定了基础。     

蓖麻RcAKT1基因的克隆与序列分析

[目的]对蓖麻Rc AKT1基因进行克隆和序列分析。[方法]提取盐胁迫处理的蓖麻新鲜叶片总RNA,采取RACE法克隆蓖麻Rc AKT1基因的3'末端和5'末端,利用生物信息学软件DNAman对两端序列进行拼接,最后设计一对特异性引物,从而获得蓖麻Rc AKT1基因的ORF全长序列,并对该序列进行生物信息学分析。[结果]该基因的开放阅读框序列长度为2 253 bp,推测可不间断编码751个氨基酸。选取其他植物的AKT1序列与蓖麻Rc AKT1序列进行比对,结果显示同源性很高,其一致性在84%~97%。[结论]经过生物信息学分析,发现蓖麻Rc AKT1属于ANK超级家族,是亲水性蛋白质。     

动物组蛋白H3K4三甲基化转移酶MLL3的生物信息学分析(英文)

[目的]对动物组蛋白H3K4三甲基化转移酶MLL3进行生物信息学分析,从而探寻其相对保守的进化过程以揭示组蛋白H3K4三甲基化转移酶MLL3在在人类癌症的中的作用。[方法]利用生物信息学的方法,对小鼠MLL3的基因结构、氨基酸序列、系统进化树、染色体定位和共线性等问题进行分析。[结果]编码合成的小鼠MLL3蛋白质一级结构包括7个锌指结构域、1个HMG-box(高迁移率族蛋白)、1个FYRN(N-末端富含苯丙氨酸或酪氨酸区域)、1个FYRC(C-末端富含苯丙氨酸或酪氨酸区域)、1个SET域和1个postSET域;从序列对比和同源性上发现,该研究中的19种动物都基本上具有这些结构,说明这些结构在进化上是相对保守的,其中SET域具有高度的保守性,是维持组蛋白甲基化酶活性所必须的;从系统发生上看,19种动物在进化树上的位置与其分类地位相一致;在共线性分析中,虽然小鼠和人的MLL3基因位于不同的染色体上,但其上游和下游具有相同的基因,说明小鼠和人的MLL3基因具有共线性。[结论]不仅揭示了MLL3的核苷酸序列及其氨基酸序列的一级结构,为以后研究其高级结构和蛋白质的功能奠定了基础;同时也为后期进行小鼠MLL3基因的引物设计、启动子分析、基因的克隆、定位和表达的调控模式研究奠定了基础。