禽流感病毒H5亚型HA1基因的原核表达及纯化

根据已报道的禽流感病毒H5 亚型HA1基因设计1对引物,利用RT-PCR技术扩增目的基因片段,将扩增片段插入到pPROEX-HTb表达载体上,并对重组表达质粒进行 PCR酶切鉴定,通过序列测定验证读码框,并在大肠埃希氏菌BL21(DE3)中进行表达.结果表明:扩增出的1 000 bp的基因片段在大肠埃希氏菌中成功表达,...     

CRP基因原核表达载体的构建和表达及其免疫原性检测

采用大肠杆菌表达体系来获得C-反应蛋白(CRP)融合蛋白。以pDNR-CRP质粒为模板,用PCR方法扩增获得全长的CRP基因,将其克隆入表达载体pET28 a( )中,再转化到宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG诱导表达,表达产物做SDS-PAGE电泳分析,最后做免疫原性检测。成功地构建了CRP基因原核表达载体pET28 a( )-CRP,经IPTG诱导SDS-PAGE电泳分析表明C-反应蛋白能在大肠杆菌中获得表达,但免疫原性检测初步结果为阴性。结果证明CRP能以融合蛋白的形式在宿主菌BL21(DE3)中得到大量表达,表达产物缺乏免疫原性,其机理还有待进一步试验探讨。     

鹅细小病毒Rep1蛋白的原核表达及抗体制备

为深入研究鹅细小病毒(GPV)Rep蛋白的功能,采用PCR方法扩增出完整的Rep1基因,并克隆入原核表达载体pET-28a(+)。将重组质粒pET28-Rep1导入到大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。SDS-PAGE分析表明:37℃下经1mmol·L~(-1) IPTG诱导4h,Rep1蛋白可获得高效表达。重组蛋白经切胶免疫BALB/c小鼠制备针对Rep1蛋白的多克隆抗体。经间接免疫荧光检测,1∶1 000稀释的多抗能特异性识别在鹅胚成纤维细胞上增殖的GPV抗原,说明所制备的多抗具有良好反应原性,可用于后续针对Rep蛋白的相关功能研究。     

FMDV非结构蛋白3A和3B的表达与反应活性分析

根据已测得的O/China/99口蹄疫病毒(FMDV)基因组序列,设计两对特异性表达引物,以带有O/Chi-na/99 3ABC基因片段的重组质粒pGEM-3ABC为模板,扩增得到了3A、3B基因,通过两端的BamHI和SalI酶切位点插入原核表达载体pET28a,将重组表达质粒转化宿主菌BL21,用IPTG诱导表达目的蛋白.表达产物经SDS-PAGE检测表明,3A和3B基因成功的在大肠埃希氏菌中得到了表达;通过Western blotting分析和斑点ELISA分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应.     

冰核细菌Erwinia ananas 110 冰核基因iceA的原核表达及冰核活性分析

为获得具有高冰核活性的基因工程菌,从冰核细菌Erwinia ananas 110扩增冰核基因iceA,将其克隆到pMD19–T载体上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定并测序;阳性克隆目的片段亚克隆到表达载体pET–23a(+)上,转化大肠杆菌DH5α,单、双酶切鉴定重组质粒;阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,并经IPTG诱导表达。SDS–PAGE电泳检测表明,冰核基因iceA能够并以包涵体形式表达,相对分子质量约为180 000。冰核活性测定结果表明,重组菌BL21(DE3)pLysS/pET–ice的冰核活性与野生冰核细菌Erwinia ananas 110在–5、–4、–3、–2 ℃下无明显差别。     

人防御素 hβD-3基因在大肠埃希菌中的融合表达

研究了人类防御素hβD-3基因在大肠埃希菌细胞中的融合表达,采用pET-32a(+)载体在BL21(DE3)溶原菌中进行了F-βD-3蛋白的融合表达.结果表明,F-βD-3蛋白的表达量达到127.23μg/mL,融合蛋白经镍柱亲和层析与肠激酶酶切后,最终得到hβD-3蛋白的量为18.17μg/mL.经对大肠埃希菌K12D31的抑菌试验鉴定,肠激酶酶切后产物为有抑菌活性的重组hβD-3蛋白.     

牛生长激素基因工程菌的构建及其诱导表达

为获得牛生长激素(BST)蛋白,构建了工程菌并进行了诱导表达.先设计2对引物,从pUCm-T-BST克隆中扩增出BST成熟蛋白编码序列,双酶切后分别插入表达载体(pET30 a和pET29 a),转化E.coliDH5α并进行阳性克隆鉴定;再将重组质粒分别转化到E.coliBL21(DE3)和RosettaTM(DE3)pLysS中,构建BST原核工程菌;最后进行诱导表达.结果表明,重组表达载体pET30 a-BST和pET29 a-BST中均插入了正确的目的基因;经IPTG诱导后,以BL21(DE3)为宿主的工程菌无目的蛋白表达,而pET30 a-BST/RosettaTM和pET29 a-BST/RosettaTM分别可见分子量约29.5,26.5 kD的融合蛋白表达,约占菌体蛋白的26%,35%.说明稀有密码子限制BST基因在E.coli中的表达,选择适宜的宿主菌可克服此障碍.     

