牦牛线粒体基因组研究进展

系统了解牦牛线粒体基因组(mtDNA)的研究现状,探究其存在的缺陷与不足,为今后更好地开展牦牛基因组学研究提供依据和基础材料。笔者通过查阅近20年有关牦牛mtDNA研究的文献资料,对牦牛mtDNA全序列和部分序列的研究进展进行综述。自20世纪80年代末以来,mtDNA作为一种很好的分子标记已被研究者用于探究牦牛的起源驯化、遗传多样性、迁徙模式、历史发展动态、分类学地位、适应性机理及系统发育关系等问题,并取得了具有结论性的诸多成果。然而,有关牦牛mtDNA全序列基础上的群体基因组学研究、线粒体转录组和蛋白质组学研究、核基因组与线粒体基因组间的互作和调控研究、线粒体基因组与部分性状间的关联分析等内容,还有待继续深入研究。     

高通量测序技术在植物转录组研究中的应用

新一代高通量测序技术相比于传统测序技术具有周期短、准确性高及成本低等优点,目前已广泛应用到植物转录组的研究中。对已完成全基因组测序的物种进行转录组测序,可得到基因表达差异、基因结构优化、可变剪接、单核苷酸多态性等分析结果并发现新基因。对无参考基因组的物种进行转录组测序,通过de nove从头组装,最终拼装出该物种的单一基因序列转录组数据集,为植物分子生物学的研究提供更多数据依据。     

第二代测序技术在植物遗传研究中的应用

第二代测序技术,又称"新一代测序技术",其较Sanger测序具有通量高、测序成本低和测序时间短等特点。介绍了以454、Illumina/Solexa和SOLi D为代表的第二代高通量测序技术的基本特性及其在植物全基因组、转录组和miRNA测序等领域的研究进展,并对新一代高通量测序技术的发展趋势进行了展望。     

利用高通量测序技术快速解析草莓病毒基因组序列

高通量测序技术是近年来发展起来的一种重要的分子生物学技术,能一次对几十万至几百万条DNA分子进行序列测定,在基因组解析、转录组分析、基因变异位点筛查等方面广泛应用。探讨通过对感染病毒的草莓材料进行转录组测序来解析病毒基因组的可行性。以怀疑感染病毒的草莓叶片为试材,利用Illumina测序技术进行转录组测序分析。通过对组装得到的单基因序列进行注释分析,筛选出12个注释为草莓病毒的单基因序列,它们源自4种草莓病毒,分别是草莓轻型黄边病毒、草莓坏死休克病毒、草莓镶脉病毒及草莓皱缩病毒。利用RT-PCR技术对转录组测序结果进行了验证,表明利用高通量测序技术解析草莓病毒基因组序列的可靠性。本研究探索出解析草莓病毒基因组序列信息的新方法,为研究草莓病毒的进化和病毒分子检测奠定基础。     

高通量测序技术在农业研究中的应用

随着高通量测序技术的不断发展和测序成本不断降低,高通量测序近几年在现代农业研究领域中得到了充分应用,为新品种选育和品质改良带来了新的科研方法和解决方案,加快了新品种的育种进程。高通量测序技术的主要应用方向包括对农作物和栽培品种进行全基因组从头测序和深度重测序、遗传差异分析、分子标记开发、遗传连锁分析、表观遗传分析和转录组分析等。本文系统阐述了近几年高通量测序技术在农业研究中的应用进展,展示高通量测序在现代农业研究领域的广泛应用前景。     

基因组测序技术及其应用研究进展

基因组测序技术从第1代Sanger测序经第2代高通量测序已发展到第3代单分子测序,第2代高通量测序技术是当前基因组测序中最主要的分析技术。对高通量测序技术在全基因组de novo测序、全基因组重测序、简化基因组测序、宏基因组测序分析和表观基因组学研究等领域的应用原理、步骤及现状进行综述,以为基因组测序技术的应用提参考。     

