玉米大斑病菌Stga-2及其启动子的克隆与基因表达分析

【目的】克隆玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)Gα亚基(Heterotrimeric Gproteinalpha subunit)基因及其启动子,并对其进行异源表达,为深入研究Gα基因的表达规律、基因功能和编码蛋白的特性奠定基础。【方法】首先通过简并引物PCR法获得Gα基因的同源片段,再利用Genome walking技术克隆片段的5′端和3′端侧翼序列,最后采用RT-PCR法扩增基因全长,并对基因结构和上游调控元件进行生物信息学分析。同时,利用pET原核表达系统获得基因的编码产物。【结果】获得1个玉米大斑病菌Gα基因—Stga-2的全长序列及其上游部分启动子区,并利用pET原核表达系统对Stga-2成功进行了异源表达。生物信息学分析表明,Stga-2全长1318bp,由4个内含子和5个外显子组成,编码产物包含356个氨基酸残基。在347bp的上游侧翼序列中未发现典型的TATA-box及CAAT-box,但在起始密码子上游30bp处发现了转录起始子特征序列及位于其上游能够起始真菌基因转录的C+T丰富区域,同时还有转录因子Sp1的识别位点、CCA基序(CCAmotif)及CCG重复基序(CCG repeats)等顺式作用元件。【结论】玉米大斑病菌Stga-2及其启动子的成功克隆与表达进一步丰富了植物病原真菌的生物信息学资源,为深入了解植物病原真菌信号转导途径奠定了基础。     

金柑LEAFY同源基因克隆与全序列分析

通过PCR扩增，从融安金柑基因组DNA中克隆出一条2361bp的DNA片段，该DNA克隆含有1个2081bp的LEAFY同源基因全长序列（FcLFY）。金柑LEAFY同源基因包含2个内含子和3个外显子，编码398个氨基酸。比对结果表明，金柑LEAFY同源基因与甜橙、枳的LEAFY同源基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性均为98％。该研究为今后从分子水平上研究金柑开花调控机理打下了坚实的基础。     

绿竹P5CS基因的扩增及序列分析

采用同源克隆方法从绿竹基因组中获得2个P5CS基因组片段:Do P5CS1长度为2 178 bp,包含7个内含子和8个外显子,外显子编码序列为976 bp,编码325个氨基酸残基,编码蛋白分子量34.787 4 k D,等电点(PI)5.27,N端有一个氨基酸激酶超家族(Amino Acid Kinases(AAK)superfamily)功能区,C端有一个醛脱氢酶超家族(Aldehyde Dehydrogenase(ALDH)Superfamily)功能区;Do P5CS2大小与Do P5CS1外显子序列相同为976 bp,相似性达99.6%,但缺失内含子,推测Do P5CS2为返座假基因。该研究为基因全长序列的获取和功能分析以及通过分子生物学手段提高绿竹乃至其他竹类植物的抗逆性奠定基础。     

胡杨SCL7基因及其启动子片段的克隆与分析

根据拟南芥SCL7基因序列,以杨树基因组数据库为背景克隆得到了胡杨胁迫诱导基因SCL7全长及其启动子片段,所得基因命名为PeSCL7.序列分析表明:该基因的开放阅读框1 767 bp,编码588个氨基酸,该基因不含内含子.同源性比对发现该基因属于GRAS/SCL蛋白家族中SCL4/7分支;半定量RT-PCR结果显示,P...     

