CRISPR/Cas9技术敲除水稻BR降解相关基因的研究

油菜素内酯(BR)是一种常见的植物类激素,在植物的生长发育过程中起重要的调控作用,对水稻株型改良和抗逆性有重要作用。研究首先构建了水稻4个BR降解相关基因的CRISPR/Cas9载体;然后利用农杆菌介导法,将构建好的4个BR降解相关基因的CRISPR/Cas9载体分别转化水稻中花11的愈伤组织,用50 mg/L的潮霉素作为筛选标记,共获得395株转基因植株。其中,有270株属于野生型,61株属于杂合子类型,64株属于突变类型;64株突变体中有39株是杂合突变体,25株是纯合突变体,纯合突变的概率为6.25%。4个基因均获得了突变材料,但不同基因的突变效率不同,其中转LW26的植株突变率高达41%。     

基因组水平上水稻受体激酶基因家族的生物信息学分析

 对已完成全序列分析的籼稻(北京基因组信息中心,BGI)和接近完成全序列分析的粳稻(国际水稻基因组测序计划,IRGSP)的蛋白质数据库进行两步HMM(hidden markov model)模式匹配搜寻,在基因组水平上分别获得籼稻和粳稻受体激酶5个基因家族的成员序列共643和701个,对粳稻受体激酶进行了详细的生物信息学分析。对粳稻和籼稻的同源比较分析表明,受体激酶基因存在非常强的保守性,但不同基因在基因组水平上可能存在不同水平的扩增。对Swissprot数据库的同源分析表明,这些基因是植物特有的受体激酶。搜     

水稻叶片融合基因LF1的图位克隆及功能分析

[目的]克隆并解析水稻叶片融合基因LF1(Leaf Fusion 1)的功能,为阐明水稻叶片发育的分子机制奠定基础.[方法]lf1为水稻品种'02428'组织培养获得的叶片融合突变体.利用水稻叶片融合突变体lf1与籼稻品种'N22'构建遗传分离群体,精细定位lf1;结合突变体重测序分析确定候选基因,经基因敲除克隆LF1...     

水稻LRR型受体蛋白激酶OsRPK1胞外区酵母双杂交诱饵载体构建

[目的]寻找水稻LRR型蛋白受体激酶(Leucine rich repeat receptor protein kinase) OsRPK1胞外结构域的互作蛋白.[方法]以日本晴水稻为研究材料,以水稻根部cDNA为模板通过PCR扩增方法得到OsRPK1胞外结构域基因编码片段OsRPK1-OD(969 bp).将该片段插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建重组诱饵载体pGBKT7-OsRPK1-OD.[结果]对pGBKT7-OsRPK1-OD进行毒性检测和转录自激活鉴定,酵母生长结果发现,含有pGBKT7-OsRPK1-OD载体的Y2H Gold细胞,在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal营养缺陷型固体培养基上生长出白色菌落,在SD/-Trp/X-α-gal/AbA固体培养基上生长受到抑制;在SD/-Trp生长出含有pGBKT7-OsRPK1-OD载体的Y2H Gold酵母菌落大小与转化了空载的酵母菌落大小一致,显示插入的OsRPK1-OD对酵母生长无毒性作用.[结论]OsRPK1-OD无法参与激活转录酵母中报告基因HIS3,ADE2,MEL1和AUR1-C,该片段可以作为诱饵基因筛查水稻cDNA文库,寻找与之相互作用的蛋白质.     

水稻空间诱变矮秆新种质CHA-1的遗传分析及基因定位

经空间诱变获得1个稳定遗传的水稻矮秆突变体CHA-1,对该突变体进行了株高遗传分析.结果表明,CHA-1的新矮生基因(暂命名为h)为1对隐性主效基因,与sd-1基因之间存在互补作用,并且表现为一定程度的连锁关系,2对矮生基因共同控制着CHA-1的株高性状.利用SSR分子标记将CHA-1的新矮生基因h定位在水稻第1染色体的长臂上,与标记RM302遗传距离为5.1 cM.     

