马铃薯Y病毒分离鉴定技术的研究

在马铃薯生产上,马铃薯Y病毒引起马铃薯种性退化,导致产量降低,所以必须研究出鉴定马铃薯Y病毒的方法,以便减少病毒对马铃薯的危害。通过接种指示植物,研究出了马铃薯Y病毒的分离方法、试管毒源的保存方法、生物学鉴定马铃薯病毒的方法。     

怀玉山高山马铃薯茎尖再生苗6种病毒的DAS-ELISA检测与分析

对怀玉山高山马铃薯茎尖再生苗6种病毒(马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯M病毒和马铃薯A病毒)进行了DAS-ELISA检测与分析,并比较不同茎尖脱毒方法的效率,旨在确定怀玉山高山马铃薯的病毒种类,并筛选出怀玉山高山马铃薯脱毒苗。结果表明,怀玉山高山马铃薯感染的病毒包括马铃薯卷叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯M病毒和马铃薯A病毒6种。"单纯的茎尖培养"以及"茎尖培养→热处理→茎尖培养"只能脱除部分病毒,而"茎尖培养→热处理→茎尖培养→热处理→茎尖培养"可脱除全部6种病毒。本试验成功获得了脱毒效果较好的编号为5-1-2和6-4-1以及脱毒效果最好的编号为5-3-2和6-2-2的怀玉山高山马铃薯茎尖再生脱毒苗。本试验结果为怀玉山高山马铃薯脱毒苗的工业化生产及其主粮化背景下高山马铃薯的产业化发展提供了技术支撑和理论依据。     

实时荧光RT-PCR方法检测马铃薯V病毒

为了给马铃薯V病毒提供快速灵敏的检测技术以防止其传播扩散,根据其外壳蛋白基因核苷酸保守序列设计引物和TaqMan探针,通过特异性及灵敏度试验建立该病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法检测灵敏度高,至少可检测到36 pg/μL的总RNA;对马铃薯V病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯A病毒、李痘病毒及马铃薯X病毒具有良好的特异性。该方法快速、灵敏、无需任何PCR后处理且交叉污染风险小,可用于马铃薯V病毒的快速检测。     

贵州马铃薯主要病毒及防治技术探讨

为摸清贵州省马铃薯病毒的种类和分布情况,2006～2009年对贵州马铃薯主要病毒类型进行了调查。结果表明:贵州省马铃薯受危害较重的病毒依次为马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯卷叶病毒(PLRV),总带毒率为46.95%;根据病毒的基本特性及主要传播途径,采取针对性的技术措施,能有效地减轻病毒病的发生。     

马铃薯嘀毒快速检测技木引进应用

本项目填补了西藏马铃薯病毒检测的空白,应用DAS-ELISA方法对西藏种植的7个马铃薯品种的块茎和28个马铃薯品种叶片进行了针对PVX、PVS病毒检测。结果表明,2个老龄薯块携带以上2种病毒,幼龄薯叶片13个品种带病毒,其中4个品种携带以上2种病毒。西藏马铃薯品种病毒侵染越来越严重,将会导致急剧减产、品种退化,丧失了继续使用和种植的价值。因此需要进一步加强马铃薯病毒监测工作,为我区马铃薯质量安全生产和农牧民增收提供科学依据。     

贵州不同海拔地区马铃薯病毒病初步调查及检测鉴定

[目的]调查贵州省不同海拔地区马铃薯病害发生情况,鉴定出贵州省马铃薯易感病毒种类。[方法]采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)对在黔南州、黔东南州及毕节地区采集的805份马铃薯样品进行病毒检测。[结果]805份马铃薯样品中检出有29份马铃薯X病毒(PVX)为阳性;41份马铃薯Y病毒(PVY)为阳性;285份马铃薯S病毒(PVS)为阳性;23份马铃薯卷叶病毒(PL-RV)为阳性,带病毒率46.95%。[结论]对贵州马铃薯危害较重的病毒种类依次为:马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)。     