大肠杆菌志贺样毒素Ⅱ型基因的分子克隆

本文克隆了含大肠杆菌志贺样毒素Ⅱ型基因的2．0kbSau3AⅠ酶切片断，对插入片段进行了核苷酸序列测定，1298bp的核苷酸序列包含2个完整的开放读框，其中SLT ⅡA亚基基因编码区长957bp，编码319个氨基酸多肽，SLTⅡB亚基基因编码区长267bp，编码89个氨基酸多肽，与已知人源的SLTⅡ基因核苷酸序列比较具有99％的同源性，与SLTⅠ结构基因相比，A亚基同源序列为56．43％，B亚基为60．15％。     

笃斯越橘CBF基因的克隆及序列分析

根据近缘植物中同源CBF基因的序列保守区设计引物,采用PCR方法,克隆出野生种笃斯越橘的CBF基因片段,将其克隆到pMD18-T Vector上.序列分析结果表明,笃斯越橘的CBF基因序列全长678 bp,编码225个氨基酸.同源性分析表明该基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他植物CBF类基因具有较高的同源性,与桃...     

球毛壳菌二烯醇内酯水解酶基因克隆及序列分析

以球毛壳茵cDNA文库中获得的二烯醇内酯水解酶基因片段(GenBank Accn：BP099060)为基础,用RACE技术克隆出该基因的全长cDNA序列。序列长919bp,由450bp的3’RACE产物和608bp的5’RACE产物拼接而成。开放阅读框762bp,编码253个氨基酸组成的多肽,蛋白分子量为27．5kD,理论等电点为5．98。利用cDNA两侧非编码区序列作引物克隆出该基因的DNA序列。序列分析表明,该基因由2个内含子和3个外显子组成,外显子与内含子剪连接区符合AG—GT规则。克隆的cDNA序列、DNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank登录(登录号分别为AY465528,AY555772,AAS66899)。     

山核桃FLOWERING LOCUST同源基因的克隆与序列分析

根据不同植物FLOWERING LOCUST（FT）同源基因序列的保守区,设计合成1对长度为18bp的PCR简并引物,以山核桃基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长度为152bp的DNA片段,克隆到pMD19-T载体上。测序及序列分析结果表明,扩增所获得的片段序列为FT基因第四外显子部分序列,不含内含子,推测共编码50个氨基酸;其序列在GenBank中注册号为FJ858260．1,同源性比对结果表明,其氨基酸序列与其他植物FT基因的同源性高达88％～96％。     

甘蓝型油菜雄性不育基因BnaX.MS1.a的克隆及其amiRNA载体的构建

根据拟南芥MS1基因已知保守序列设计特异性引物,分离克隆甘蓝型油菜中与拟南芥MS1基因同源的基因片段。应用PCR-Walking技术获得甘蓝型油菜核雄性不育基因BnaX.MS1.a,其全长3 424 bp。BnaX.MS1.a基因与拟南芥MS1基因全长序列同源性为60.3%,编码序列同源性为89.5%。根据基因序列比对结果推测开放阅读框长2 004 bp,编码667个氨基酸,分子量为765 kD,等电点为8.01。BnaX.MS1.a基因编码的氨基酸序列与已知拟南芥MS1基因编码的氨基酸序列同源性达93%。构建BnaX.MS1.a基因的amiRNA载体转化甘蓝型油菜,旨在研发核不育基因工程油菜。     

番鸭呼肠孤病毒M(M1～M3)基因序列克隆及特性分析

参考Genbank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)中片段基因序列设计合成引物,对MDRV MW9710株中片段M基因RT-PCR扩增后,进行测序和特性分析。结果显示MW9710株M1基因全长2 283bp,与MDRV S14株同源性为99.9%,与ARV同源性小于74%。M1基因仅有1个编码框13～2 211bp,编码μA蛋白,含732个氨基酸。M2基因序列全长2 155bp,与MDRV S14株同源性为99.9%,与ARV同源性小于69%。M2基因仅有1个编码框28～2 058bp,编码外壳μB蛋白。M3基因序列全长1 997bp,而ARVM3基因全长1 996bp。M3基因仅有1个编码框25～1 683bp,编码μNS蛋白。MDRV MW9710株M3基因核苷酸序列与MDRV 89330株的同源性为87.2%,与ARV同源性小于74%。MDRV MW9710株5′末端序列不保守:M1为5′-ACUUUUU,M2为5′-UCUUUUU,M3为5′-GCUUUUU,MDRV MW9710株3′末端序列UCAUC-3′保守。     

