IBDV超强毒株感染SPF鸡后法氏囊淋巴细胞凋亡及Bax和Bcl-2蛋白动态表达的研究

 为证实传染性法氏囊炎超强毒SNJ93株感染SPF鸡后1～14 d内法氏囊淋巴细胞中Bcl-2、Bax蛋白的动态表达与淋巴细胞凋亡的关系。应用透射电镜观察、TUNEL法标记检测凋亡的淋巴细胞，用免疫组织化学方法检测Bcl-2、Bax蛋白。结果表明，感染后1～7 d可见到大量凋亡的淋巴细胞，其中感染后3～5 d最多。感染后1～9 d Bcl-2蛋白显著高于同时点的对照组（P<0.01）；感染后1～5 d Bax蛋白明显高于同时点的对照组，差异极显著（P<0.01）；感染后第7天高于同时点的对照组,差异显著（P<0.05）； Bcl-2/Bax比率在感染后第1天低于同时点的对照组（P<0.05）；3～5 d明显低于同时点的对照组(P<0.01)。SNJ93感染SPF雏鸡后1～7 d内法氏囊淋巴细胞会发生大量凋亡，Bcl-2/Bax能准确反映淋巴细胞的凋亡程度。     

梓醇调控自噬和凋亡促进 H2O2 诱导的 PC12 细胞存活

探讨梓醇对过氧化氢(H_2O_2)诱导的PC12细胞氧化损伤后调控凋亡和自噬相关分子的机制,采用0.01 mmol,0.1 mmol,1 mmol的梓醇预处理PC12细胞2h后,再用250μmol/L H_2O_2损伤细胞12h.MTT法检测细胞存活率,设置梓醇低、中、高3个剂量组(0.01 mmol,0.1 mmol,1 mmol),自噬抑制剂3MA阳性对照组,阴性对照组,H_2O_2诱导的PC12细胞损伤模型组,采用荧光单标检测LC3Ⅱ的表达,Western blot检测凋亡和自噬相关蛋白Bcl2/Bax,LC3Ⅱ/Ⅰ和Cleaved-caspase 3的表达情况.结果显示,梓醇呈剂量依赖性地提高了H_2O_2诱导的PC12细胞的存活,并对H_2O_2诱导的PC12细胞的LC3Ⅱ/Ⅰ,Bcl2/Bax升高蛋白水平表达,降低了Cleaved-caspase 3的表达;随着梓醇浓度的增加,Cleaved-caspase 3的表达减少,而LC3Ⅱ/Ⅰ和Bcl2/Bax的表达在升高.得出梓醇通过恢复凋亡和自噬相关蛋白Bcl2/Bax,LC3Ⅱ/Ⅰ的平衡能够保护PC12细胞免于H_2O_2诱导的氧化损伤.     

IBDV引起肉鸡法氏囊凋亡相关基因表达变化的机制研究

【目的】探讨IBDV感染过程中凋亡相关基因启动子5-mC甲基化水平的变化,为揭示IBDV引起细胞凋亡的细胞内调节机制提供理论基础。【方法】采用21日龄母源性抗体检测为阴性的商品肉鸡,随机分为对照组(control)和病毒感染组(IBDV),病毒感染组肉鸡用IBDV CJ801毒液进行点眼滴鼻攻毒0.1 mL/只,对照组以同样方式给予PBS。IBDV感染后5 d收集法氏囊组织,采用HE染色观察法氏囊组织病理变化,采用qRT-PCR检测凋亡相关基因的表达,并应用MeDIP-PCR技术检测差异基因启动子的甲基化水平。【结果】与对照组相比,IBDV感染后5 d肉鸡法氏囊出现明显的组织水肿,滤泡面积明显降低,滤泡中出现大量固缩细胞核。促凋亡基因Caspase-8和Caspase-3的表达极显著降低(P0.01),抑制凋亡基因Bcl-2的表达极显著升高(P0.01)。MeDIP-PCR发现,Caspase-3基因启动子的甲基化水平显著升高(P0.05),而Bcl-2基因启动子的甲基化水平极显著降低(P0.01)。【结论】IBDV感染引起凋亡相关基因的表达可能与其启动子甲基化水平有关。     

