东北三省致病性嗜水气单胞菌快速检测

从东北三省养殖鱼类体内分离到21株嗜水气单胞菌,通过生理生化方法对该菌进行初步鉴定,然后根据已发表的嗜水气单胞菌16S rDNA基因和气溶素基因(Aer)的保守序列,设计2对引物,利用PCR方法对所分离到的21株嗜水气单胞菌以及参考株进行PCR扩增.结果表明,相对于常规的微生物生理生化检测,PCR对嗜水气单胞菌的检出率为90.48%.本方法的建立为常规理化检测方法提供辅助手段,从而更加有效、快捷的检测致病性嗜水气单胞菌,对东北三省地区水产养殖动物的疾病防治、流行病学调查等具有重要意义.     

采用16S rDNA片段鉴定鳗鲡病原菌的初步研究

初步探讨了采用16S rDNA片段鉴定鳗鲡病原菌的方法.根据已知细菌16S rDNA序列的高度保守区设计引物,利用PCR法扩增16株已鉴定的鳗鲡病原菌的16S rDNA片段,测序分析后,通过Gen-Bank数据库进行同源性检索,并构建相应的系统发育树.结果表明：16株鳗鲡病原菌均扩增到了400bp左右的基因片段,其中14株菌的16S rDNA片段序列与网上已发表的同属菌株的同源性为100%,其余2株为99%;8株病原菌被鉴定到种,分别属于嗜水气单胞菌和温和气单胞菌,其余8株被鉴定到属,分别属于气单胞菌属、假单胞菌属和肠杆菌属;鉴定结果与生化鉴定结果在属的分类单元上符合程度高达82%.     

养殖黄颡鱼腹水症病原研究

对近年来黄颡鱼养殖过程中暴发的腹水症的病原进行了研究.病鱼症状主要为游动迟缓,体表、肝脏充血,积有腹水,后期伴有皮肤溃烂等,采用光镜及透射电镜超薄切片观察,生理生化指标鉴定及16S rDNA同源性分析及系统发育树构建等方法,对从多处组织中分离获得的病原菌进行了鉴定:其形态特征及生理生化指标符合迟钝爱德华氏菌特点,GenBank中同源序列检索结果显示,该菌与迟钝爱德华氏菌的16S rDNA序列同源性高达99%,系统进化树中与迟钝爱德华氏菌自然聚为一支.     

大鲵腹水病病原菌的分离与鉴定研究

【目的】确定导致大鲵(Andrias davidiamus,giant salamander)腹水病的主要病原菌类型。【方法】从患病大鲵的腹水和肠道分离细菌并进行纯培养,用细菌自动鉴定系统和分子生物学方法对培养细菌进行鉴定,再对52尾健康的1龄大鲵进行感染试验,以确定病原菌,同时对病原菌进行药物敏感试验。【结果】经过细菌自动鉴定系统确定了4株细菌,室内感染试验确定嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)为主要致病菌;细菌16S rDNA基因序列分析也再次证明该菌为嗜水气单胞菌;药物敏感试验显示,该病原菌对庆大霉素、环丙沙星、阿米卡星等药物敏感,对氨卞青霉素、舒巴坦、头孢唑啉等药物具有抗性。【结论】导致大鲵腹水病的主要病原菌为嗜水气单胞菌。     

鲤鱼嗜水气单胞菌的分离与鉴定

[目的]分离、鉴定鲤鱼嗜水气单胞菌。[方法]从具有典型细菌性败血症症状的病鱼或濒死鱼中分离到2株优势菌,经分离培养、人工感染试验、毒力因子和16S rRNA基因序列的测定,研究分离菌的形态、生理生化特征及致病性。[结果]分离到的2株优势菌的菌落形态特征基本一致,经鉴定,确认为嗜水气单胞菌。无菌滤液试验表明,鲤鱼细菌性败血症不是由病毒引起的。腹腔注射分离菌菌悬液的鱼在7 d内全部死亡,人工感染试验的症状与自然发病相似,且再次感染后又可分离到该菌株。分离提纯的致病菌株产生了β-溶血环,经蛋白酶试验为阳性。16S rRNA基因序列同源性分析发现同源性为98%。[结论]嗜水气单胞菌是鲤鱼细菌性败血症的致病菌。     

鳊鱼出血病嗜水气单胞菌的分离·鉴定与ERIC-PCR指纹图谱研究

[目的]对鳊鱼嗜水气单胞菌进行分离与鉴定。[方法]从鳊鱼中分离出嗜水气单胞菌,并进行16S rDNA特异性分子鉴定。分析嗜水气单胞菌的生化特征,并构建嗜水气单胞菌ERIC-PCR指纹图谱。[结果]分离株的测序结果与GenBank中嗜水气单胞菌的标准菌株序列相似度达98%～99%。分离菌的生化特征结果均呈阳性。同一菌株的ERIC-PCR具有较好的重复性和稳定性,可用于嗜水气单胞菌的分型溯源。[结论]该研究为预防和控制鳊鱼出血病的发生和蔓延提供了参考。     

