哺乳动物早期胚胎发育调控的研究进展

精子和卵子结合形成受精卵后,最初的胚胎分裂周期调控是由储存在卵母细胞内的因素调控的,随着母源因子的降解,合子基因组激活并进行转录,自此,胚胎发育的一系列事件均由合子因素调控,这一过程称为母源-合子转换期,包括母体成分(mRNA和蛋白质)的降解和胚胎基因组激活。在这一过程中,组蛋白修饰、染色质开放程度以及染色质结构变化等表观遗传信息在配子发生和早期胚胎发育过程中经历了广泛的构建、消除以及重建过程。组蛋白和染色质结构的改变以及转录因子的可用性都受细胞周期依赖机制的调控,这对正确控制基因组激活的时间和激活的基因序列至关重要。本文将重点讨论组蛋白修饰在控制基因组转录方面的作用,以及细胞周期在控制细胞核和细胞质事件中所起的作用和转录因子对早期胚胎调控的影响。     

紫外激光交联和染色质免疫沉淀技术及其应用

紫外激光交联和染色质免疫沉淀技术(UV laser crosslinking and chromatin immunoprecipitation,UV-X-ChIP)是研究蛋白质与DNA的相互作用及鉴定转录因子靶DNA的一条新途径。该技术结合DNA芯片、Southern杂交及DNA文库的构建可用于研究蛋白质与DNA的相互作用及高通量筛选已知转录因子在全基因组范围内的结合位点,这为转录因子调控网络的绘制奠定基础。笔者对紫外激光交联和染色质免疫沉淀技术及应用作一综述。     

鸡卵清溶菌酶5′端激素受体结合位点的克隆与序列分析

应用PCR技术从鸡输卵管组织基因组中扩增出0.35kb的鸡卵清溶菌酶5′端激素受体结合位点的基因片段.序列分析表明,该区域含有2个睾酮激素受体识别位点和2个皮质酮激素受体识别位点,具备输卵管定位表达调控增强能力,为构建融合定位表达启动子调控外源基因在鸡输卵管定位表达奠定了基础.     

牛SOCS5基因5'调控区多态性研究

[目的]筛选SOCS5基因启动子区多态位点(SNP),并研究其对启动子功能元件的影响.[方法]选择贵州地方优良品种务川黑牛和中国荷斯坦奶牛两种生长性能差异明显的品种构建DNA池,直接测序后用DNASTAR软件进行序列拼接和校正,BLAST分析SOCS5基因多态性,然后用生物信息学软件预测序列核心启动子区和CpG岛,分析SNP位点对转录因子结合位点影响.[结果]牛SOCS基因5调控区和第1外显子区存在3个SNP位点,分别为:C-577T、T-43C和C+61T,其中C+61T与SNP数据库中的rs110977810信息相符,C-577T和T-43C为新发现SNP位点.生物信息学软件预测得到SOCS5基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近大量转录因子结合位点消失和新位点产生;SNP位点对转录因子结合位点有显著影响,但对核心启动子范围和起始位点无明显影响,不在甲基化水平上影响SOCS5基因表达水平.[结论]牛SOCS5基因5'调控区存在3个对启动子功能元件有较大影响的SNP位点.     

酵母基因上游转录因子结合位点分布的统计分析

【目的】揭示真核生物基因上游转录因子结合位点的分布规律。【方法】挖掘了啤酒酵母基因组数据库(SGD)中基础域结构和β支架结构两超类(superclass)的转录因子结合在基因上游0~2 000 bp的位置;将转录因子按照结构和调节基因的不同功能进行聚类,并对其组内和组间的结合位点数进行比较分析。【结果】转录因子结合位点集中分布在转录起始位点上游100~500 bp(61%);结构差异较大的转录因子的结合位点分布差异显著(P<0.01);大多转录因子(19/22)在不同功能基因间结合位点分布差异不显著(P>0.05)。【结论】转录因子结合位点分布与转录因子的结构相关性较大,而与所调控基因的功能相关性较小。推测不同家族转录因子结合位点在基因上游的分布具有特异性,有助于提供新的参数用以改进现有理论预测转录因子结合位点的方法。     