传染性法氏囊病病毒DNA疫苗的免疫原性研究

 将传染性法氏囊病病毒弱毒株 (IBDV JD1)和强毒株 (IBDV ZJ2 0 0 0 )的基因组A节段全长cDNA、多聚蛋白 (VP2 /VP4/VP3)和主要宿主保护性抗原 (VP2 )基因 ,分别克隆入两种真核表达载体pCI和 pcDNA3,构建成 12种真核表达质粒。将制备的DNA疫苗以 2 0 0 μg的剂量经腿肌和皮下结合途径首免 14日龄SPF鸡 ,2 8日龄以相同的剂量二免 ,二免后 14d攻击IBDV标准强毒BC6 / 85株。结果表明 ,含A节段或多聚蛋白基因的表达载体均能诱导较高水平的中和抗体并能提供对强毒的免疫保护 ,多聚蛋白基因构建成的DNA疫苗与弱毒苗B87的免疫效果相当 ;编码VP2基因的DNA疫苗仅能诱导很低水平的中和抗体 ,几乎不能提供免疫保护 ;以 pCI为表达载体的免疫效果优于pcDNA3;源于ZJ2 0 0 0株基因构建成的DNA疫苗诱导的免疫反应优于JD1株 ,提示DNA疫苗的免疫效果与VP2蛋白的构象、表达载体的调控元件和毒株差异等因素有关。     

重组鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白在多联疫苗中的免疫效果评价

旨在研究重组鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白在多联疫苗中的免疫效果。将50羽21日龄SPF鸡平均分为5组,分别用新流法(新城疫ND-禽流感H9-传染性法氏囊IBD)三联疫苗进行免疫,1组为非免疫对照组,2组免疫剂量0.05 mL,3组免疫剂量0.1 mL,4组免疫剂量0.2 mL,5组免疫剂量0.3。免疫后第21天采血,检测ND/H9血凝抑制抗体和IBD琼脂免疫扩散抗体。并用传染性法氏囊病毒强毒BC6/85株F₁代点眼攻毒,攻毒剂量为每只0.1 mL,观察96 h后剖检。结果表明,免疫后21 d,第5组血清中ND/H9 HI抗体分别为8.1log 2和 9.0log 2,IBD抗体4个试验组均显著高于对照组(P<0.05),5组显著高于2组。1组攻毒鸡全部发病,法氏囊外观发黄,呈胶冻样,囊内剖开有黏液,部分肉眼可见出血。1组未攻毒对照和免疫组,均未见异常,免疫攻毒保护率为100%。结果表明,重组鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白在三联疫苗中免疫剂量为每只0.05 mL,具有良好的免疫保护力,且不影响疫苗中其他抗原的免疫效果。     

家蚕生物反应器表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白的免疫原性研究

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达.用感染后第5日的蚕血淋巴作抗原制备油佐剂苗免疫14日龄非免疫鸡,安全性试验表明,接种1倍和5倍免疫剂量的试验鸡在临床反应和剖检中均无异常变化;在免疫-攻毒试验中设杆状病毒表达的IBDV VP2蛋白和正常蚕血淋巴免疫对照组,并于28日龄加强免疫,25 d后用IBDV强毒BC6/85攻击.通过临床保护率、病理保护率及血清学试验表明,基于多聚蛋白制备的疫苗更成功地诱导了体液免疫应答,比VP2蛋白对IBDV强毒的攻击具有更高的保护力,更适于作为IBD基因工程亚单位疫苗的抗原成分.     

流感病毒在诱导A549细胞凋亡过程中对SIRT1和P53蛋白的影响

采用流式细胞术观察了流感病毒诱导A549细胞凋亡的情况,同时应用Western blot方法研究了SIRT1和p53等蛋白的表达情况。结果表明:1000 TCID50/mL剂量流感病毒感染A549细胞后,细胞表现出典型的凋亡特征,且凋亡比例随感染时间延长而逐渐增加。在流感病毒诱导细胞凋亡过程中,SIRT1蛋白的表达下降,p-p53的表达上升。线粒体中Bax的表达上调,Bcl-2的表达下降。可见SIRT1蛋白参与了流感病毒诱导的A549细胞凋亡,SIRT1蛋白表达下调可能促进了Bax释放进入线粒体和p53蛋白功能的进一步发挥。     