刚竹属3种重要散生竹光系统Ⅰ基因（Lhca1）的克隆、序列分析和蛋白结构预测

光系统Ⅰ(PSⅠ)在植物光合系统中具有重要功能,Lhca1是编码PSⅠ复合物中最主要的捕光色素蛋白LHCⅠ的基因。该研究采用RT-PCR法,从毛竹中克隆了捕光叶绿素a/b结合蛋白基因Lhca-Pe01(GenBank EU035496)的全长,从红壳竹和角竹中克隆了长度分别为616、613 bp的捕光叶绿素a/b结合蛋白基因片段LhcaH01(GenBank EU513200、 LhcaJ01(GenBank EU513201)。运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行预测。结果表明,LhcaPe01基因序列从第39 bp开始到第779 bp含有1个开放阅读框和一个中止密码子,该基因全长1 051 bp,在5′端有38 bp的非编码区,在3′端含有242 bp的非编码区和Poly(A) 30 bp。对这3个基因的保守片段的序列分析表明,刚竹属3种竹种毛竹、红壳竹和角竹保守区内核酸序列同源性非常高,在禾本科内不同属之间毛竹与大麦序列同源性最高,玉米次之。编码的氨基酸序列同源性与核酸序列同源性一致,最高是毛竹与大麦,水稻次之。经推测LhcaPe01编码的蛋白质等电点和分子量分别为5.400 0和22 107.34 D。蛋白质结构预测表明,毛竹、大麦、水稻、玉米的LHCⅠ蛋白结构非常相似。      

海南普通野生稻Waxy基因的分离和序列分析

根据已报道的栽培稻Waxy基因序列设计引物,对海南普通野生稻Waxy基因的DNA序列和cDNA序列进行克隆和鉴定。获得Waxy基因编码区的DNA序列3 330 bp,cDNA序列1 860 bp,该基因编码区存在13个外显子和12个内含子,编码609个氨基酸残基。海南普通野生稻与其他水稻Waxy基因序列之间存在显著差异,并且主要体现在内含子上,推测其可能影响Waxy基因的转录水平。Waxy基因聚类分析表明,栽培稻与海南普通野生稻亲缘关系较近。     

橡胶树红根病菌Fip-gpo基因的克隆及启动子分析

为预测橡胶树红根病菌(Ganoderma pseudoferreum)真菌免疫调节蛋白基因的序列特点和表达模式,采用同源克隆获得Fipgpo的c DNA和DNA的全长序列。结果表明:该基因编码区全长934 bp,编码111个氨基酸残基,分子量为12.54 k D,等电点4.66,有4个ATM磷酸化位点,与赤灵芝(G.lucidum)的Fip序列相似性为91%;其启动子区域含有59 bp的内含子,除了含有TATA-box、CAAT-box基本元件外,还含有参与光应答/调控元件、赤霉素响应元件、茉莉酸甲酯应答元件、厌氧诱导作用元件、调控在胚乳中特异表达的顺式作用元件、分生组织特异激活顺式元件及生长素反应元件。推测Fip-gpo基因的表达受激素、非生物诱导、光照等的调控。     

柱穗山羊草α-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

根据已知的普通小麦α-醇溶蛋白基因序列设计引物,采用PCR方法克隆基因并进行序列分析。从柱穗山羊草Y127中克隆得到1个α-醇溶蛋白基因序列Gli2-Z-2,它具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特征,编码区全长939 bp,编码313个氨基酸。氨基酸序列比较显示,Gli2-Z-2在多聚谷氨酰胺区比已报道的α-醇溶蛋白序列有较多的谷氨酰胺残基。     