嗜水气单胞菌的分离与16S rDNA鉴定

[目的]分离并鉴定鱼嗜水气单胞菌,并构建系统发育分析.[方法]从云南某鱼场采集发病鱼的病变组织进行细菌分离与培养,并对分离菌株进行初步鉴定、16S rDNA鉴定和系统发育分析.[结果]分离培养到1株细菌,命名为Ah1305.经表型鉴定、生化试验及16S rDNA系统发育分析,鉴定为嗜水气单胞菌.[结论]该研究可为快捷、准确检测鱼嗜水气单胞引起的疾病提供参考.     

山瑞鳖嗜水气单胞菌感染的诊断及防治

从患病山瑞鳖的肝脏、肺脏分离到1株细菌,对该菌的形态特征、生理生化进行分析,初步鉴定为嗜水气单胞菌。采用BioFosun-Ⅰ微生物鉴定系统对该菌进一步鉴定,结果显示为嗜水气单胞菌,可能性概率（PROB）为99%,相似性指数（SIM）和位距指数（DIS）分别为0.989和0.099。综合形态特征、生理生化特点及微生物鉴定系统鉴定结果,可将从发病山瑞鳖分离到的病原鉴定为嗜水气单胞菌。人工感染试验表明,该嗜水气单胞菌是引起山瑞鳖发病的病原且具有高度致死性;药敏试验结果则表明,该菌对头孢哌酮、阿米卡星、氧氟沙星、恩诺沙星4种药物敏感;选用头孢哌酮和恩诺沙星对病鳖进行治疗,可获得较好的治疗和控制效果,为今后山瑞鳖养殖生产中更有效地防制由该菌引起的疾病提供参考。     

黄姑鱼源溶藻弧菌的分离鉴定

2013年8月,罗源湾鸟屿海区网箱养殖黄姑鱼发生死亡事件。病鱼体表无明显异常,肝脏有点状出血,肾、脾略微重大,胃肿大明显,肠空。采用生理生化指标鉴定及16S rDNA系列同源性分析和系统发育树构建等方法,对从病鱼脾脏分离获得的优势菌株进行了鉴定。其生理生化指标符合溶藻弧菌特点,GenBank中同源序列比对结果显示,该菌与溶藻弧菌的16S rDNA序列同源性高达99.0%,系统进化树中与溶藻弧菌自然聚为一支。药敏实验结果表明:该菌对恩诺沙星等5种抗生素敏感。     

鲤鱼细菌性败血症病原菌的药敏试验

[目的]为研制有效防治鲤鱼细菌性败血症的疫苗提供依据。[方法]从河北省某渔场具有典型细菌性败血症症状的鲤鱼中分离出2株优势菌,对分离菌进行生化鉴定、16S rRNA基因序列测定,并研究分离菌的药物敏感性。[结果]根据2株分离菌的菌落形态、生化特性和16S rRNA基因序列的测定结果(同源性为99%),发现2株分离菌均为气单胞菌属的嗜水气单胞菌,认为嗜水气单胞菌是鲤鱼细菌性败血症的病原菌。分离到的2株嗜水气单胞菌对阿米卡星、氨曲南、头孢噻肟、头孢他啶、加替沙星等15种抗生素均敏感,对氨苄西林均耐药,对复方磺胺表现出了菌株差异。[结论]对嗜水气单胞菌敏感的15种抗生素可作为防治鲤鱼细菌性败血症的首选药物。     

大鲵腹水病病原茵的分离与鉴定研究

【目的】确定导致大鲵（Andrias davidiamus,giant salamander）腹水病的主要病原菌类型。【方法】从患病大鲵的腹水和肠道分离细菌并进行纯培养,用细菌自动鉴定系统和分子生物学方法对培养细菌进行鉴定,再对52尾健康的1龄大鲵进行感染试验,以确定病原菌,同时对病原菌进行药物敏感试验。【结果】经过细菌自动鉴定系统确定了4株细菌,室内感染试验确定嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）为主要致病菌;细菌16SrDNA基因序列分析也再次证明该菌为嗜水气单胞菌;药物敏感试验显示,该病原菌对庆大霉素、环丙沙星、阿米卡星等药物敏感,对氨卞青霉素、舒巴坦、头孢唑啉等药物具有抗性。【结论】导致大鲵腹水病的主要病原菌为嗜水气单胞菌。     