TTMV ORF1基因的原核表达及表达产物抗原性初步鉴定

参照Torque teno mini virus(TTMV)2型的ORF1基因序列,设计一对特异性引物,成功扩增出ORF1基因,并将其转化至表达载体pET-28a中,成功构建原核表达质粒pET28a-ORF1,并导入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达.SDS-PAGE分析结果表明,ORF1基因在大肠杆菌中获...     

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因的原核表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M基因序列设计2对引物,通过PCR扩增得到了PRRSV M基因的全长片段和N-末端截短67个氨基酸序列的MNd67基因片段,分别将这些片段插入到表达质粒pET-28a(+)的多克隆位点上构建重组表达质粒,PCR、酶切及测序鉴定表明,成功构建了2种重组表达质粒(pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67)。重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)后利用α-乳糖诱导其表达,SDS-PAGE电泳分析表明,E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV MNd67成功表达分子质量为14ku的重组蛋白,而E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV M未见明显的表达蛋白。试验结果表明已成功表达截短的PRRSV M蛋白,可为PRRSV诊断抗原和疫苗研究奠定基础。     

微小隐孢子虫Cp735基因的克隆及原核表达

采用PCR方法从微小隐孢子虫基因组中扩增cp735基因.与pMD- 18T载体连接后,挑取阳性重组子测序分析.用基因重组技术将Cp735基因克隆入原核表达载体pET-28a中,构建Cp735基因的重组原核表达载体pET28a-Cp735.将pET28a-Cp735在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,并用SDS- ...     

一种新型糖苷水解酶的异源表达及酶学性质研究

为得到MtGH6最优的表达宿主，构建了质粒pET21a–MtGH6、pBES–MtGH6、pPICZαA–MtGH6，以大肠埃希菌BL21、枯草芽孢杆菌RIK1285及毕赤酵母GS115为工程菌，对MtGH6进行异源表达及分离纯化，并对表达MtGH6的3个宿主菌的生长状况、产酶量、纯化回收率、酶活力等参数进行比较分析。结果表明：大肠埃希菌BL21及枯草芽孢杆菌RIK1285在生长稳定后，OD值维持在1.5，而毕赤酵母GS115生长稳定后，OD值维持在2.0；毕赤酵母GS115生产的MtGH6为77 mg/L，纯化回收率为15.40%，产酶量和纯化回收率均高于大肠埃希菌BL21、枯草芽孢杆菌RIK1285生产的MtGH6；由毕赤酵母GS115表达的MtGH6的酶活力为15.60 U/mg，由大肠埃希菌BL21及枯草芽孢杆菌RIK1285表达的MtGH6分别为7.45、10.06 U/mg，说明毕赤酵母GS115是MtGH6的最优表达宿主；对其分泌的MtGH6的酶学性质展开研究，结果表明在降解微晶纤维素的反应中，该酶最适pH为8.0，最适温度为60 ℃， 添加0.5 mmol/L Mn2+可使其活性提高，表明MtGH6在生物燃料生产中可能具有良好的应用前景。     

产气荚膜梭菌青海分离株α毒素基因克隆与表达

用PCR技术,从一株田间分离的产气荚膜梭菌基因组中扩增出了1 194 bp的α毒素基因,经限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Nco Ⅰ双酶切处理后将其连接在经同样内切酶处理的载体pET\|28a(+)中的相应位点上,最后转化至受体菌BL21(DE3)中。经PCR、双酶切和核苷酸序列分析,证明重组质粒pET\|28a\|CPA含有产气荚膜梭菌α毒素基因,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,目的基因获得了良好表达。以羊抗α毒素多克隆血清进行Western blot分析,抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应,表明目的蛋白具有较好的免疫原性。     

β变形菌多聚磷酸激酶PPK2的原核表达及纯化

多聚磷酸激酶2(Polyphosphate kinase 2, PPK2)在众多病原菌的致病性中发挥重要作用,而人等后生动物体内未发现ppk2基因,因而PPK2是新型抗生素开发的靶点。为探索β变形菌CB中PPK2在大肠埃希菌中的可溶性表达,获得纯度、浓度均可用于蛋白质晶体学研究的PPK2蛋白。首先,采用生物信息学方法对PPK2蛋白的基本理化性质和二级结构进行预测,利用限制性核酸内切酶酶切位点NdeΙ和HindⅢ将ppk2基因插入到原核表达载体pET30a中,并通过全质粒酶切法和目的基因测序确认重组表达载体PPK2/pET30a的准确性;接下来,重组表达载体通过物理法转入大肠埃希菌BL21(DE3)菌株中,利用IPTG诱导目的蛋白PPK2在37℃、25℃和16℃下试表达,并通过SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定分析表达产物;最后,利用3 L表达菌液进行放大培养,表达产物先后经Ni-IDA亲和色谱柱、阴离子交换色谱柱和凝胶过滤色谱柱分离纯化。结果显示:大肠原核表达系统可在16℃、终浓度为0.2m M·L~(-1)的IPTG诱导下稳定高效表达以可溶性单体形式存在的,相对分子质量约为35 ku的PPK2蛋白;放大培养中产生的PPK2蛋白经系列色谱法纯化后浓度可达12 mg·mL~(-1),纯度为95%,可用于PPK2蛋白的结构和功能研究。     