江口萝卜猪UCP2基因启动子变异分析

[目的]研究江口萝卜猪UCP2基因启动子变异,并对其进行生物信息学分析,为江口萝卜猪品种选育及开发利用提供理论依据.[方法]利用江口萝卜猪基因组DNA构建混合DNA池,PCR产物直接测序后采用DNASTAR等生物软件分析筛选出SNP位点,然后采用Neural Network Promoter Prediction、TFsitescan、WebGene等生物信息学分析软件预测单核苷酸突变前后的UCP2基因启动子核心区域、转录因子结合位点和CpG岛.[结果]在江口萝卜猪UCP2基因启动子上共筛选到3个SNPs位点,分别是G-84>A、G-161>C和T-366>A.利用生物信息学分析软件分析单核苷酸突变对UCP2基因启动子核心区域、转录因子结合位点及CpG岛的影响,结果发现,从江口萝卜猪UCP2基因启动子上筛选到的3个SNPs位点均不在预测到的启动子核心区域,但靠近转录起始点;3个SNPs位点也不在预测得到的CpG岛内,且不会影响UCP2基因启动子的甲基化水平;3个SNPs位点能在不同程度上导致转录因子结合位点消失或产生新的转录因子结合位点,其中G-161>C突变对转录因子结合位点的影响最大.[结论]从江口萝卜猪UCP2基因启动子上筛选到3个SNPs位点,分别为G-84>A、G-161>C和T-366>A,虽然这3个SNPs位点均不在启动子核心区域及CpG岛内,但不同程度造成转录因子结合位点消失或产生,其中G-161>C的影响最大,可能是调控UCP2基因表达的重要功能突变位点.     

桃树PpGL2转录因子基因克隆及生物信息学分析

[目的]克隆桃树同源异型—亮氨酸拉链(HD-ZIP)基因(PpGL2),并对其进行生物信息学分析,为研究HD-ZIP转录因子在植物生长发育过程中的调控机制提供理论依据.[方法]采用RT-PCR从桃树品种春喜中克隆Pp-GL2基因的开放阅读框(ORF)全长,对其进行序列分析,并构建其亚细胞定位表达载体,通过基因枪法转化洋葱表皮细胞后在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的分布情况;同时利用酵母单杂交方法检测其转录活性和DNA结合位点及活性.[结果]从桃树幼叶中克隆获得PpGL2基因,其ORF全长为2253 bp,编码750个氨基酸,以碱性氨基酸较多,含典型的START结构域,属于HD-ZIP转录因子家族的Ⅳ亚族,是一种核定位蛋白.PpGL2转录因子与核桃、可可、苹果等HD-ZIP转录因子的氨基酸序列同源性均在84.60%以上,其中与苹果HD-ZIP转录因子(XP_008384034.1)的同源性最高,为92.41%,表明不同物种的HD-ZIP转录因子氨基酸序列高度保守.PpGL2在酵母细胞中具有转录活性和DNA结合活性,可特异性结合回文序列CAATAATTG.[结论]PpGL2转录因子属于HD-ZIP转录因子家族的IV亚族,定位于细胞核,与DNA的结合位点是回文结构CAAT(A/T)ATTG,可能参与调节桃树的生长、发育及抗逆性等重要生理过程.     

利用5''LongSAGE标签分析蜜蜂肌球蛋白调节性轻链基因MLC-2选择性转录起始位点

使用西方蜜蜂雄蜂头部5’LongSAGE文库中的肌球蛋白调节性轻链基因MLC-2的标签序列,在蜜蜂全基因组序列上定位了该基因的转录起始位点(TSS),并进而预测了其启动子的结构。结果显示:蜜蜂MLC-2基因存在17个TSS,其中16个定位于MLC-2基因开放阅读框上游100bp的范围内。MLC-2基因的各TSS的使用效率不同,其中有3个优势TSS,由之起始的转录本分别占该基因总转录本数量的9.76%、54.47%和11.38%。从碱基组成来看,蜜蜂MLC-2基因TSS的第1个碱基为A、G、T、C的概率分别为58.8%、29.4%、0和11.8%。MLC-2基因的启动子结构预测结果表明,在TSS上游的300bp区域内有3个核心启动子元件。研究结果对研究蜜蜂MLC-2基因的表达调控与确定其全长cDNA序列具有重要意义。     

鸡卵清溶菌酶5’端激素受体结合位点的克隆与序列分析

应用PCR技术从鸡输卵管组织基因组中扩增出0．35kb的鸡卵清溶菌酶5，端激素受体结合位点的基因片段。序列分析表明，该区域含有2个睾酮激素受体识别位点和2个皮质酮激素受体识别位点，具备输卵管定位表达调控增强能力，为构建融合定位表达启动子调控外源基因在鸡输卵管定位表达奠定了基础。     

The glucocorticoid receptor: rapid exchange with regulatory sites in living cells

Steroid receptors bind to site-specific response elements in chromatin and modulate gene expression in a hormone-dependent fashion. With the use of a tandem array of mouse mammary tumor virus reporter elements and a form of glucocorticoid receptor labeled with green fluorescent protein, targeting of the receptor to response elements in live mouse cells was observed. Photobleaching experiments provide direct evidence that the hormone-occupied receptor undergoes rapid exchange between chromatin and the nucleoplasmic compartment. Thus, the interaction of regulatory proteins with target sites in chromatin is a more dynamic process than previously believed.     