外源水杨酸对水稻苗期生长与防卫相关基因表达的影响

为探究外源水杨酸(SA)对水稻苗期生长与SA相关防卫反应的影响,用不同浓度外源SA喷施苗期日本晴水稻,利用分光光度计测定水稻苗期生长关键指标叶绿素含量,采用qRT-PCR定量分析外源SA对水稻苗期SA合成基因PAL1、SA受体基因NPR1、SA信号途径下游的转录因子WRKY45/WRKY76和防卫基因PR1a/PR1b的表达水平。结果表明,外源SA对上述水稻基因的影响不同,即低浓度SA在一定程度上促进水稻苗期叶绿素积累,并显著影响水稻苗期防卫相关基因的表达水平;高浓度SA抑制叶绿素的积累,影响水稻的正常生长。综合比较结果显示,喷施2.0 mmol·L^-1外源SA对水稻苗期防卫相关基因表达的影响最为有效,该结果为进一步探索外源SA促进水稻苗期生长并提高水稻苗期防卫能力的作用研究奠定基础。     

一个水稻显性矮秆突变体的遗传特性与降株高能力

通过EMS(甲基磺酸乙酯)诱变获得遗传稳定的水稻显性矮秆突变体Dy。与野生型盐恢269相比,突变体表现株高明显矮化,主要农艺性状(穗长、粒长、粒宽、分蘖数、千粒质量、结实率、抽穗期)均发生显著改变。赤霉素(GA_3)和油菜素类固醇(BR)敏感性分析结果表明,Dy中GA_3含量显著高于野生型,经GA_3处理后,Dy的第2茎节长与野生型无显著差异,表明Dy对GA_3不敏感;而经BR处理后,Dy的第2茎节伸长受到明显抑制,表明Dy对BR敏感。遗传分析结果表明,突变体Dy受1对显性核基因控制。以突变体Dy/Dular的F_2群体作为基因定位群体,将该基因定位于第3条染色体长臂SSR标记YC327和YC329之间,遗传距离为0.93 cM。通过与7个籼稻恢复系和8个常规粳稻品种杂交F_1株高的调查,发现突变体Dy具有较强的降株高能力,降株高率最高达41.23%。     

基因捕获技术及其在水稻突变体库构建上的应用

基因捕获是一种新的基因标签技术．被广泛应用于植物突变体库的构建及基因分离。近年来,基因捕获技术应用于水稻突变体库构建方面取得了显著进展;介绍了基因捕获技术及其在水稻突变体库构建上的应用。     

水稻向地性突变体的鉴定与遗传和定位分析

从水稻籼稻品种E优428的诱变M1代群体中获得向地性突变体la(t),该突变体在苗期倒伏生长,成熟期呈匍匐型生长,其它性状未发现异常。初步的生理研究表明该突变体不受外源激素(2,4-D,赤酶素)和光照的影响,并失去了感受重力的能力。遗传分析表明,该突变属单基因隐性突变,将该基因暂定名为la(t)。利用该突变体与籼稻品种D62B杂交,构建了F2代分离群体,用微卫星标记分析,将该基因定位于水稻第11染色体上的微卫星标记Lu2和Lu18之间,与目的基因分别相距1.0和1.7cM。通过电子杂交的方法将该基因所在区域的遗传图谱整合到国际水稻基因组计划的水稻第11染色体物理图谱中,其la(t)基因两端毗连的Lu2和Lu18SSR标记之间的物理距离约为140～200kb。为用图位克隆法分离此目的基因和研究水稻向地性生长的分子机理奠定基础。     

抑制水稻WRKY10基因表达的分析

在水稻T-DNA插入突变体库中发现一个生长缓慢的突变体Osdg,其T-DNA插入位点侧翼序列编码一个WRKY类转录因子(OsWRKY10)。为了明确插入位点的基因是否为引起突变表型的基因,构建了抑制OsWRKY10基因表达的dsRNA干涉载体并转化水稻(Oryza sativa L.subsp.japonica,中花11),获得转基因植株(WInW)。T1代转基因植株的表型观测结果表明,部分WInW干涉植株出现生育期延长、株高下降、分蘖数减少、穗长缩短等表型,与突变体Osdg的突变表型相似,这说明,抑制OsWRKY10基因的表达可能延缓水稻的生长发育,该基因与引起Osdg突变表型的基因具有相似功能。     