猪瘟病毒E2基因的克隆表达

PCR扩增猪瘟病毒(CSFV)定点突变后的E2基因,克隆至原核表达载体质粒pET-28a中,重组质粒pET28a-E2转化BL21(DE3),IPTG诱导,高效表达了E2基因,表达量达菌体总蛋白的25.3%。免疫印迹表明,所表达的蛋白是CSFV特异性的。     

猪流行性腹泻病毒3种结构蛋白的原核表达与免疫原性分析

根据大肠埃希菌密码子使用的偏嗜性,对G2b亚型猪流行性腹泻病毒(PEDV)JSX2014株S基因(94~525、1 306~1 641nt 2个区域)、M基因(544~669nt)和N基因(397~960nt)进行优化和基因合成,分别克隆入pET-32a(+)中,获得4种重组原核表达载体pET-Opti-S-D1、pET-Opti-S-D2、pET-Opti-M和pET-Opti-N。将重组表达载体转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定,4种重组蛋白均可获得正确表达。以表达蛋白为抗原制备的兔多抗血清,通过间接免疫荧光试验鉴定,均能与JSX2014株感染的Vero细胞发生特异性反应。进一步通过中和试验鉴定,S-D1蛋白特异性多抗血清可有效阻断JSX2014株对Vero细胞的感染。这一结果提示所表达的目的蛋白均具有良好的免疫原性,可以进一步用于G2b亚型PEDV抗体检测方法的建立。     

中华鳖白细胞介素17原核表达及多克隆抗体制备

构建中华鳖白细胞介素17(IL17)原核表达载体pET28a-IL17,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到融合蛋白HIS-IL17。以Ni-NTA柱纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰兔4次,制备抗血清,用Protein A/G纯化后得到多克隆抗体。免疫印迹结果显示,制备的多克隆抗体与纯化蛋白可发生特异性反应。本试验成功制备了中华鳖IL17蛋白多克隆抗体,为研究IL17在中华鳖免疫系统中的作用奠定了基础。     

牛生长激素基因工程茵的构建及其诱导表达

为获得牛生长激素（BST）蛋白，构建了工程菌并进行了诱导表达．先设计2对引物，从pUCm—T-BST克隆中扩增出BST成熟蛋白编码序列，双酶切后分别插入表达载体（pET30a和pET29a），转化E．coli DH5a并进行阳性克隆鉴定；再将重组质粒分别转化到E．coli BL21（DE3）和RosettaTM（DE3）pLysS中，构建BST原核工程菌；最后进行诱导表达．结果表明，重组表达载体pET30a—BST和pET29a—BST中均插入了正确的目的基因；经IPTG诱导后，以BL21（DE3）为宿主的工程菌无目的蛋白表达，而pET30a—BST／Rosetta^TM和pET29a．BST／Rosetta^TM分别可见分子量约29．5，26．5kD的融合蛋白表达，约占菌体蛋白的26％，35％．说明稀有密码子限制BST基因在E．coli中的表达。选择适宜的宿主菌可克服此障碍．     

猪日本乙型脑炎病毒NS5原核表达和多克隆抗体制备

提取猪日本乙型脑炎病毒(JEV)上海分离株的基因组RNA,反转录合成cDNA,扩增JEV-NS5基因片段,亚克隆到原核表达载体pET-28(a)上,构建重组原核表达质粒pET-28(a)-JEV-NS5,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达重组JEV-NS5蛋白,获得分子质量为103 ku的重组蛋白.该蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占总菌体蛋白的35%以上,His-band Ni+纯化后,获得高纯度重组蛋白占总蛋白的比例达75%以上.以纯化的蛋白免疫小鼠,制备小鼠抗JEV-NS5抗体,抗体效价达到3×104,并能与病毒感染的样本反应,证明该蛋白具有较好的特异性.     

丁香假单胞菌极毛蛋白hrpA基因的克隆与表达

将丁香假单胞菌番茄变种DC3000(P.syringae pv.tomato DC3000)极毛蛋白hrpA基因克隆到pET32a(+)载体上,获得重组表达载体pET32a(+)-hrpA.将重组质粒转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中,通过SDS-PAGE分析表明,在1.0mmol.L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了分子质量约为28 ku的融合蛋白(目标蛋白基因与硫氧还蛋白基因的融合表达产物).并利用Ni2+-NTA柱亲和层析分离获得纯化的HrpA蛋白,质量浓度为91.8 g.L-1.