近交对马氏珠母贝生长性状、遗传多样性及矿化基因表达的影响

[目的]探讨近交对马氏珠母贝生长性状、遗传结构及矿化基因表达的影响,阐明近交引起子一代性状退化的遗传原理,为贝类品种培育提供参考依据.[方法]以两个黄壳色全同胞家系(M和N)为亲本,按照因子设计构建4个家系组合(F1:M1♀ ×M1♂;F2:M1♀ ×N1♂;F3:N1♀ ×M1♂;F4:N1♀×N1♂),比较4个家系成贝生长性状差异,利用9对SSR引物分析其遗传多样性,并以实时荧光定量PCR检测家系间矿化基因nacrein、pearlin和pif177的表达差异.[结果]4个家系间的平均壳长、平均壳高、平均壳宽、平均体重和平均壳重存在明显差异,且近交家系(F1和F4)的平均壳长、平均壳高、平均壳宽、平均体重和平均壳重均小于杂交家系(F2和F3),其生长性状退化率(Ⅲ)为11.7%~29.4%.家系F1、F2、F3和F4的平均观测杂合度分别为0.2525、0.3116、0.3178和0.2752,平均期望杂合度分别为0.3451、0.3822、0.4005和0.3549,平均多态信息含量(PIC)分别为0.4591、0.5389、0.4878和0.4810.杂交家系(F2和F3)矿化基因nacrein、pearlin和pif177的相对表达量均高于近交家系(F1和F4),且4个家系的生长性状平均值与3个矿化基因的相对表达量存在明显正相关.[结论]近交能导致马氏珠母贝生长性状、遗传多样性及矿化基因表达量明显降低,因此制定马氏珠母贝育种方案时应构建合理的交配组合系统,防止因近交导致性状退化与遗传多样性指标降低而影响育种进程.     

ucp2基因敲除斑马鱼的模型建立 及其铝暴露神经毒性相关研究

利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼ucp2基因,研究ucp2基因在铝致斑马鱼痴呆中的作用.针对斑马鱼ucp2基因设计并制备gRNA,通过显微注射技术将gRNA与Cas9-mRNA混合注入斑马鱼单细胞胚胎中,利用酶切和基因测序筛选出发生突变的F0代斑马鱼,与野生型斑马鱼杂交得到F1代斑马鱼杂合子,分析其突变类型,将突变类型一致的斑马鱼杂合子杂交,获得F2代.在酸性AlCl3中暴露F2代斑马鱼胚胎,暴露组的斑马鱼个体行为出现异常,移动距离、移动速度和移动频率皆显著下降(P＜0.01),体内活性氧(ROS)水平显著升高(P＜0.01);其中KO+AlC13组导致的异常更为明显,psen1、psen2、tnf-α和il-1 β mRNA转录水平显著上调(P＜0.01).ucp2在铝致斑马鱼痴呆中起到重要作用,可能是其关键的治疗预防靶点.     

乙肝病毒基因在转基因小鼠中高效表达的研究

采用传统育种方法,将整合含有人类乙肝病毒(HBV)基因的转基因小鼠通过近交和远交的育种方法,获得纯合子小鼠,收集由纯合子小鼠产生的双重杂合子小鼠及后代小鼠的血清,用竞争PCR联合产物酶联杂交技术定量测定血清中的HBVDNA量。结果表明:相对于单纯杂合子小鼠,纯合子小鼠的表达量增高不明显,而双重杂合子小鼠的表达量有明显提高。将双重杂合子再进行杂交传代,其后代也有增高趋势。     

新疆一例汉族家系β地中海贫血IVS-Ⅱ-654(C→T)的基因分析

应用聚合酶链反应结合等位基因特异的寡核苷酸探针斑点杂交技术(PCR/ASO),对新疆首例β地中海贫血(β地贫)家系进行基因分析,从12名家系成员中检出7例β地贫基因突变(IVS-(?)-654,C→T)的杂合子。结合家系调查、临床症状及血液学检查结果,证实先证者的致病基因来源于父方。该研究对了解新疆地区β地贫基因突变类型和频率,以及开展产前诊断具有重要意义。     