双重RT-PCR法快速检测多种马铃薯病毒的研究

为建立快速、简便、灵敏度高、特异性强的RT-PCR检测马铃薯病毒技术,依据马铃薯X病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,从反转录和PCR等方面优化双重RT-PCR反应条件,同步扩增出上述四4种病毒,分别得到620(PVX)、435(PVS)、300(PVA)、222 bp(PLRV)大小的扩增片段。结果表明,反转录反应中引物浓度比例、dNTPs浓度和PCR反应中Mg2+浓度对双重RT-PCR检测多种马铃薯病毒的影响较大。优化的双重RT-PCR反应体系可以同步快速检测田间自然感染的马铃薯病毒,此方法还适合检测马铃薯脱毒种薯及试管苗,对马铃薯病毒病早期监测有一定的作用。     

马铃薯病毒病的防治

目前,在我国普遍发生和危害较重的马铃薯病毒病主要有马铃薯X病毒病、马铃薯Y病毒病和马铃薯卷叶病,针对其发生危害特点和发生规律,提出防治方法。     

马铃薯主要病毒病的症状及防治措施

病毒病是危害马铃薯的主要病害之一,在全球广为传播。马铃薯主要病毒病有马铃薯普通花叶病毒、马铃薯重花叶病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒、马铃薯M病毒、马铃薯卷叶病毒,该文综述了上述马铃薯常见病毒病的表现症状及传播途径,并提出了相应的防治措施。     

黑龙江省马铃薯新病毒株系调查研究

2009年通过对黑龙江省20余个县市马铃薯主产区的马铃薯病叶采集,经鉴别寄主反应、血清学测试、电镜观察、新病毒检测技术等,较全面地了解了黑龙江省马铃薯病毒（包括病毒株系）存在和分布情况。系统鉴定出马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）、马铃薯Y病毒（Ptato virus Y,PVY）、马铃薯S病毒（Potato virus S,PVS）、马铃薯M病毒（Potato virus M,PVM）、马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）、马铃薯卷叶病毒（Potato leafroll virus,PLRV）、黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaic virus,CMV）、烟草花叶病毒（Tobacoo mosaic virus,TMV）、烟草脆裂病毒（Tobacoo rattlevirus,TRV）和马铃薯Y病毒坏死株系（PVYn）。TRV,PVYn为局部分布。研究证实至2009年黑龙江省无马铃薯黄矮病毒（Potato yellow dwarf virus,PYOD）、马铃薯V病毒（Potato virus V,PVV）、马铃薯帚顶病毒（Potato mop top virus,PMTV）和安第斯马铃薯潜隐病毒（Andean potato latentvirus,APLV）、安第斯马铃薯斑驳病毒（Andean potato mottlevirus,APMV）的分布,没有发现侵染马铃薯的番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）和苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaic virus,AMV）。检测到马铃薯番茄黑环斑病毒（Potato black ringspot virus,PBRSV）、马铃薯烟草花叶病毒黄斑株系和马铃薯PVYNTN病毒皆呈零星分布。     

甘薯病毒病脱毒及检测

甘薯茎尖分生组织脱毒培养技术是目前防治病毒病最有效的方法。阐述了我国甘薯病的田间症状及病原种类,并综述了茎尖分生组织脱毒及检测甘薯病毒常用的生物学、血清学、分子生物学等几种主要检测技术的特点。     

马铃薯3种病毒的多重PCR检测方法构建

[目的]构建马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）3种马铃薯主要易受感染的病毒多重PRC（multiplex PCR）检测方法。[方法]根据GenBank公布的PVA、TMV、PVY基因序列分别设计引物,建立3种马铃薯病毒的多重PCR方法;通过构建3种病毒PCR扩增目的基因的质粒用于制备标准品进行敏感性验证,利用PVX（Potato virus X）、PVM（Potato virus M）、PVS（Potato virus S）、PVV（Potato virus V）,CMV（Cucumber mosaic virus）等其他马铃薯病毒进行特异性试验;并对11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎采集样品进行了检测。[结果]研究中构建的马铃薯3种病毒多重PCR检测方法,最低检测下限：PVA为100 copies/2μl,PVY为100 copies/2μl,TMV为1 000 copies/2μl,与PVX、PVM、PVV、PVS、CMV等其他马铃薯病毒无交叉反应,具有良好的特异性;11份疑似发生病毒病的马铃薯块茎中7份样品检出3种病毒感染阳性。[结论]该研究成功构建了马铃薯PVA、TMV、PVY病毒的多重PCR方法,为马铃薯病毒检测技术应用奠定一定基础。     