暹罗斗鱼致病性嗜水气单胞菌的分离·鉴定及药敏试验

[目的]探讨暹罗斗鱼的发病原因和病害防治方法。[方法]对暹罗斗鱼的病原菌进行分离,并通过生理生化指标测定和16S rD-NA测序对其鉴定,同时进行药敏试验。[结果]菌株DY001为暹罗斗鱼嗜水气单胞菌病的病原菌。经鉴定,确定菌株DY001为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。该病原菌对暹罗斗鱼的半致死量(LD50)为0.04×106CFU/g。药敏试验结果表明,病原菌对阿奇霉素、奥复星、氟哌酸、复方新诺明、菌必治、甲氧苄啶和氯霉素等抗生素敏感。[结论]嗜水气单胞菌是引起此次暹罗斗鱼发病的病原菌,而药敏试验结果将为其防治提供参考。     

大口黑鲈烂身病病原菌的分离、鉴定与特性分析

从患烂身病的大口黑鲈溃烂部位分离到优势菌株M-1。人工回归感染试验结果显示,分离的菌株M-1能复制出相似症状;对M-1菌株进行形态学、理化特性分析,初步判定所分离菌为嗜水气单胞菌;对M-1菌株进一步进行DNA分子鉴定,结果显示该菌的16S rRNA基因、溶血素(hemolysin,hlyA)基因,均与GenBank上已登录的嗜水气单胞菌的相应基因具有较高同源性;利用16S rRNA和hlyA构建的系统进化树也显示M-1菌株与与嗜水气单胞菌聚为一类。综合人工回归感染试验、理化特性分析与基因鉴定结果,确定患烂身病的大口黑鲈应为嗜水气单胞菌感染。     

鲢鳙鱼源致病性嗜水气单胞菌的分离、鉴定

从江西省南城县和广东省佛山市、韶关市患细菌性败血症病鲢鱼、鳙鱼体内分离到3株优势菌,人工感染鲢后证实为该病的病原菌,此3株菌对剑尾鱼的半致死量(LD50)分别为:2.64×105、9.24×104、4.45×105CFU/g。对3株病原菌进行形态特征、ATB细菌鉴定仪生理生化特性鉴定结果符合嗜水气单胞菌的特征;为进一步确定病原菌分类地位,对其16SrRNA序列扩增测序,并与相关细菌16SrRNA序列比对,构建系统发育树,在系统发育树中与嗜水气单胞菌聚类为一支。Aero气溶素基因PCR扩增出209bp条带,检测结果进一步表明此3株菌为含有毒力基因的致病性嗜水气单胞菌。     

一株新型嗜水气单胞菌拮抗菌的筛选及鉴定

从草鱼养殖池塘的水样及底泥样品中筛选对嗜水气单胞菌有拮抗作用的菌株,初步研究其抑菌效果,为水产养殖过程中嗜水气单胞菌的生物防治提供菌株资源.以嗜水气单胞菌为指示菌,采用点喷法进行拮抗性菌株初筛,采用牛津杯法进行复筛;通过细菌形态观察、生理生化特性试验、16SrDNA基因测序和系统发育分析,对筛选菌株进行分类鉴定.得到1株对嗜水气单胞菌有明显抑制作用的拮抗菌株WM-1,抑菌圈直径达21.8mm,经鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus).该菌筛选得到的拮抗菌WM-1,对嗜水气单胞菌抑制效果显著,为进一步研究其抑菌机理提供了菌种资源.     

辽宁地区养殖淡水鱼感染嗜水气单胞菌的流行病学调查

通过RS选择性培养基和针对16S rDNA与气溶素基因的双重PCR检测技术,对采集于辽宁省不同地区、不同鱼类、不同症状病鱼感染的嗜水气单胞菌进行了系统的流行病学调查,并对致病性嗜水气单胞菌进行了毒力验证试验及对抗菌药物的敏感性试验。结果发现,51株临床样本中有26株分离菌扩增得到685 bp大小的目的片段,证明为嗜水气单胞菌,占分离细菌总数的50.98%,占绝对的优势,其中以出血症状为主的病鱼分离的菌占23.99%,以肠炎为主症状的病鱼分离菌占17.99%,以烂鳃症状为主病鱼分离菌占9%。26株嗜水气单胞菌中有17株同时扩增出252 bp大小的气溶素基因(aerA),表明这17株分离菌为致病性嗜水气单胞菌。人工感染试验结果表明,致病性嗜水气单胞菌均有毒力且毒力大小差异明显。药敏实验结果显示,嗜水气单胞菌不同分离株对抗生素的敏感性差异很大,对先锋V耐药率高达90%,对新生霉素、红霉素、利福平、四环素耐药率也相对较高,分别为56.2%,42.7%,37.5%,31.1%,而对氟哌酸、链霉素、庆大霉素则较敏感。该结果对建立片区病原库,揭示辽宁地区淡水养殖鱼类感染的嗜水气单胞菌的地理分布、毒力大小、耐药性差异,进而弄清嗜水气单胞菌的表型、基因型差异具有重要理论参考意义。     