鸡PAPPA2基因在卵泡中的时空表达特性分析

为探讨PAPPA2基因在鸡卵泡生长发育中的调控作用,以150日龄海兰褐蛋鸡为供试材料,采用相对定量RT-PCR方法对PAPPA2基因在鸡卵巢组织不同发育时期卵泡中的mRNA转录水平进行检测分析,并用免疫组织化学方法对PAPPA2蛋白质分子在鸡前等级卵泡中的时空表达模式进行了蛋白定位分析。结果表明:鸡PAPPA2基因mRNA在卵巢间质、各前等级卵泡和不同等级化的卵泡中均有表达,但也表现出其在不同卵泡组织中转录水平的差异性,其中,PAPPA2基因在间质组织、5~6 mm、6~7 mm、F2卵泡中的mRNA转录水平最高(P0.05),而在4~5 mm前等级卵泡和F3卵泡中的mRNA表达量最低(P0.05)。由此表明,鸡PAPPA2基因对处于不同阶段的卵泡生长发育发挥着不可或缺的调控功能,且表现出卵泡的不同生长发育程度可能与PAPPA2基因的转录水平之间有着剂量依赖关系。通过免疫组化检测结果可见,鸡PAPPA2蛋白质分子在卵巢间质组织、卵母细胞和颗粒细胞中均有表达,但在膜层细胞中未检测到其表达信号。初步推断,鸡PAPPA2分子可能以旁分泌或自分泌的方式在卵泡的生长发育过程中发挥着重要调节作用。     

五指山猪3个近交家系内微卫星等位基因的遗传变化

 【目的】探索五指山猪近交3个不同家系F14-F18等位基因的遗传学规律,为大型动物近交系培育提供依据。【方法】利用14对微卫星DNA引物,以五指山小型猪（Wuzhishan Miniature pig,WZSP）F13-F18世代的3个近交家系为研究对象,通过估算基因杂合度（H）、多态信息含量（PIC）和等位基因数（N）等参数,检测近交3个家系微卫星等位基因的纯合度,以及随近交代数的推进每个星座上等位基因的变化规律。【结果】WZSP近交系Ⅰ系F14-F16的14个微卫星座平均每个位点等位基因数为2个、平均杂合度为0.40、多态信息含量为0.26;Ⅱ系F15-F18的平均等位基因数为1.92,平均杂合度分别为0.32,多态信息含量为0.25;Ⅲ系F14-F17的平均等位基因数为2.17,平均杂合度为0.44,平均多态信息含量为0.32。【结论】随近交代数的推进,每个星座上等位基因数越来越少,基因的纯合度越来越高,但WZSP近交系微卫星等位基因的纯合度有一定的限度,与近交鼠有所不同;在近交系3个家系各个世代中有少数几个基因座,如Sw874和Sw936等一直处于高度杂合状态,这可能与WZSP近交家系的种质特异性有关,推测与这些基因座处于同一连锁群的某些功能基因在维持极高近交水平下WZSP的基本生存能力中起着关键作用。3个近交群体间的分化系数在0.07以上,已各自成为独立家系;3个家系的近交程度不完全一致,基因的纯合度亦不同,Ⅱ系最高、14个微卫星座中7个纯合,其次为Ⅰ系和Ⅲ系。     

NF-κB家族亚基在不同品种绵羊背部皮肤中基因水平表达差异的分析

羊毛是养羊业的主要产品之一,其是由皮肤内的附属器官毛囊发育而来,其中弯曲度是衡量其质量的重要指标之一。为了解NF-κB家族各亚基(NFκB1、NFκB2、RELA、RELB和REL)在不同品种绵羊背部皮肤中基因水平的表达差异,分析其在不同品种绵羊背部皮肤中与形成毛发性状差异相关的关键性基因,选取美利奴羊和晋中绵羊2个不同品种的绵羊作为研究对象,利用实时荧光定量PCR方法检测不同品种绵羊背部皮肤中NF-κB各亚基的表达水平。结果显示,NF-κB各亚基在美利奴羊和晋中绵羊背部皮肤中的相对表达量均有差异,除RELA外,其余各亚基mRNA的相对表达量美利奴羊均高于晋中绵羊;美利奴羊皮肤中,NFκB2 mRNA相对表达量最高,RELA mRNA次之;晋中绵羊皮肤中,RELA mRNA相对表达量最高,NFκB2 mRNA次之。结果揭示,NFκB2可能对于羊毛弯曲性状的形成具有促进作用,而RELA可能对于羊毛弯曲性状的形成具有抑制作用;NFκB2与RELA适当的相对表达水平可能对于毛发弯曲性状的形成起重要的调控作用。     