甘肃马铃薯脱毒种薯质量现状及发展建议

阐述了甘肃马铃薯脱毒种薯质量现状,分析了存在的问题,提出了加强种薯生产经营许可管理,规范脱毒种薯生产经营行为;建立和完善种薯3代（G3）繁育推广体系及质量保证管理体系;加强种薯检测体系建设,改善检测手段,保证种薯质量等发展建议。     

甘薯病毒病研究进展

综述了国内外近年来侵染甘薯的主要病毒种类、症状、传播方式以及甘薯病毒病的诊断和检测方法;甘薯羽状斑驳病毒（ＳＰＥＭＶ）的血清学和分子生物学等方面的研究进展,简要介绍了我国甘薯脱毒研究的一些概况。     

李属坏死环斑病毒（PNRSV）RT-LAMP检测方法的建立

针对李属坏死环斑病毒（PNRSV）外壳蛋白（CP）基因保守序列,设计了1套特异性识别CP基因中6个不同区段的环介导等温扩增（LAMP）引物。通过对反应条件的优化,建立了适用于PNRSV的RT-LAMP检测技术,对优化后的方法进行特异性、灵敏度评价。结果显示,此方法能够特异性的检测出PNRSV,对马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、黄瓜花叶病毒（CMV）、蚕豆萎蔫病毒（BBWV）的检测均为阴性,灵敏度高于RT-PCR 10倍。     

马铃薯Y病毒衣壳蛋白抗原表位分析及其快速ELISA检测方法的建立

【目的】马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）是影响马铃薯产量和品质的主要病毒之一,目前尚未发现有效的防治药剂,脱毒种薯的应用是预防PVY危害的主要防治措施。建立灵敏度高、特异性强的PVY快速检测方法,为脱毒种薯质量控制提供技术支撑。【方法】将PVY衣壳蛋白（coat protein,CP）分段表达为有重叠部分的小段多肽,以其为抗原通过Western blot分析PVY-CP的抗原表位。以P/N值最大为标准,通过常规双抗夹心ELISA（DAS-ELISA）对识别不同抗原表位的单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）进行配对试验,筛选一组检测效果最优的配对单克隆抗体,并确认捕获抗体和检测抗体。通过方阵滴定法确定捕获抗体及检测抗体的最佳工作浓度,通过控制变量法确定检测抗体与抗原的最佳共同孵育时间。以不同浓度的PVY-CP蛋白为抗原,检验快速DAS-ELISA的灵敏度。以感染不同病毒的马铃薯样品为抗原,检测快速DAS-ELISA的特异性。同时通过快速DAS-ELISA与RT-PCR检测50份田间采集的疑似感染PVY的马铃薯样品,将二者结果相比较检验检测方法的符合率。运用建立的快速DAS-ELISA对不同株系PVY感染的马铃薯样品进行检测。【结果】利用PVY-CP的6条分段表达多肽筛选到一组能进行DAS-ELISA的配对单克隆抗体（9G6和3D3）,并以这对单抗为基础建立了PVY快速DAS-ELISA检测方法。以9G6为捕获抗体包被酶标板,检测抗体3D3经辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记后以2 μg·mL^-1的工作浓度与抗原在37℃共同孵育5 min。该检测方法检测限为0.5 ng·mL^-1,特异性分析结果显示该法仅在检测感染PVY的马铃薯样品时呈阳性反应,检测马铃薯S病毒（potato virus S,PVS）、马铃薯M病毒（potato virus M,PVM）、马铃薯卷叶病毒（potato leaf-roll virus,PLRV）等其他常见马铃薯病毒样品均呈阴性反应。通过快速DAS-ELISA与RT-PCR同时对50份田间采集的马铃薯样品进行检测,有48份样品检测结果一致,符合率达96%,且对PVY^N及PVY^O样品检测结果均呈阳性。【结论】建立的PVY检测方法灵敏度高、特异性强,30 min即可完成检测,方便快捷,为PVY的高通量检测、脱毒种薯的生产提供了关键技术支持。     

马铃薯病毒疫情调查及马铃薯S病毒的检测鉴定

[目的]了解河北省张家口市马铃薯病毒病害发生情况并对马铃薯S病毒（PVS）进行鉴定。[方法]对采自河北省张家口市的46份马铃薯样品进行生物学测定和血清学及分子生物学检测。[结果]46份样品中有35份为马铃薯Y病毒（PVY）侵染,其中有6份是PVY与PVS混合侵染,其余29份为PVY单独侵染。用特异性引物扩增PVS外壳蛋白基因的部分序列,获得685bp的目的产物,该序列与已报道的PVS核苷酸序列同源性在80％以上,编码227个氨基酸,与已报道的PVS外壳蛋白的氨基酸同源性均在90％以上。证明该样品中确实携带PVS。[结论]该研究为今后该地区马铃薯病毒病害的控制及防治提供了依据。     