大豆转录组测序研究进展综述

大豆是世界上最重要的油料作物之一,同时也是人类食物和动物饲料的主要来源。随着第二代基因组高通量测序技术的广泛应用,录组组测序技术的迅猛发展给生物基因组学的研究带来了深刻的影响。转录组研究能够从整体水平研究基因功能和基因结构揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。该文主要简述了转录组测序主要方法及其在大豆研究中的应用,为今后该技术的研究与应用提供参考。     

分子生物学在蝗虫研究中的应用

本文综述了分子生物学方法对蝗虫的系统分类、进化关系、全基因组测序、转录组测序以及功能基因等方面的研究现状,为蝗虫研究与防治提供一定的参考。     

高通量测序技术在园艺植物遗传育种中的应用

高通量测序技术以其高输出量和高分辨率的特征,可一次对几十万条到几百万条DNA分子进行测序,并对一个物种的转录组和基因组进行细致全面的分析.此外,高通量测序产生的海量数据促进了相应的算法和软件的不断更新.文章对第二代、第三代主流高通量测序平台的种类、技术原理及其在园艺植物遗传育种中的应用现况进行了综述,并对高通量测序技术应用需注意的问题及其未来的研究动向进行了简要讨论.     

高邮鸭卵巢中双黄蛋性状相关lncRNA表达差异分析

【目的】为探究lncRNA对高邮鸭双黄蛋性状调控机制,采用全转录组测序方法对高邮鸭双黄蛋高、低产组的卵巢组织转录组进行分析,筛选影响高邮鸭双黄蛋性状的候选关键长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA).【方法】通过个体笼养筛选高邮鸭双黄蛋高、低产组个体各3只,采取卵巢组织并通过Illumina HiSeq2500高通量测序进行转录组测序,结合参考基因组对所获得的序列进行序列比对、基因注释和差异表达等分析,筛选出差异表达lncRNA并进行GO富集分析.通过荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)方法检测部分lncRNA表达水平,验证测序结果的可靠性.【结果】通过参考基因组比对和差异表达分析,初步获得279条差异表达lncRNA,其中显著性上调差异表达lncRNA 109个,显著性下调差异表达lncRNA 170个.结合GO分析和向无环图分析,最终获得了18条候选lncRNA,它们参与细胞质翻译、内皮细胞分化正向调控和磷脂酰肌醇-3-磷酸结合等多个生物过程.在此基础上,对上述18条候选lncRNA进行靶基因分析,显示有2对差异表达lncRNA和靶基因之间存在着潜在调控关系:XLOC_000924和LOC106018336以及LOC106018964和LOC113843289.另外,TCONS_00001086的靶基因ADAMTS1与卵巢排卵功能关系密切.qRT-PCR验证结果表明,筛选出的lncRNA表达趋势与转录组测序中表达的趋势相似,说明测序结果可靠.【结论】对高邮鸭双黄蛋高、低产组卵巢组织进行了转录组测序分析,初步筛选出了18个差异表达lncRNA和对应的靶基因可能参与高邮鸭双黄蛋性状的调控,为进一步了解高邮鸭双黄蛋性能的综合调控机制提供了新的参考依据.     