黄喉拟水龟肺气肿病病原菌的分离鉴定及其药敏特性分析

[目的]明确黄喉拟水龟肺气肿病的病原菌及其药敏特性,为该病的临床诊断与治疗提供科学依据.[方法]通过微生物常规分离、人工感染试验、生理生化鉴定及16S rDNA序列分析等方法分离鉴定黄喉拟水龟肺气肿病的病原菌,测定该病原菌对黄喉拟水龟的半致死剂量(LD50),并采用K-B药敏纸片扩散法测定其药敏特性.[结果]从患肺气肿病黄喉拟水龟的肺脏组织中分离获得一株优势菌株(命名为GXNN1),其生理生化特性与肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)完全一致;经腹腔人工注射感染,黄喉拟水龟表现出与自然发病相同的症状,腹腔内有少量血水,肠壁充血,肺脏充血膨胀;菌株GXNN1对黄喉拟水龟的LD50为0.63×103 CFU/g.菌株GXNN1与肺炎克雷伯氏菌的16S rDNA序列同源性为99.4%~99.9%,从基于16S rDNA序列同源性构建的系统发育进化树也发现,菌株GXNN1与肺炎克雷伯氏菌聚为一支.综合其形态特征、生理生化特性、人工感染试验及16S rDNA序列分析结果,可确定黄喉拟水龟肺气肿病的致病菌(菌株GXNN1)为肺炎克雷伯氏菌.药敏试验结果表明,菌株GXNN1对先锋必和舒普深敏感,对氨苄青霉素、氯霉素、多西环素、庆大霉素、诺氟沙星、阿莫西林等15种药物已产生耐药性(不敏感).[结论]肺炎克雷伯氏菌是引起黄喉拟水龟肺气肿病的主要病原菌,LD50为0.63×103 CFU/g,生产中可使用舒普深和先锋必等药物进行治疗.     

嗜水气单胞菌和温和气单胞菌快速PCR方法检测

本研究根据GenBank数据库已发表的气单胞菌属16S rDNA序列,设计嗜水气单胞菌、温和气单胞菌16S rDNA序列的特异保守区,建立这2种菌的快速PCR检测方法。结果表明,仅嗜水气单胞菌和温和气单胞菌得到了特异性扩增,而几种常见弧菌科水产病原菌,包括豚鼠气单胞菌、易损气单胞菌、杀鲑气单胞菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和鳗弧菌并未得到特异性扩增,说明设计的引物可以用于这2种病原的PCR快速检测方法的建立,可以为水产动物嗜水气单胞菌、温和气单胞菌的快速检测、病害预警和病原调查提供技术支撑。     

一株半滑舌鳎致病性假交替单胞菌的分离鉴定与药敏特性分析

从患皮肤溃疡病的半滑舌鳎肝脏中分离到一株优势菌株CSLG2,根据细菌形态学观察、生理生化鉴定、16S rDNA序列鉴定及系统发育进化树分析结果,发现该菌株与假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)同源性最高。对该菌株进行药敏试验,结果发现该菌对米诺环素、红霉素、头孢他啶、头孢曲松、氯霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星等药物高度敏感,而对红霉素、四环素、头孢唑啉、头孢拉定、青霉素和呋喃妥因具有一定的耐药性。     

中华草龟腐皮裂甲病病原的分离鉴定和组织病理学研究

为诊断中华草龟Chinenys reevesiis腹甲腐皮裂甲病,于江西省南昌市某养龟场采集种龟池患病和濒死的中华草龟种龟11只(编号为1～11号),采用病原菌分离纯化、生理生化试验、疑似病原菌人工回感试验、病原菌药敏试验、组织病理检验等方法进行了病因分析及鉴定.结果表明:该病典型的临床症状为腹甲角质层干裂、骨质层发黑,病龟精神状态均表现呆滞、不爱爬动;病理解剖显示,患病龟肝脏发黑,肺发白,胃肠道无内容物、有腹水,内脏团伴有恶臭味;组织病理观察显示,多数病龟密质骨发生裂解坏死,骨髓腔浸润大量嗜酸性粒细胞,同时内脏组织有炎症特征;进一步从病龟腹甲、肝脏、肺组织分离获得5株菌株,经细菌形态学观察、生理生化试验、16S rDNA基因序列及系统发育分析等鉴定为嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila;人工回感染试验显示,感染龟与自然发病龟的临床症状一致,且在回感中华草龟脏器中再分离到相同的菌株;药敏试验显示,该菌对头孢类、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、喹诺酮类抗菌药物高度敏感,对青霉素类、四环素抗菌类药物有耐药性.研究表明,中华草龟腐皮裂甲病的病原菌是嗜水气单胞菌,头孢类、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、喹诺酮类等抗菌药物可作为该病临床防治的首选药品.