应用RT-PCR技术检测宁夏地区马铃薯脱毒试管苗病毒报告

为进一步推动宁夏马铃薯种薯产业健康、稳定和可持续发展,了解宁夏地区马铃薯脱毒试管苗带有病毒残留的基本情况,本研究对宁夏银北和银南地区11个主要的马铃薯脱毒试管苗品种利用RT-PCR技术分别了检测PVX、PVY、PVS和PLRV4种常见病毒。检测结果显示:宁夏银北和银南地区马铃薯脱毒试管苗主要品种均不带有PVX、PVY、PLRV病毒,但是银北和银南地区的庄薯3号均带有带有PVS病毒。     

马铃薯茎尖脱毒技术体系的研究进展

马铃薯茎尖脱毒技术的应用是克服马铃薯病毒病和类病毒病害的主要措施之一。系统总结了茎尖脱毒技术体系中的脱毒、快繁、种薯诱导和检测技术的影响因素和研究进展,主要包括茎尖大小、外源激素、温度、光照、环境、培养基等因素以及RT-PCR检测技术等,还分析了脱毒马铃薯增产的机理,并展望了该技术今后研究方向。     

甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】甘薯病毒病（sweet potato virus disease, SPVD）是甘薯上的毁灭性病害之一,严重时可造成90%以上的产量损失。论文旨在对甘薯SPVD染病植株中甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV）2种病毒的复合侵染情况进行研究,建立SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD的早期预警和流行学研究提供技术手段。【方法】选取重庆地区具有不同SPVD典型症状的甘薯品种（系）叶片作为试验材料,对其进行症状和SPFMV、SPCSV的硝酸纤维素膜酶联免疫吸附（NCM-ELISA）检测;对供试材料叶片中的SPFMV外壳蛋白CP和SPCSV热激蛋白HSP70核苷酸序列进行克隆和序列分析,根据保守核苷酸序列设计荧光定量RT-PCR检测引物。以甘薯泛素（ubiquitin,UBI）和组蛋白（histone,H2B）编码基因为内参对供试样品进行荧光定量RT-PCR检测,与感染SPVD典型症状和NCM-ELISA检测结果进行比较,并对取自不同甘薯品种(系)、相同品种(系)不同单株以及相同植株不同部位叶片检测结果进行比较,筛选可快速、精确、定量检测SPVD的荧光定量RT-PCR检测方法。【结果】症状学诊断表明不同甘薯品种（系）的感病叶片可能表现出不同的典型症状特点,同一品种（系）的不同感病植株感病症状相似但也存在差异。序列分析结果表明供试材料中SPFMV至少存在2个株系类型(RC和EA),SPCSV至少存在1个株系类型（WA）。在15份供试材料中,10份材料由NCM-ELISA和荧光定量RT-PCR均检测到SPFMV和SPCSV的共同感染,且荧光定量RT-PCR检测结果与发病症状和NCM-ELISA检测结果相吻合,其检测结果可准确反映甘薯SPVD染病植株中2种病毒复合侵染情况。荧光定量RT-PCR检测结果还表明,不同品种(系)或相同品种(系)不同单株病叶中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平存在差异;相同植株顶端幼嫩叶片和中部成熟叶片中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平也存在差异。染病材料中SPFMV中CP转录水平均相对较高,是SPCSV的HSP70转录水平的3-556倍。4份材料经NCM-ELISA检测只有SPFMV而没有SPCSV感染,而荧光定量RT-PCR还可检测到其中2份材料中SPCSV HSP70转录水平,说明这2份材料中也存在SPFMV和SPCSV的共同感染,表明荧光定量RT-PCR比NCM-ELISA检测结果更灵敏、准确。【结论】 筛选出可利用SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平进行检测的荧光定量RT-PCR检测引物,建立了SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD针对性地监测预警提供了极为有效的方法。在建立甘薯SPVD防御体系时,需综合考虑2种甘薯病毒的共侵染特性和甘薯品种差异,采取针对性的监测和预警机制。