16S rRNA高通量测序技术筛选牦牛瘤胃细菌基因组DNA提取方法及菌群结构

【目的】确定理想的牦牛瘤胃细菌基因组DNA提取方法及初步分析牦牛瘤胃细菌的群体结构。【方法】采用物理法(珠磨法、反复冻融法)、化学法(CTAB、SDS)及酶解法(溶菌酶、蛋白酶K)三者与瘤胃细菌特点相结合的方法,组合生成9种不同方法,即方法 1(CTAB+SDS+Lysozyme+无特殊物理处理法)、方法 2(CTAB+SDS+Lysozyme+反复冻融法)、方法 3(CTAB+SDS+Lysozyme+珠磨法)、方法 4(CTAB+Lysozyme+无特殊物理处理法)、方法 5(CTAB+Lysozyme+反复冻融法)、方法 6(CTAB+Lysozyme+珠磨法)、方法 7(SDS+Lysozyme+无特殊物理处理法)、方法 8(SDS+Lysozyme+反复冻融法)、方法 9(SDS+Lysozyme+珠磨法),同时以QIA amp DNA Stool Mini Kit(方法 10)为对照,以这10种方法来提取瘤胃微生物基因组DNA,并通过DNA浓度、纯度、DNA电泳图等基本性质及16S r RNA高通量测序结果对其进行分析比较,同时通过测序结果初步分析牦牛瘤胃细菌群体结构。【结果】不同DNA提取方法效率比对结果显示,同样的化学及生物酶裂解条件下,结合珠磨法及反复冻融法能够显著地增强细胞裂解效率,提高DNA产量。其中方法 3及方法 6提取的DNA具有较高的浓度及纯度,方法 7—10缺乏CTAB阳离子去污剂,提取的DNA量显著低于其他方法(P0.05),除方法 2和8所提取的样品经多次试验,PCR产物目的条带太弱或未检测到外,其余8种方法提取的样品PCR产物目的条带大小正确,浓度合适,符合高通量测序的要求。16S r RNA高通量测序共生成了191 349条原始数据,质控后得到有效序列171 231条。稀释性曲线分析表明,数据量合理并达到饱和,能够完整反映样品的菌群种类。OTU聚类数据统计、分类学和多样性指数分析显示方法 6和10包含的细菌较丰富。不同提取方法对革兰氏阳性菌提取效果比对结果表明方法 6裂解革兰氏阳性菌细胞壁的能力比其他方法相对较高。综上,方法 6(CTAB-Lysozyme-珠磨)提取的DNA产量、样品多样性指数及革兰氏阳性菌破壁能力均优于其他方法。菌群结构分析表明牦牛瘤胃细菌菌群结构包括21门、35纲、75科、112属,丰度较高的菌群依次是拟杆菌Bacteroidtes(64%)、厚壁菌Firmicutes(20%)、螺旋体Spirochaetae(2.3%)和变形菌Proteobacteri(1.8%),纤维杆菌Fibrobacter(1.7%)。牦牛瘤胃细菌群体结构与黄牛相比存在着一定的差异,这可能归因于饮食及环境的不同。【结论】利用16S r RNA高通量测序筛选出了牦牛瘤胃细菌基因组DNA理想提取方法,即方法 6(CTAB-Lysozyme-珠磨),并初步分析了牦牛瘤胃细菌群体结构,为研究牦牛瘤胃微生物群体特殊性及挖掘牦牛体内的基因资源奠定了基础。     

葡萄牙牡蛎外套膜转录组测序及壳色基因挖掘

采用Illumina高通量测序平台对黑壳与金壳葡萄牙牡蛎(Crassostrea angulata)外套膜组织开展转录组测序研究,其中黑壳组总计产出5 857 718 092 nt数据,筛选后的干净阅读子58 004 560个;金壳组产出6 727 447 326 nt数据,干净阅读子66 614 854个。将发掘的新基因与COG、GO、KEGG、Swiss-Prot、NR数据库进行序列比对,最终得到各数据库注释的新基因数量分别为147、397、203、567、1 347个。通过对差异表达基因的序列进行生物学功能注释和聚类分析以及利用已知贝壳基质蛋白序列进行搜索,鉴定出14条可能与壳色表达有关的贝壳基质蛋白基因,其中5条下调基因可能与金壳基因表达相关。     

转录组测序技术在家畜遗传育种中的应用研究进展

转录组测序技术能够全面分析某一组织或细胞在不同物种、品种、发育阶段以及不同处理条件下,全部转录产物的类别、结构以及表达水平的变化,揭示特定生物学过程的分子调控机制。近年来,研究人员广泛利用该技术筛选家畜优良经济性状的靶基因,为家畜的分子育种工作奠定了基础。结合转录组测序技术的技术特点,综述了其在家畜生长发育、肉质、泌乳、被毛等方面的研究进展,旨在为今后该技术的应用提供参考。     