天府肉鸭发育过程中胸腺Bcl-2,Bax基因及蛋白的表达

为探讨胸腺淋巴细胞凋亡的调控机制,将65只天府肉鸭分为22,24,26 d胚龄3个组和胚后0(新生雏),3,5,8,14,17,20,26,29,32周龄10个组,采用免疫组织化学和原位杂交方法研究天府肉鸭胚胎及胚后发育期胸腺中Bcl-2和Bax mRNA及其蛋白的表达情况。结果表明,Bcl-2和Bax mRNA及蛋白免疫阳性反应见于胸腺淋巴细胞及胸腺上皮细胞。胸腺小叶皮质和髓质淋巴细胞BCL-2蛋白阳性率在22 d胚龄~17周龄恒定,20~32周龄呈下降趋势;淋巴细胞BAX蛋白阳性率在22~26 d胚龄恒定,0~8周龄上升,8~17周龄恒定,20~32周龄呈上升趋势;淋巴细胞BCL-2/BAX值在22~26 d胚龄恒定;0~8周龄下降,8~17周龄恒定,20~32周龄下降。胸腺皮质和髓质淋巴细胞Bcl-2 mRNA和Bax mRNA阳性率分别与其蛋白阳性率变化规律一致。各组皮质淋巴细胞Bcl-2 mRNA与蛋白阳性率以及BCL-2/BAX值均显著低于髓质;各组皮质淋巴细胞Bax mRNA和蛋白阳性率均明显高于髓质。推测BCL-2和BAX蛋白及其基因是天府肉鸭胸腺胚胎及胚后发育期淋巴细胞凋亡的重要调节物。     

鸭源NDV对SPF鸭免疫机能的影响

【目的】探讨鸭源新城疫病毒(NDV)对SPF鸭免疫机能的影响。【方法】选用120只已免疫H5N1禽流感油乳剂灭活疫苗的SPF鸭,随机分为静脉注射组、点眼滴鼻组和对照组,每组40只。攻毒(2个试验组接种鸭源NDV 0.2mL(含病毒106 ELD50),对照组点眼滴鼻等量生理盐水)后观测各组鸭的发病死亡情况,于感染后不同时间随机剖杀试验组和对照组鸭,采集脾脏、法氏囊,按常规方法制备石蜡切片,TUNEL法检测脾脏、法氏囊细胞凋亡情况,同时检测血液生化和血液常规指标,并测定鸭源NDV对SPF鸭外周血中淋巴细胞转化率和H5N1油乳剂灭活疫苗HI抗体效价的影响以及CD4+/CD8+的动态变化,分析不同处理组鸭源NDV对SPF鸭免疫机能的影响。【结果】攻毒后,试验组SPF鸭发病率为100%,死亡率为32.5%,并出现呼吸困难、肺脏出血、腺胃乳头出血等症状及剖检变化;血常规检测结果显示,鸭源NDV静脉注射组和点眼滴鼻组血液中红细胞总数、血红蛋白含量先降低后显著升高,血小板总数、白细胞总数降低且均与对照组差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);血液生化检测结果显示,试验组鸭谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、淀粉酶活性升高,总蛋白含量降低,与对照组相比差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);静脉注射组和点眼滴鼻组的H5N1油乳剂灭活疫苗HI抗体效价比对照组低但差异不显著,淋巴细胞转化率与对照组相比降低且差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);静脉注射组与点眼滴鼻组的CD4+/CD8+变化趋势基本一致,均为先升高后降至正常水平以下。TUNEL法检测脾脏、法氏囊均出现细胞凋亡,且凋亡率随着攻毒后时间的增加而升高。【结论】SPF鸭接种鸭源NDV后能引起免疫抑制。     

鸡传染性法氏囊病基因工程活疫苗(VAXXITEK HVT+IBD)免疫效果评估

为评估鸡传染性法氏囊病基因工程活疫苗(VAXXITEK HVT+IBD)的免疫效果,以最小出厂剂量(HVT:2 000 pfu/只)经皮下接种1日龄SPF鸡,28 d后以传染性法氏囊病病毒标准强毒BC6/85株攻毒。攻毒后连续观察4 d,记录临床不良反应,至第4天剖检法氏囊。结果表明:试验鸡在临床上均表现正常;法氏囊剖检显示疫苗免疫组100%正常,攻毒组100%出现典型法氏囊病变。VAXXITEK HVT+IBD疫苗免疫鸡对传染性法氏囊病强毒攻击能产生良好保护。     

人工感染法氏囊病病毒后鸡法氏囊组织变化的研究

为建立传染性法氏囊病的动物模型,将法氏囊病病毒（IBDV）BC6/85毒株人工感染5周龄的SPF鸡,采用组织病理学和免疫组织化学的方法,用打分的形式研究攻毒后2～432h,感染鸡法氏囊中病毒的定位以及法氏囊组织病变和IBDV免疫反应阳性细胞的变化过程。结果显示感染鸡的法氏囊与法氏囊腔中都能检测出病毒和有病理损伤的现象,且IBDV检出的时间迟于损伤出现的时间。法氏囊小结中IBDV免疫反应阳性细胞密度和损伤程度的变化趋势有一定的规律性,表现出先协同增长后有所不同的变化趋势。并在感染后期发现感染鸡法氏囊中仍能检测出病毒且有少量新生的淋巴小结。通过详细记录鸡感染IBDV BC6/85后的整个病程,初步建立了该毒株的动物模型,并通过打分的形式,将感染鸡法氏囊中的病毒增殖与炎症损伤两者联系起来分析,进一步探讨了该病的致病机制并为其今后的研究提供基础数据和理论依据。     

