免疫斑点法和免疫捕获RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是葫芦科作物上重要的病毒之一.用提纯的黄瓜绿斑驳花叶病毒免疫新西兰大白兔制备CGMMV的多克隆抗体.该多克隆抗体的间接ELISA效价达1∶512 000,与CGMMV17.5 ku外壳蛋白有特异性反应,而与烟草花叶病毒、齿兰环斑病毒和健康植物没有任何反应.用ACP-ELISA分析多抗灵敏度表明多抗检测1∶40 960倍稀释的CGMMV病叶时仍呈阳性反应.用该多抗建立了检测CGMMV的免疫斑点法(dot-ELISA)和免疫捕获RT-PCR方法(IC-RT-PCR).病叶汁液可被dot-ELISA检出的最大稀释度为1∶10 240.IC-RT-PCR从感染CGMMV的病叶组织中扩增到与预期大小相同的480 bp DNA条带,且当CGMMV病叶稀释1∶163 840倍时检测仍呈阳性.检测CGMMV的dot-ELISA和IC-RT-PCR方法的建立为该病毒病的诊断和控制提供了技术支撑.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒多克隆抗体制备及检测应用

将黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaicvirus,CGMMV)辽宁分离物繁殖在葫芦(Lagenaria siceraria)上,用葫芦作为繁殖寄主进行病毒提纯,将提纯病毒制剂免疫家兔制备多克隆抗体,抗体效价为1∶320000,建立了间接ELISA检测黄瓜绿斑驳花叶病毒方法,检测病汁液的灵敏度为1∶32000,检测提纯病毒的灵敏度为4.75×10-5mg。     

A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒西瓜、甜瓜种子的带毒率和传毒率

[目的]加强种子带毒检测,防止黄瓜绿斑驳花叶病毒 (Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)通过种子传播而导致该病害的扩散和流行.[方法]以感染CGMMV的西瓜、甜瓜病株收获的种子为材料,应用DAS-ELISA检测感染CGMMV的种子带毒率和传毒率.[结果]250粒西瓜种子全部为阳性,带毒率达100%;623株西瓜幼苗14株为阳性,传毒率为2.25%.130粒甜瓜种子122粒为阳性,带毒率达93.85%;2 050株甜瓜幼苗58株为阳性,传毒率为2.83%.灵敏度检测种子带毒量在感染种子研磨样体积与健康种子研磨样体积为1/1 000时仍检测是阳性;叶片带毒量在病叶研磨样体积与健康叶研磨样体积为1/10 000时仍检测是阳性.[结论]感染CGMMV西瓜、甜瓜种子带毒率高而传毒率相对较低,说明CGMMV主要以种子表面带毒为主.灵敏度检测表明DAS-ELISA能进行大批量的种子检测.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒外壳蛋白基因原核表达及抗血清制备

将黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV上获得pEHISTEV-CGMMV-CP,转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导,表达出分子量为19.5 kD的CGMMV CP融合蛋白。切胶回收诱导表达的CGMMV CP免疫家兔,制备抗血清。Western Blotting检测发现,制备的抗血清能与CGMMV CP发生特异性免疫反应,与同属的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)无反应。琼脂双扩散试验测定,制备抗血清的效价为1∶16,ELISA测定效价为1∶1024。该血清特异性强、效价高,可用于CGMMV的检测。     

TC/IC-RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据GenBank上登录的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)外壳蛋白基因保守序列,设计特异性引物,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)和免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)技术对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行检测.结果表明,TC-RT-PCR和IC-RT-PCR均具有良好的特异性,检测灵敏度分别比DAS-ELISA高10和100倍;通过对一批进境黄瓜样品的检测,验证了2种检测技术的实际应用效果.因此,本研究建立的TC-RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术,可有效应用于CGMMV的快速检测.     

天津地区几种黄瓜真菌、细菌及病毒性病害研究

针对目前黄瓜各种真菌性病害、细菌性病害和病毒性病害高发的现状,对天津地区黄瓜病害的发生情况进行田间观察,并运用试纸条法、PCR法及RT-PCR法对黄瓜种子和叶片样品进行检测。结果表明:田间观察发现,天津地区黄瓜病害主要有细菌性病害、真菌性病害及病毒性病害,其中真菌性病害最为普遍,褐斑病、白粉病、霜霉病多发;试纸条法在30份黄瓜品种种子样品中检出种传病害瓜类细菌性果斑病病原(Aac)1份,在11份叶片样品中检测出黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)和烟草花叶病毒(TMV)各1份;PCR法在30份种子样品和2份疑似病害叶片样品中有3份种子样品检出细菌性角斑病;RT-PCR法在30份种子样品和6份疑似病害叶片样品中有1份叶片同时检出黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)和烟草花叶病毒(TMV)。     

利用可视化蛋白芯片快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)是瓜类作物上重要的病原病,需建立快捷、准确的检测方法.以硝酸纤维素膜为固相载体,采用ELISA双抗夹心法建立了对CGMMV的可视化蛋白芯片检测方法,并对捕获抗体稀释倍数、样品孵育时间、酶标抗体孵育时间、显色温度等进行优化.结果表明,最佳检测条件为:捕获抗体稀释倍数1∶5,样品20℃孵育1h,酶标抗体20℃孵育1h,20℃15min显色.以50批葫芦科种子为样品,对可视化蛋白芯片检测与DAS-ELISA检测进行了比较,其检测结果吻合率达98.0%;经PCR检验,检测结果一致性良好.说明该方法能对植物病毒做出快速、准确的检测.     

猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测试剂盒的研制及应用

为了开发针对猪圆环病毒2型(PCV2)的诊断技术及其试剂盒,对PCV2的ORF2基因设计相应的特异性引物和探针,采用荧光定量PCR方法检测PCV2。试验表明:该方法循环阈值(Ct)与标准DNA模板在10~1—10~7拷贝/μL浓度范围内具有极好的线性关系,相关系数为0.9999;重复性好,批内试验中Ct值的变异系数在0.59%—1.05%,批间试验的Ct值变异系数为1.9%—4.2%;研制的检测试剂盒与猪瘟病毒(HCV)、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)不发生交叉反应,检测极限和定量极限分别为10和100拷贝数。用此方法对1 000个临床样品进行检测,结果710个被检测为阳性。结果显示,所研制的PCV2诊断试剂盒灵敏度高,特异性强,稳定性好,为PCV2的检测和流行病学的调查提供了一种简便快速的诊断方法。     

水稻抗氧化酶活性测定方法的比较研究

分别用酶检测试剂盒法和传统酶检测法测定水稻根部超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,比较了这两种方法的精确性和灵敏度。结果表明:与传统酶检测法相比,用酶测定试剂盒法检测水稻根部SOD、POD和CAT活性时进样量少,操作简便、快速,且所测定结果的变异系数小。因此在水稻抗氧化酶活性检测中,酶试剂盒检测法的精确度、灵敏度、稳定性、重现性均优于传统酶检测法的。     

水稻抗氧化酶活性测定方法的比较研究

分别用酶检测试剂盒法和传统酶检测法测定水稻根部超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,比较了这两种方法的精确性和灵敏度。结果表明:与传统酶检测法相比,用酶测定试剂盒法检测水稻根部SOD、POD和CAT活性时进样量少,操作简便、快速,且所测定结果的变异系数小。因此在水稻抗氧化酶活性检测中,酶试剂盒检测法的精确度、灵敏度、稳定性、重现性均优于传统酶检测法的。     

口蹄疫病毒O、A、Asia I型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立

[目的]建立一种从田问样品中快速、灵敏、简便检测O、A、Asia I型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA).[方法]采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、Asia I型口蹄疫抗体.将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72 and Asia I/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带.经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒.[结果]本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104 LD50(1:128倍稀释乳鼠毒)的病毒量.同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原(SVD)、水泡性12炎(VS)、水泡性疹(VES)等病毒时无交叉反应;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验,O、A、Asia I型和阴性样本的符合率分别为92.45%、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%.试剂盒在4℃下可保存6个月.[结论]本试验研发的12蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值.     

仙人掌总RNA 提取方法的改进与分析

利用亚硫酸钠分别与TRIzol试剂、RNA plant plus Reagent试剂、BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂、艾德莱EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂和OMEGA Plant RNA试剂结合的方法,均可获得高质量的仙人掌茎总RNA。反转录成cDNA,RT-PCR结果显示,5种方法提取的总RNA反转录后均能特异性扩增到matK基因。使用TRIzol试剂盒、RNA plant plus Reagent试剂盒和艾德莱EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒提取RNA质量相对较高,在cDNA以1∶100稀释时能检测到matK基因;而使用BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂盒或OMEGA Plant RNA试剂盒时,灵敏度稍低,在cDNA以1∶10稀释时,能检测到目的基因。利用亚硫酸钠结合不同植物总RNA提取试剂盒进行比较研究,为后续制备仙人掌茎高质量cDNA文库及其分子生物学研究奠定基础。     

等温荧光定量沙门氏菌快速检测试剂盒的评价与应用

食源性致病菌的快速检测一直是保障食品安全的关键。沙门氏菌(Salmonella)是重要的食源性致病菌之一。本研究以沙门氏菌人工污染的3种样品为对象,对一种基于环介导等温荧光扩增技术的沙门氏菌快速诊断试剂盒进行了灵敏度和准确性评估;再以该试剂盒对市售食品样品和临床腹泻样品适用性进行验证。结果表明,该等温荧光定量沙门氏菌快速检测试剂盒的检测限为10~3 CFU/mL,准确性96.7%以上。所有不同样品的结果显示:阴性样本的假阳性率分别为0.0%、3.3%和3.3%;阳性样本检出率分别为97.9%、100.0%和65.7%(含低浓度细菌污染样品)。该试剂盒具有检测周期短、操作简便、适用性广等特点。     