大熊猫核糖体蛋白S17亚基基因（rps17）的克隆及序列分析

RPS17蛋白是核糖体40S亚基的组成部分,由rps17基因编码.为了解大熊猫核糖体蛋白亚基rps17基因的结构特点及其与已报道的人和其他哺乳动物核糖体蛋白亚基rps17基因的异同,分别运用RT-PCR和PCR技术,从大熊猫肌肉组织的mRNA中成功克隆了核糖体蛋白亚基S17基因的cDNA序列以及从总DNA中成功克隆了S17基因的结构基因序列.序列分析发现,大熊猫核糖体蛋白亚基S17基因的表达序列长为457bp,开放阅读框(ORF)为408bp,编码135个氨基酸的蛋白质.结构基因序列长2 368bp,含有4个外显子和3个内含子.拓扑预测显示,核糖体蛋白亚基RPS17的相对分子质量为15.52×103,PI为10.26,含有5个类型的功能位点,即:5个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶II磷酸化位点,1个酪氨酸激酶磷酸化位点,1个N-豆蔻酰化位点及1个核糖体蛋白S17Esignature位点.进一步分析发现,该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物有很高的相似性,其蛋白质的高级结构除褐家鼠外与其它物种也具有一致性.对大熊猫rps17基因及其表达的蛋白质结构的比较研究,旨在丰富和完善哺乳动物r...     

刚竹属3种重要散生竹光系统Ⅰ基因(Lhca 1)的克隆、序列分析和蛋白结构预测

光系统Ⅰ(PSⅠ)在植物光合系统中具有重要功能,Lhca1是编码PSⅠ复合物中最主要的捕光色素蛋白LHCⅠ的基因。该研究采用RT-PCR法,从毛竹中克隆了捕光叶绿素a/b结合蛋白基因LhcaPe01(GenBank EU035496)的全长,从红壳竹和角竹中克隆了长度分别为616、613 bp的捕光叶绿素a/b结合蛋白基因片段LhcaH01(GenBank EU513200)、LhcaJ01(GenBank EU513201)。运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行预测。结果表明,LhcaPe01基因序列从第39 bp开始到第779 bp含有1个开放阅读框和一个中止密码子,该基因全长1051 bp,在5′端有38 bp的非编码区,在3′端含有242 bp的非编码区和Poly(A)30 bp。对这3个基因的保守片段的序列分析表明,刚竹属3种竹种毛竹、红壳竹和角竹保守区内核酸序列同源性非常高,在禾本科内不同属之间毛竹与大麦序列同源性最高,玉米次之。编码的氨基酸序列同源性与核酸序列同源性一致,最高是毛竹与大麦,水稻次之。经推测LhcaPe01编码的蛋白质等电点和分子量分别为5.4000和22107.34 D。蛋白质结构预测表明,毛竹、大麦、水稻、玉米的LHCⅠ蛋白结构非常相似。     

杜仲糖基转移酶基因EuCGT1克隆及序列分析

本研究以杜仲(Eucommia ulmoides)7月雌株新生幼枝的树皮为材料,根据杜仲转录组测序数据中筛选的一个糖基转移酶基因(CGT)片段信息设计引物,采用SMART RACE技术,克隆了5’-端1432bp和3’-端535 bp cDNA片段,测序拼接后获得全长1 583 bp的杜仲CGT的cDNA序列。分析结果表明,该cDNA开放阅读框长1 464 bp,编码487个氨基酸,命名为EuGT基因。EuGT在NCBI中经blastn比对,显示序列与甜橙和草莓的UDP-葡萄糖基转移酶基因同源性分别为72%和67%;推测的氨基酸序列经blastp和CDD比对,显示序列与UDP-葡萄糖类黄酮3-O-糖基转移酶-6同源,其中含有UDP-葡萄糖基转移酶的保守域(pfam00201),初步推测EuCGT1蛋白属于糖基转移酶家族。本研究克隆的EuGT基因是首次从杜仲中克隆的糖基转移酶家族基因。以EuCGT1基因构建的植物表达载体pSH-35S-EuCGT1采用农杆菌介导法遗传转化烟草,获得了含EuCGT1基因的转基因烟株,移栽生长1个月的转基因烟草植株在表型上与野生型烟草无明显差异。     

烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体α亚基Btα4基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术,对烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)α亚基的1个基因进行了克隆和序列分析.获得的烟粉虱nAChR α亚基基因的全长cDNA序列含有2 090 bp,其开放阅读框编码564个氨基酸.根据该基因编码的氨基酸序列与其他昆虫乙酰胆碱受体α亚基氨基酸序列之间的相似性,将该基因命名为Btα4(GenBank注册号为EF590120).Btα4编码的α亚基含有2个结构域:N端的胞外结构域和C端的跨膜结构域,N端的胞外结构域含有2个相邻的半胱氨酸(α亚基特征序列)、15个氨基酸构成的半胱氨酸环和乙酰胆碱结合区.研究结果对于揭示烟粉虱潜在的对新烟碱类杀虫剂靶标抗性的分子机制具有重要意义.     

龙眼中性转化酶基因(DlNI)的克隆及分析

【目的】中性转化酶是果实蔗糖代谢关键酶之一,克隆中性转化酶基因对于揭示龙眼果实糖代谢具有重要的意义。【方法】以‘石硖’龙眼试材,采用RT-PCR结合RACE技术成功克隆了3个龙眼中性转化酶基因全长cDNA序列。【结果】3个龙眼中性转化酶基因全长cDNA序列分别命名为DlNI-1、DlNI-2和DlNI-3,NCBI登录号为KP769773、KP769774和KP769775,其中DlNI-1全长2090 bp,编码589个氨基酸,比对结果发现与木薯(82%)的中性转化酶基因的氨基酸序列同源性最高;DlNI-2全长2558 bp,编码709个氨基酸,比对结果发现与克莱门柚(80%)的中性转化酶基因的氨基酸序列同源性最高;DlNI-3全长2444 bp,编码805个氨基酸,比对结果发现与克莱门柚(80%)的中性转化酶基因的氨基酸序列同源性最高。3个龙眼中性转化酶基因的氨基酸序列都具有中性转化酶的12个高度保守的结构域,并且都具有2个催化残基,推测其蛋白都属于α类,且都定位于细胞器中。3个基因在不同组织中表达量具有较大差异,其中DlNI-1和DlNI-2在叶片中都具有较高的表达量,而DlNI-3在果皮组织中具有最高的表达量。【结论】成功克隆了3个龙眼中性转化酶基因,为后期深入研究中性转化酶基因结构和功能奠定基础。     

基因组步移技术克隆稀有鲫角蛋白18基因序列及序列分析

角蛋白18是角蛋白的一种,属于S型角蛋白,是在哺乳动物和两栖类动物胚胎发育中第一个表达的中间纤维蛋白。根据已发表的人、爪蟾及斑马鱼角蛋白18 DNA序列,通过DNAman同源性比较获得保守序列,并从中设计二对引物。从稀有鲫基因组中PCR扩增得到2 779 bp的角蛋白18的DNA序列片段;通过基因组步移,分别获得该基因的上游和下游序列片段;最后将获得的全基因片段克隆至质粒载体pMD19-T进行序列测定检验。结果显示所克隆的稀有鲫角蛋白18基因全长3 765 bp。对该基因进行NCBI的Blastn同源性比较分析,表明稀有鲫同斑马鱼比较角蛋白18 DNA序列存在73.6%同源相似性;同时对该基因进行生物学分析,开放阅读框(Open ReadingFrame,ORF)预测表明稀有鲫角蛋白18是含有7个外显子和6个内含子,共编码367个氨基酸的蛋白质。研究亮点:首次成功克隆了稀有鲫角蛋白18基因全长序列3 765 bp,并且通过软件预测分析得出氨基酸序列,把氨基酸序列在DNA序列中进行标记,显示稀有鲫角蛋白18基因全长序列含有7个外显子和6个内含子,共编码367个氨基酸。另外,没有采用常用的从RNA反转...