鹅源H5N1亚型禽流感病毒对SPF雏鸡血液免疫功能的影响

以21日龄SPF雏鸡为实验动物,应用细胞培养和免疫酶技术,通过外周血液免疫球蛋白(Igs)含量、T和B淋巴细胞数量及其增殖功能的检测,较全面系统的研究了鹅源H5N1亚型中强毒禽流感病毒(AIV)感染SPF雏鸡后,其外周血液上述被检指标的动态变化.结果表明,鹅源H5N1亚型中强毒AIV感染SPF雏鸡后,其血清IgG和Ig...     

传染性法氏囊病病毒变异株二价弱毒疫苗的研究

选用传染性法氏囊病病毒变异株JD1、NB、HZ1弱毒株配制成JN（JD1+NB毒株组成）和JH（JD1+HZ1毒株组成）两种二价弱毒疫苗。分别在14日龄首免和28日龄二免SPF鸡,并于一免后14 d、21 d,二免后12 d分别用强毒株传染性法氏囊病病毒（IBDV）BC6/85株攻击;同时观察疫苗的安全性。结果表明JN和JH疫苗均能诱导SPF免疫鸡产生优良的免疫应答反应,并能使免疫鸡对IBDV-BC6/85株的攻击产生100%的保护。JN和JH疫苗的最佳免疫剂量分别为6 000 TCID₅₀和10 000 TCID₅₀。     

鸡法氏囊中B淋巴细胞的发育

[目的]研究不同生长阶段正常鸡法氏囊内B淋巴细胞的动态变化规律。[方法]以海兰白鸡的200枚种蛋为试验材料,利用免疫组化法研究了IgM、IgG和IgA3种B淋巴细胞在法氏囊内的发育变化规律。[结果]在胚胎13日龄时,法氏囊内可检测到IgM＋和IgG＋2种B细胞,但IgM＋B细胞的数量显著高于IgG＋B细胞,而IgA＋B细胞在胚胎18日龄的法氏囊内才可检测到。随着日龄的增长,IgM＋、IgG＋、IgA＋3种B淋巴细胞整体变化呈上升趋势,并在21日龄时达到稳定。IgM＋、IgG＋、IgA＋3种B细胞分布部位相似,开始均出现在粘膜上皮内,随后分布在皮质中,而在成熟后主要分布在髓质中。[结论]在胚胎13日龄前,IgM＋B细胞可能在法氏囊内已经出现;鸡出壳后初期,法氏囊的体液免疫功能迅速增强,并在21日龄时达到成熟水平。     

传染性法氏囊病重组亚单位疫苗保存期试验

将14日龄SPF鸡分为5组,A、B和C组分别接种保存期为203、403、70 d的传染性法氏囊病重组亚单位疫苗,D和E组不接种。35日龄时,对A、B、C、D组的鸡以100倍法氏囊感染剂量的标准强毒株IBDV BC-6/85进行滴鼻。攻毒后第4天,将所有鸡致死,进行剖检,观察法氏囊眼观病变,取法氏囊组织以琼脂免疫扩散试验检测传染性法氏囊病毒抗原。法氏囊未见到明显肿大、变黄或胶冻样渗出物或出血等眼观病变及法氏囊中传染性法氏囊病毒抗原检测阴性判定为受到免疫保护。将各组的试验数据以x2检验进行统计分析。结果,A、B、C、D组的免疫保护率差别具有统计学意义,A与D组、B与D组、C与D组之间的免疫保护率具有极显著差异。结果表明,在2~8℃保存1年该疫苗的稳定性和免疫原性仍然相当好。     

中药合剂对雏鸡免疫功能的影响

研究了中药合剂对雏鸡免疫功能及干扰素产生的影响。检测了试验组和对照组28,30,34,41,48,55日龄雏鸡血液T淋巴细胞对丝裂原ConA刺激的反应性;CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群及CD4+/CD8+T淋巴细胞比值;ND抗体效价及胸腺、脾脏和法氏囊指数。结果表明,34~41日龄时中药合剂组雏鸡血液T淋巴细胞对丝裂原ConA刺激的反应性明显高于对照组(P<0.05);CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群无明显变化,30~34日龄时能明显提高CD4+/CD8+淋巴细胞亚群比值(P<0.05);34~41日龄时试验组雏鸡HI抗体效价显著高于对照组(P<0.05);可使胸腺、脾脏和法氏囊指数增加,41日龄时法氏囊指数明显高于对照组(P<0.05);中药合剂对IFN具有明显的诱生作用(P<0.01),与NDV诱生组水平相当;同时可明显促进NDV对IFN的诱生(P<0.01)。结果显示中药合剂具有增强机体免疫功能及诱生IFN的能力,为该中药合剂抗NDV提供了理论依据。     