基于全基因组重测序筛选南阳黑猪脂肪沉积相关候选基因

为解析南阳黑猪种群中脂肪表型极端差异个体之间的遗传变异基础,本研究以南阳黑猪种群中体重相近但脂肪表型差异明显的6月龄全同胞或半同胞个体为研究对象,分别对其进行胴体性状和肉质性状统计分析,采用高通量测序技术对高脂肪组和低脂肪组的样品进行全基因组重测序,整合课题组前期转录组数据分析南阳黑猪脂肪沉积相关的遗传位点和功能基因。结果表明:1)高脂肪组肌内脂肪含量((4.96±0.62)%)显著高于低脂肪组((3.61±0.11)%)(P<0.05),高脂肪组平均背膘厚((43.74±2.33)mm)极显著高于低脂肪组((28.36±4.17)mm)(P<0.01),与肌内脂肪含量相关的性状(剪切力、pH_{45 min}、蒸煮损失和48 h滴水损失)在两组之间均存在显著差异,其余各项性状指标在两组之间无显著差异;2)本次测序共得到208.00 Gb有效序列数据,测序覆盖度达98.68%以上。在高-低脂肪组共检测到25 827 091个单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)、5 802 822个小片段插入和缺失(Insertion-deletion,InDel)、56 358个染色体结构变异(Structural variation,SV)及1 898个拷贝数变异(Copy number variation,CNV)。通过对SNP非同义突变和InDel移码突变进行功能注释,发现所鉴定到的209个组间差异基因主要参与到mTOR信号通路、甲状腺信号通路以及ABC 转运蛋白信号通路等与脂肪沉积相关的通路中;3)与课题组前期转录组数据联合分析后筛选到2个与脂肪分化相关的关键基因(PLP1和ITGA6),这些基因的多态性变化可能是影响南阳黑猪肌内脂肪沉积出现差异的关键。综上,本研究从全基因组水平上筛选到了南阳黑猪群体内影响脂肪沉积相关的基因和位点,为进一步研究猪脂肪沉积调控机制及品种选育奠定基础。     