Histone replacement marks the boundaries of cis-regulatory domains

Cellular memory is maintained at homeotic genes by cis-regulatory elements whose mechanism of action is unknown. We have examined chromatin at Drosophila homeotic gene clusters by measuring, at high resolution, levels of histone replacement and nucleosome occupancy. Homeotic gene clusters display conspicuous peaks of histone replacement at boundaries of cis-regulatory domains superimposed over broad regions of low replacement. Peaks of histone replacement closely correspond to nuclease-hypersensitive sites, binding sites for Polycomb and trithorax group proteins, and sites of nucleosome depletion. Our results suggest the existence of a continuous process that disrupts nucleosomes and maintains accessibility of cis-regulatory elements.     

玉米SNAC转录因子的基因结构特征与逆境调控预测

NAC蛋白是植物特有的转录因子,在植物发育和各种非生物逆境应答中发挥着重要作用。为更好地揭示玉米SNAC(stress-responsive NAM,ATAF1/2,CUC2)家族的耐逆境胁迫功能,对其基因的结构特征及可能的调控机理进行了预测。利用生物信息学方法,鉴定了玉米16个SNAC家族基因,并对该基因家族各编码蛋白的理化性质、基因结构、潜在的磷酸化位点、蛋白质二级结构、基因进化关系、基因组序列结构和启动子结合元件等信息进行分析。分析结果表明：玉米16个SNACs不具有跨膜结构,且均具有N-末端保守结构域和高度可变的C-末端结构域。系统发育分析表明,同一亚群中密切相关的成员具有相似的基因结构,推测在不同植物中会具有类似的耐逆功能。磷酸化位点分析表明,玉米SNAC家族存在着大量的磷酸化位点。二级结构预测表明,玉米SNAC的转录调控区具有高度的内在灵活性。启动子分析表明,玉米SNAC家族基因启动子区域均含有大量的逆境胁迫应答顺式作用元件。这些结果为玉米耐逆境研究提供了候选基因,对促进玉米SNAC家族功能分析的进展具有重要意义。     

奶牛β-酪蛋白基因的克隆及序列分析

利用高保真PCR技术扩增了黑白花奶牛β-酪蛋白基因(CSN2)5'和3'调控成分,纯化PCR产物与pMD19-TVector亚克隆后酶切鉴定和测序.结果表明:克隆片断与奶牛β-酪蛋白基因相应区域同源性分别为97.0%和99.0%,并且包含有大部分的CSN2表达核心调控序列和多个转录、翻译因子的结合位点,获得了黑白花奶牛β-酪蛋白基因调控区的克隆.为构建乳腺特异表达载体,指导外源基因在转基因动物乳腺内高效表达奠定了基础.     

预测酵母内含子中的转录调控元件

基于酵母基因非编码序列中寡核苷酸的出现频率 ,拟用期望频率法从转录效率较高的内含子序列中提取到一些过表达的寡核苷酸。将提取的寡核苷酸与其它方法获得的结果和试验证实的转录因子结合位点相比较 ,结果显示这些寡核苷酸可能是潜在的转录因子结合位点。这些推测有待试验的进一步证实     

预测酵母内含子中的转录调控元件*

 基于酵母基因非编码序列中寡核苷酸的出现频率，拟用期望频率法从转录效率较高的内含子序列中提取到一些过表达的寡核苷酸。将提取的寡核苷酸与其它方法获得的结果和试验证实的转录因子结合位点相比较，结果显示这些寡核苷酸可能是潜在的转录因子结合位点。这些推测有待试验的进一步证实。     

拟南芥黑芥子酶基因根特异性表达启动子的克隆

黑芥子酶是一类催化芥子油苷水解的同工酶, pyk10 是一个在拟南芥根和下胚轴中特异表达的黑芥子酶基因。本研究用PCR方法从拟南芥Columbia生态型基因组中克隆了pyk10 基因启动子片段。序列分析表明:该片段全长1 454 bp,与已发表的pyk10 启动子序列(GenBank accession no. AJ292756)同源性达98%。该启动子片段中含有多种其他植物基因启动子中发现的通用启动子元件,并含有器官和组织特异性转录因子的结合位点ACGT-、CANNTG-、GATA-以及I盒等顺式元件。