雌激素受体α和孕激素受体在不同发情周期牦牛子宫中的表达变化

 【目的】观察发情周期不同阶段牦牛子宫中ERα、PR mRNA和蛋白的表达变化。【方法】采用实时荧光定量PCR技术和免疫组织化学SP法分别对发情期、发情后期、间情期和发情前期牦牛子宫中ERα和PR mRNA及ERα和PR蛋白的表达特点进行了研究。【结果】发情周期不同阶段牦牛子宫内膜和肌层中均有ERα mRNA和 PR mRNA的表达,ERα和PR蛋白免疫阳性产物表达于子宫腔上皮细胞、腺上皮细胞、基质细胞、血管内皮细胞和子宫肌层平滑肌细胞中;子宫内膜中ERα mRNA和PR mRNA在发情后期表达最强,间情期显著下降（P＜0.05）,发情前期回升;ERα和PR蛋白表达在发情期最强而间情期最弱;子宫肌层中ERα mRNA和PR mRNA的表达在发情期较高,发情后期显著下降（P＜0.05）,间情期降到最低,发情前期显著回升（P＜0.05）,且达到最高值;ERα和PR蛋白发情期表达最强,间情期最弱,但其间无显著差异（P＞0.05）。【结论】ERα和PR在牦牛子宫内膜和肌层中随发情周期不同呈周期性变化,参与调节发情周期不同阶段牦牛子宫内膜及肌层功能的发挥。     

少精不育患者体细胞与精细胞的雄性激素受体基因突变的比较与分析

目的：了解雄性激素受体基因（ Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ）突变对少精不育病症发生所起的作用及突变的来源。方法：利用 Ｐ Ｃ Ｒ 对４５ 例精液标本和配对的血液标本 Ａ Ｒ基因８ 个外显子分别进行扩增。扩增产物经琼脂糖电泳和聚丙烯胺的 Ｃ Ｄ Ｇ Ｅ电泳分析，检测基因片段的插入和缺失及点突变。结果：４５ 例少精不育患者的精液标本中，外显子 Ａ 即基因转录激活区发生点突变者３ 例，插入突变４ 例，缺失突变３ 例共１０ 例，占２２．２％ ；外显子 Ｈ 发生缺失突变１ 例、外显子 Ｇ 处发生点突变１ 例、外显子 Ｅ发生完全缺失突变１ 例、不完全缺失突变１ 例；同时他们的血液标本中，只有３ 例在外显子 Ａ发生插入突变。结论：雄性激素受体基因外显子 Ａ 即基因转录激活区的突变是造成少精不育的重要原因。突变一般发生在减数分裂期，少数是亲代遗传。     

极低密度脂蛋白受体功能研究进展

论述了动物体内极低密度脂蛋白受体的结构、功能,对极低密度脂蛋白受体与载脂蛋白受体的进化关系进行了研究,并对其功能进行了推测。     

GPER激动剂对发情周期小鼠卵巢EGFR表达的影响

【目的】探讨G蛋白耦联雌激素受体(G-protein-coupled estrogen receptor,GPER)激动剂对卵巢表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)表达的影响,为阐明GPER和EGFR在卵巢功能维持中的作用奠定基础。【方法】取间情期小鼠,将其分为40,200,1 000ng/只G-1腹腔注射组和对照组(腹腔注射等体积生理盐水),每组20只,各组小鼠进行相应的处理。注射G-1后,依次取发情前期、发情期、发情后期和间情期小鼠各5只,脱颈处死,迅速取出卵巢,采用免疫组织化学SP法和实时定量RT-PCR法,研究不同剂量GPER激动剂G-1对发情周期小鼠卵巢EGFR分布及其mRNA表达的影响。【结果】EGFR在小鼠卵巢的各级卵泡、黄体和间质中均有表达,且在卵泡颗粒细胞和卵母细胞中表达最明显,在黄体和间质中的表达较微弱。同一发情时期卵巢中,EGFR的相对表达量随注射G-1剂量的增加而升高,除发情后期外,其他3个时期以1 000ng/只G-1注射组均极显著高于对照组(P0.01);间情期和发情前期则以200ng/只G-1注射组显著高于对照组(P0.05)。各组发情周期小鼠卵巢中EGFR mRNA表达量的变化规律与EGFR相对表达量的表现基本一致。【结论】G-1对发情周期卵巢中EGFR的表达有一定的上调作用,提示GPER可介导雌激素经EGFR信号级联参与卵巢周期性生殖活动和卵泡生长发育的调节。     

大白母猪的ESR和PRLR二个基因位点多态性及共与产仔数相关性初探

采用PCR－RFLPs方法，分析了88头大白母猪ESR、PRLR二个基因位点的多态性及其与产仔性能、仔猪生长性能、乳头数的相关性。结果表明：二个位点在大白母猪中存在多态性；该试验中，PRLR位点不同基因型对产仔性能影响是AB＞BB；ESR位点的不同基因型对产仔性能影响是BB＞AB＞AA；二个基因位对仔猪生长性能和乳头数不产生显著的影响。     