基于RNA-Seq技术的牦牛体外受精胚胎发育转录组分析

【目的】探明不同发育阶段牦牛体外受精（IVF）胚胎的转录组差异,了解差异表达基因（DEG）在功能、分类和代谢通路的差异,为揭示牦牛早期胚胎发育调控机制,促进牦牛胚胎体外生产技术的发展提供理论基础。【方法】以IVF技术生产的牦牛2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚5个发育阶段的胚胎为样本分别提取总RNA,采用Smart-Seq2扩增技术构建5个测序文库,应用HiSeq^TM 2500高通量测序技术进行转录组测序,对获得的有效序列进行功能注释及相关生物信息学分析。【结果】牦牛IVF后的卵裂率和囊胚率分别为69.3%和26.2%。2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚5个发育阶段的牦牛胚胎Clean reads为47 355 570-50 855 888条,其中有85.65%-90.02%的reads能比对到牦牛参考基因组序列上;8-细胞的胚胎比对上的转录本最多（14 893）,而囊胚比对上的转录本最少（9 827）。牦牛胚胎转录本主要有5种可变剪接类型,转录起始区域可变剪接（TSS）和转录结束区域可变剪接（TTS）所占比例最大;牦牛2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚基因组分别有116 601、234 131、196 420、70 841和94 840个位点存在单核苷酸多态性（SNP）。在4-细胞、8-细胞、桑椹胚、囊胚期开始表达的基因分别有1 221、1 116、142和564个;随着胚胎发育的进行,BMP15、KIT、GDF9、STAT3、ZP3和ZP4等母源基因的表达量逐渐减少,而SARS、IL18、ACO2、TXN2、ATP5B、PCGF4、UBE3A、MAPK13、SNURF和JUP等胚胎基因的表达量则逐渐增加。以|log₂ratio| ≥1且Q-value ＜ 0.05为筛选标准,在2-细胞和4-细胞胚胎、4-细胞和8-细胞胚胎、8-细胞胚胎和桑椹胚以及桑椹胚和囊胚比对中分别筛选到6 922、7 601、8 071和10 555个DEGs。GO分析表明,4个发育阶段的DEGs归类注释都涉及生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）3大类62个二级条目。通过KEGG pathway数据库分析,2-细胞和4-细胞期胚胎的DEGs参与到308条通路中,显著富集剪接体、RNA转运和泛素介导的蛋白水解等11条通路;4-细胞和8-细胞胚胎的DEGs参与到310条通路,显著富集嗅觉转导、神经活性配体-受体互作和核苷酸切除修复等9条通路;8-细胞期胚胎和桑椹胚的DEGs参与到316条通路,显著富集嗅觉转导、泛素介导的蛋白水解和神经活性配体-受体互作等10条通路;桑椹胚和囊胚的DEGs参与到315条通路,显著富集剪接体和RNA转运2条通路。【结论】利用高通量测序技术对牦牛IVF胚胎不同发育阶段的转录组进行测序和分析,揭示了牦牛胚胎发育不同阶段差异表达基因的数量,获得了差异表达基因的功能、分类和代谢通路。为丰富牦牛胚胎转录组信息,揭示牦牛胚胎发育分子调控机制及完善其胚胎体外培养技术研究奠定基础。     

加权基因共表达网络分析在畜禽研究中的应用

为了解加权基因共表达网络分析(Weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)方法在畜禽中的应用研究，本文对近年来国内外通过WGCNA方法对牛、羊、猪、禽等畜禽进行研究的相关文献进行了整理与分析，总结了WGCNA方法应用的一般分析流程、策略及畜禽WGCNA的研究现状。结果表明:WGCNA是一种系统生物学的方法，可分析转录组、蛋白组、代谢组、DNA甲基化和单细胞转录组等高通量数据，解析分子间调控的表达模式，确定关键调控因子；在畜禽的研究中，WGCNA方法已经广泛应用在生长性状、繁殖性状、抗病性状和品质性状等复杂性状的优势功能因子的挖掘。综上，WGCNA方法对分析组学数据具有较强的优势，可为畜禽重要经济性状的挖掘，阐明性状生物学机制提供助力。     

麦洼牦牛H-FABP、HSL基因多态性及与生长性状的相关分析

【目的】探讨心脏脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid-binding protein,H-FABP）、激素敏感脂肪酶（hormone-sensitive lipase,HSL）基因在牦牛中的遗传多态性,进一步揭示牦牛各品系间的遗传分化以及候选基因与牦牛生长性状间的关联性,同时为2个候选基因在牦牛中的表达调控等研究提供理论依据,寻找可用于辅助选择的分子标记。【方法】采用PCR-SSCP技术和DNA测序技术对共100头麦洼牦牛个体的H-FABP、HSL基因的外显子部分进行遗传多态性分析,统计基因和基因型频率,进行Hardy-Weinberg平衡性检测,计算纯合度、杂合度、多态信息含量和有效等位基因数等遗传多态指标,分析候选基因不同基因型与体高、体重、体斜长、胸围、管围等生长性状的关联性。【结果】①麦洼牦牛H-FABP、HSL基因外显子部分均存在多态性,多态性检验均存在3种基因型;②适合性检验表明仅HSL基因外显子8上多态位点处于Hardy-Weinberg平衡状态,其余多态位点均偏离;③测序分析表明,H-FABP基因外显子4第7 339位（与原序列相比）发生单碱基突变（T→C）,该突变属同义突变;HSL基因外显子7第6 883位发生G→C转换,以及第6816处发生碱基A→G突变,并导致编码氨基酸由天冬氨酸（D）转变为甘氨酸（G）;外显子8第10 183 bp处发生A→G碱基突变,编码氨基酸由半胱氨酸（C）变为甘氨酸（G）;④对各标记基因型生长发育指标（体高、体斜长、胸围、管围、体重）进行差异显著性检验,仅HSL基因外显子7上A6816G基因座差异极显著（P﹤0.01）。【结论】麦洼牦牛H-FABP、HSL基因存在遗传多态性,且HSL基因外显子7上A6816G基因座表现的多态有可能作为一种遗传标记。     