虾夷马粪海胆CYP17基因的克隆及其表达差异

采用分子生物学方法成功克隆了虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius CYP17基因。该基因的cDNA全长为1 570 bp,其中开放阅读框1 482 bp,编码493个氨基酸;CYP17蛋白的相对分子质量约为55 540,等电点为8.068,信号肽断裂位点位于第18和第19个氨基酸残基之间;虾夷马粪海胆的CYP17氨基酸序列与紫球海胆S.purpuratus的同源性为97%,与光棘球海胆S.nudus的同源性为96%。用RT-PCR技术对CYP17基因在虾夷马粪海胆生殖腺不同发育时期的表达差异进行了分析。结果表明:在虾夷马粪海胆3个家系的雄性个体生殖腺中,CYP17基因在1-3家系的表达量最高,依次为10-3家系、6-2家系,而在雌性个体生殖腺中,CYP17基因在10-3家系的表达量最高,依次为1-3家系、6-2家系;在4-1家系海胆3个不同发育时期,CYP17基因在雄海胆性腺中的表达量随着日龄的增加而增加,而雌海胆性腺在发育第430天到第447天时表达量略有增加,发育到第512天时表达量明显增加。本研究表明,CYP17基因在海胆雌、雄个体生殖腺中转录水平上的表达差异明显,雄性的表达量明显高于雌性。     

1—2月龄荷斯坦奶牛不同组织中FMDV受体亚基αv、β3、β6 mRNA转录水平的相对定量研究

【目的】建立检测牛口蹄疫病毒(FMDV)受体亚基αv、β3、β6 mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,分析受体αvβ3和αvβ6在不同器官组织中的转录水平。【方法】在对牛FMDV受体基因克隆和测序的基础上,设计实时定量PCR引物,以GAPDH为内参基因,采用△△Ct相对定量PCR方法检测分析FMDV受体亚基αv、β3、β6 mRNA在1—2月龄荷斯坦奶牛体内不同器官组织中的转录表达谱。【结果】αvβ3在荷斯坦奶牛24种组织中均有不同程度的转录表达;αvβ6在甲状腺、硬腭、鼻内皮、喉头、肺、食管、肾、后蹄冠状带等组织表达量较高,在唇、舌皮、软腭、气管、心脏、瘤胃、直肠、前蹄冠状带等组织转录表达量适中,在唾液腺、下颌淋巴结、肝、脾、肌肉等组织未检测到表达;αvβ6在牛体内的表达分布与FMDV组织嗜性基本一致,αvβ6受体可能是决定FMDV组织嗜性的主要功能受体,αvβ3的组织分布似乎与FMDV组织嗜性无关,但不能排除αvβ3在病毒感染过程中的作用。【结论】建立了检测FMDV受体亚基mRNA在不同器官组织中表达水平的相对实时定量PCR方法。     

家蚕cbp基因的表达与幼虫体内类胡萝卜素的水平相关

[目的]调查家蚕幼虫期类胡萝卜素水平的变化及cbp基因的mRNA表达特征。[方法]选取黄茧和绿茧品种家蚕3、4和5龄期幼虫的丝腺,参照Takara Trizol plus试剂说明提取总RNA,根据文献提供的cbp基因序列设计特异引物,采用RT-PCR方法调查不同茧色品种家蚕幼虫不同龄期丝腺中cbp基因mRNA的表达特征和主要组织中类胡萝卜素的水平变化。[结果]cbp基因的mRNA表达,在3和5龄期各品种家蚕均维持一定水平,但在4龄期表达量很低或不表达。同一组织的紫外可见光谱扫描结果显示,4龄期家蚕丝腺类胡萝卜素的含量极低,不同茧色品种cbp基因的mRNA表达也存在差异,绿茧品种仅表达1个缺失第2外显子的转录本,而所有黄色茧品种还可表达1个序列完整的转录本。[结论]家蚕体内类胡萝卜素的水平与cbp基因mRNA表达相关。     