下丘脑IFN-γR和ER免疫组化双标技术探索

[目的]选出一种提高下丘脑中雌激素受体(ER)和γ-干扰素受体(IFN-γR)免疫组化双标阳性检出率和染色强度的方法。[方法]用MaxVision法对大鼠下丘脑冰冻切片和石蜡切片分别进行IFN-γR和ER免疫组化双标染色,其中石蜡切片进行抗原微波修复。[结果]下丘脑石蜡切片抗原微波修复后IFN-γR和ER阳性检出率较冰冻切片有明显提高,且双标着色对比鲜明,易于镜下观察。[结论]下丘脑IFN-γR和ER免疫组化双标染色宜选用石蜡切片并进行微波修复,能提高双标阳性率,且显色强,值得推广。     

Screening for Monoclonal Antibodies Against the Membrane Proteins of Chicken Embryo Fibroblast Blocking the Infection of IBDV

This article aims to establish an efficient assay for screening monoclonal antibodies （McAbs） against the membrane proteins of chicken embryo fibroblast （CEF） for further studies of the cellular receptors of infectious bursal disease virus （IBDV）. McAbs against the membrane proteins of CEF were prepared by cell fusion. The monolayer CEF pre-incubated with the CEF-specific McAbs for 2 h were infected with IBDV and incubated with F22-EA6-biotin postinfection. Then, the cells were reacted with streptavidin-horseradish peroxidase （HRP） and finally stained by 3-amino-9-ethylcarbazole （AEC）. The inhibitive percentage of IBDV infection was calculated by counting the IBDV-infected cells to determine the inhibition efficiency of the CEF-specific McAbs. Compared with the control cells, the IBDV-infected cells pretreated with CEF-specific antibody significantly decreased; supernatant fluids of a total of 768 hybridomas were analyzed. The results of immunohistochemistry assays showed that six of them （1A5, 1H11, 2B 12, 3G1, 4D10, and 4B8） have the abilities to block the infection of IBDV to CEF, among which 4B8 can perfectly block the infection. This novel method is a sensitive and specific assay for the screening of CEF membrane protein-specific McAbs, which can block the infection of IBDV to CEF, and these McAbs can be used for the further investigations of the cellular receptors of IBDV.     

小鼠Lrh-1基因CDS区序列克隆及分析

肝受体类似物-1（liver receptor homolog-1,Lrh-1;NR5A2）是核受体的Ftz-F1亚家族成员,在胚胎发育、分化、胆固醇代谢、胆汁酸的动态平衡以及类固醇激素生成等都具有重要的作用。通过对健康的经产小鼠不同个体间Lrh-1基因CDS（Coding Sequence）特征域区测序及比对分析,结果发现,在LBD（Ligand binding domain）配体结合域区存在较大序列差异,有2种类型,1种与NM₀01159769相似,而另1种则与NG₀12313.1相似,两者序列差异较大,当翻译为多肽链后发现,第2种类型的序列中提前出现终止子,氨基酸数量相对减少83个,但这种缺失未导致该基因功能的丧失,表明该区段与Lrh-1蛋白质功能的不紧密性。     

G15对发情周期小鼠卵巢表皮生长因子受体表达的影响

【目的】研究G蛋白偶联雌激素受体(G-protein-coupled estrogen receptor,GPER)对发情周期小鼠卵巢表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)表达的影响。【方法】间情期小鼠腹腔注射GPER抑制剂G15,按注射剂量0.3,1.5和7.5nmol/只设3个注射组,另设腹腔注射等体积生理盐水的对照组;药物注射后,依次取发情前期、发情期、发情后期和间情期小鼠的卵巢,用免疫组织化学SP法和RT-PCR法分别检测各组小鼠发情周期不同阶段卵巢EGFR及其mRNA的表达。【结果】EGFR免疫组化阳性产物主要分布于卵巢的各级卵泡中,阳性染色随卵泡发育而逐渐增强,其中颗粒细胞越靠近卵母细胞染色越强,发情周期卵巢EGFR相对表达量表现为发情期发情前期间情期发情后期。小鼠注射G15后,各情期卵巢中EGFR的表达呈G15剂量依赖性减弱,除发情后期外,均极显著下降(P0.01);1.5和7.5nmol/只G15注射组各情期EGFR的相对表达量无显著差异(P0.05),但均极显著低于0.3nmol/只G15注射组(P0.01)。EGFR mRNA的变化规律与EGFR相对表达量的变化趋势完全一致。【结论】G15可在一定程度上通过GPER下调发情周期小鼠卵巢中EGFR的表达,从而影响发情周期卵巢的功能。