恩诺沙星单克隆抗体的制备及ciELISA试剂盒的研制

【目的】研制快速、灵敏、特异的恩诺沙星残留检测ciELISA试剂盒(ENR-Kit),为动物源性食品中恩诺沙星(ENR)残留的快速免疫学检测奠定基础。【方法】通过细胞融合技术制备恩诺沙星单克隆抗体(ENR mAb)杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法生产ENR单抗,应用ENR mAb研制ENR残留间接竞争ELISA(ciELISA)快速检测试剂盒,并对其灵敏度、半数抑制浓度(IC50)、特异性、准确度和基质效应性进行检测。【结果】筛选出2株杂交瘤细胞,其单抗亚类均为IgG1亚型。4G1-B3杂交瘤细胞株的ENR mAb间接ELISA效价为1∶1.024×106,亲和常数(Ka)为9×1010L/moL。ENR-Kit的线性检测范围为0.05~48.75μg/L,灵敏度0.05μg/L,半数抑制浓度(IC50)为1.31μg/L,与环丙沙星的交叉反应率(CR)为0.02%,与其他化合物的交叉反应率(CR)均<0.01%。ENR-Kit对牛奶样、鱼肉样和鸡肉样中ENR的平均添加回收率分别为96.49%,86.95%和84.13%,平均变异系数均<10%,不同基质对ENR-Kit检测结果影响小。【结论】研制的ENR-Kit具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合ENR残留快速检测的推广应用。     

化学发光微粒子免疫法检测虾肉中磺胺类药物的残留

[目的]通过对比化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)和高效液相色谱-质谱法对虾肉中磺胺类药物检测结果的差异,验证公司自研的磺胺类药物化学发光免疫试剂盒的检测效果。[方法]以虾肉为检测原料,采用直接竞争CMIA法对试剂盒进行灵敏度、特异性、精密度、准确度试验。[结果]试剂盒检测灵敏度为1.04μg/kg、加样回收率为95.25%~104.50%,变异系数(CV)均小于15%;试剂盒检测结果与仪器分析的阴、阳性结果接近。[结论]该方法检测结果稳定、可靠,达到国家相关标准,表明该款试剂盒可满足动物组织中磺胺类药物的快速检测需求。     

农产品中玉米赤霉醇ELISA检测试剂盒的研制与应用

[目的]建立快速、有效检测农产品中玉米赤霉醇(ZER)残留量的方法。[方法]试验以人工合成的ZER为包被原,ZER为竞争半抗原,两者与一定量的抗玉米赤霉醇单克隆抗体反应,应用间接竞争ELISA法建立玉米赤霉醇单克隆抗体快速检测农产品中ZER含量的半定量检测,同时对该ELISA试剂盒进行了调试。[结果]试验建立检测ZER的ELISA方法,其最适包被浓度为1∶5 000,抗体最适工作浓度为1∶2 500,酶标二抗的最适工作浓度为1∶5 000。试剂盒检测限为0.5 ng/ml,添加回收率在70.0%~116.0%,变异系数小于20%,在2~8℃条件下可保存90 d。[结论]该试验建立的方法可应用于玉米、小麦、高粱等中的玉米赤霉醇的检测,应用前景广阔。     

草鱼肠型点状产气单胞菌双抗夹心ELISA试剂盒的研制

通过对包被单抗和酶标单抗以及抗原最佳工作浓度的优化,建立草鱼肠型点状产气单胞菌双抗夹心ELISA试剂盒检测体系。用分光光度法对检测体系的特异性、稳定性和灵敏度进行测定;用脱脂奶平板法对试剂盒的临床应用进行检测。结果表明,单抗最适稀释液为pH9.4的碳酸盐缓冲液,洗涤液为含φ=0.05%Tween-20的PBS,包被单抗最适体积稀释倍数为1∶800,酶标单抗最适体积稀释倍数为1∶6 000,抗原最佳工作浓度为3×104cfu/mL。试剂盒与肠型点状产气单胞菌有特异性反应,脱脂奶平板法与试剂盒法对草鱼患病检出率基本一致,符合率达90%;试剂盒有很好的储存稳定性,检测灵敏度为7×103cfu/mL。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子检测及云南分离物的序列分析

选取黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)全基因组中MP-CP-3′UTR的保守序列(位于全基因组中第5692~6335位点之间),设计1对特异性PCR检测引物,对云南省疑似带有CGMMV的病叶进行血清学检测和RT-PCR检测,并将目的片段的基因序列与GenBank中登录的CGMMV其他分离物相对应的序列进行比对和分析。结果表明:已报道的CGMMV主要分为4大类群,云南分离物属于第1类群;云南分离物与辽宁分离物亲缘关系最近,可能源于同一株系。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒的鉴定及分子检测

【研究目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的快速鉴定检测是控制该潜在危险性有害生物蔓延的有效途径。【方法】通过汁液摩擦接种、透射电镜观察、双抗夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)和RT-PCR方法对该病毒进行鉴定;同时对RT-PCR反应体系及扩增程序进行优化,建立CGMMV免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)检测方法。【结果】血清学、生物学、电镜观察和分子生物学方法证明供试样本为黄瓜绿斑驳花叶病毒引致。IC-RT-PCR方法可以简化RNA的提取,降低对试验材料要求。【结论】IC-RT-PCR的建立为CGMMV的检测提供了操作更为简便、特异性更强的快速、准确的检测方法。