牦牛DGAT1基因多态性及其与乳质性状关联分析

【目的】检测牦牛DGAT1基因多态性,评估基因突变对牦牛乳品质性状的影响,以期丰富牦牛重要经济性状的分子遗传研究基础。【方法】采用PCR-SSCP方法,检测甘南牦牛、天祝白牦牛、青海牦牛及野血牦牛DGAT1基因intron5-exon7和intron15-exon17区突变,分析基因突变对乳品质性状的影响。【结果】牦牛DGAT1基因intron5-exon7区发现c.562+32_c.562+33ins CCGCCC的插入/缺失,等位基因M、基因型MM频率最高为优势等位基因和基因型,各类群牦牛PIC0.5属中度或低度多态;intron15-exon17区检测到c.1249-23CT和c.1336CT的突变,其中exon17发现的c.1336CT突变导致编码氨基酸p.Arg447Cys转变,等位基因A频率最高为优势等位基因,甘南牦牛、天祝白牦牛和青海牦牛中基因型AA为优势基因型,野血牦牛基因型AB为优势基因型,各类群牦牛0.25PIC0.5属中度多态;两区域3处突变位点构建出6种单倍型和11种单倍型组合,突变位点间存在连锁关系且接近于连锁平衡。关联分析表明,甘南牦牛intron5-exon7区基因型与乳质性状无显著相关;intron15-exon17区基因型BB个体乳品质性状最低,且乳蛋白率、乳脂率、总固体物质含量中显著低于其他基因型个体(P0.05);携带等位基因A的个体乳蛋白率、乳脂率、总固体物质含量及无脂固体含量显著高于未携带者(P0.05),携带等位基因C的个体乳脂率也显著高于未携带者(P0.05),而携带等位基因B的个体乳脂率、总固体物质含量显著低于未携带者(P0.05);单倍型组合H1H3个体的乳蛋白率、乳脂率、总固体物质含量和无脂固体物质含量均较高,且乳脂率及总固体物质含量显著高于其他单倍型组合(P0.05),而H2H2单倍型组合个体则较低,除乳糖率以外的其他乳品质性状均显著低于其他7种单倍型组合(P0.05)。【结论】牦牛DGAT1基因intron5-exon7和intron15-exon17区为低度和中度多态,intron6存在c.562+32_c.562+33ins CCGCCC的插入/缺失,intron15和exon17分别检测到c.1249-23CT突变和c.1336CT的非同义突变。intron15-exon17区突变影响甘南牦牛乳品质性状,选留携带等位基因A的个体和淘汰携带等位基因B的个体、或选留H1H3单倍型组合及淘汰H2H2单倍型组合个体,均可显著改善后代群体的乳品质。     

植物功能基因选择性剪接研究进展

选择性剪接是基因表达调控的重要机制,在植物发育、抗病和应对环境胁迫等方面起着重要的作用。近年来,新一代测序技术在植物基因组和转录组测序领域得到广泛应用,植物选择性剪接研究取得了一些新进展。本文就此进行了综述,包括选择性剪接占植物功能基因的比例、选择性剪接的类型及其调控机制等内容,并提出了今后植物上的研究重点应放在选择性剪接的功能方面。