呼肠孤病毒B3分离株感染番鸭的病理组织学研究

番鸭呼肠孤病毒 B3分离株可经滴鼻、饮水、肌肉和爪垫注射与同居感染 1日龄敏感番鸭 ,潜伏期 3- 11d,死亡率 10 0 % ;接种 1日龄番鸭、半番鸭和雏鸡爪垫可引起注射部位炎性反应 ,爪垫和肌肉注射 1日龄半番鸭和雏鸡不死亡 .病毒感染番鸭主要引起肝、脾、心肌、肾、腔上囊、腺胃、肠粘膜下层等组织局灶性坏死 ;肝、脑血管周围和肾间质、肺间质、心肌间有淋巴样细胞或 /和吞噬细胞聚集 ,法氏囊淋巴细胞变性和坏死 .电镜观察表明 ,感染胚肝细胞和脾淋巴细胞胞浆内有大量病毒样颗粒及近核包涵体 ,感染细胞多核化、空泡化及颗粒化 ;发现含有病毒样颗粒的凋亡细胞 ;吞噬细胞胞浆内有病毒样颗粒和含病毒样颗粒的凋亡小体 .此项研究为国内首次报道     

3株广西麻雀源H9N2亚型禽流感病毒对SPF鸡的致病性

【目的】明确麻雀源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)对鸡群的致病性,既有利于了解麻雀在H9N2亚型AIV传播生态链中的作用,对科学防控H9N2亚型AIV的暴发流行也具有重要意义。【方法】选取3株HA基因处于不同进化分支的广西麻雀源H9N2亚型AIV进行SPF鸡致病性试验,将84羽4周龄SPF鸡随机均分为4组(空白对照组和3个感染组)。感染组每组以100μL稀释至106EID₅₀/100μL的病毒液经鼻腔感染16羽SPF鸡,于病毒感染24 h后分别在各感染组放入剩余的5羽SPF鸡作为空白接触组,感染后观察鸡群的临床症状及剖检病理变化,在不同时间点采集器官组织制作病理切片并检测不同器官中的病毒滴度及分布情况。【结果】3株麻雀源H9N2亚型AIV在HA蛋白裂解位点处不存在多个碱性氨基酸插入现象,表现为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV(LPAIV)的典型分子特征;对鸡胚的半数感染量(EID₅₀)在10-6.0/0.2 mL~10-6.8/0.2 mL,半数致死量(ELD₅₀)在10-6.8/0.2 mL~10-7.2/0.2 mL。3株H9N2亚型AIV均可直接感染SPF鸡,且病毒在不同器官中的滴度及分布存在一定差异;感染SPF鸡后均未表现出明显的临床症状和死亡现象,但在上呼吸道的气管及肺脏出现一定程度的充血和出血、气管纤毛脱落及炎性淋巴细胞浸润等病变。3株麻雀源H9N2亚型AIV感染SPF鸡后的排毒期主要介于第1~7 d,且能不经体内适应而直接感染鸡群并排毒;3株麻雀源H9N2亚型AIV在SPF鸡各器官中的复制能力存在一定差异,可在气管和肺脏中进行有效复制,而在肝脏、脑、胰腺、胸腺、心脏、盲肠扁桃体及法氏囊中均未检测到对应的病毒。【结论】麻雀源H9N2亚型AIV可直接感染鸡群且具有在鸡群间水平传播的潜在风险,提示在家禽饲养、运输及销售等环节要做好相关的防护措施,切断AIV在野鸟与家禽间的传播途径,减少禽流感暴发造成的经济损失。     

鸡传染性法氏囊病高免血清的制备与检验

[目的]探索一种新的制备鸡传染性法氏囊病高免血清的方法。[方法]采用IBDV灭活苗对27日龄SPF鸡作基础免疫,活疫苗作3次加强免疫,四免后21 d采血制备高免血清。[结果]试验结果表明随着免疫次数的增加,试验鸡IBD中和抗体滴度逐步增加,一免和二免后中和抗体分别为12 log2和13 log2,三免和四免后中和抗体达到最高值15 log2。[结论]采用该方法免疫SPF鸡,有效保护了法氏囊不受损伤,3次免疫即可获得高效价的IBDV抗血清。