深圳地区汉族人凝血因子XIII Val34Leu基因多态性研究

目的：研究深圳地区汉族人凝血因子XⅢ Val34Leu基因多态性特点．方法：应用PCR技术结合Hin6 Ⅰ酶切分析、琼脂糖凝胶电泳。研究深圳地区108名汉族人凝血XⅢ Val34Leu基因多态性特点。结果：深圳地区汉族人等位基因Val34与等位基因Leu34的频率分别为99.07％和0.93％。Val／Val纯合子、Val／leu杂合子和Leu／Leu纯合子的频率分别为98．15％,1．85％和0。结论：深圳地区汉族人凝血因子XⅢ Leu34等位基因频率比高加素人群低。     

Identification of the molecular defect in a family with spondyloepiphyseal dysplasia

Spondyloepiphyseal dysplasias (SED) are a heterogeneous group of inherited disorders characterized by disproportionate short stature and pleiotropic involvement of the skeletal and ocular systems. Evidence has suggested that SED may result from structural defects in type II collagen. To confirm the validity of this hypothesis, the structure of the "candidate" type II collagen gene (COL2A1) has been directly examined in a relatively large SED family. Coarse scanning of the gene by Southern blot hybridization identified an abnormal restriction pattern in one of the affected members of the kindred. Analysis of selected genomic fragments, amplified by the polymerase chain reaction, precisely localized the molecular defect and demonstrated that all affected family members carried the same heterozygous single-exon deletion. As a consequence of the mutation, nearly 90 percent of the assembled type II collagen homotrimers are expected to contain one or more procollagen subunits harboring an interstitial deletion of 36 amino acids in the triple helical domain.     

木质素合成酶基因F5H的克隆及其鉴定

通过RT-PCR从正在分化的2年生欧美杨107号茎的次生木质部提取mRNA,扩增出一基因片段,与pGM-T载体连接,重组质粒经EcoRI酶切、特异性引物扩增、测序鉴定。结果表明,该基因片段长度为867bp,与EMBL核酸序列库中VanDoorsselaere等发表的白杨杂种F5H的cDNA序列(PAJ10324)相比,同源性高达99.19%,可以断定所扩增的DNA片段即为F5H基因片段。     

TOLLIP基因3′侧翼区的群体遗传多态分析

为了寻找TOLLIP基因的突变位点,揭示中国荷斯坦牛的群体遗传特征。以中国荷斯坦牛群体66头个体为研究对象,用PCR方法扩增了牛TOLLIP基因3′侧翼区的部分片段,通过直接电泳与测序相结合的方法检测该片段的多态性,计算基因型频率,基因频率和多态信息含量,分析该多态位点在中国荷斯坦牛群体中的遗传特征。结果表明,该扩增片段的第43 bp处存在5个碱基(TCGGG)的缺失,致使多态性产生。其AA,AB和BB的基因型频率分别为0.3485,0.5152和0.1364;A等位基因(243 bp)和B等位基因(238 bp)的频率分别为0.6061和0.3939;多态信息含量和杂合度分别为0.3635和0.4775,表明该缺失突变在中国荷斯坦奶牛群体中处于中度多态;χ2适合性检验结果表明,中国荷斯坦牛群体在该位点的缺失突变未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。     

miR-31基因家族的分子进化与靶基因预测

 运用生物信息学方法从miRBase数据库中搜索动物物种miR-31基因家族成员的成熟序列,分析其分子进化特征并预测作用靶基因。结果表明,在49个动物物种中获得63条miR-31基因同源序列;miR-31家族成员大部分位于基因间隔区,少数位于内含子区;miR-31不仅存在于常染色体上,而且部分位于性染色体上。miR-31成熟序列长度在21-24 nt之间,序列同源性较高,部分位点在进化过程中发生了碱基突变和缺失。系统进化树显示,miR-31家族成员可分为2个分支。预测到哺乳动物miR-31拥有20个共同候选靶基因,与细胞生长发育、新陈代谢、信号转导、跨膜运输以及转录调控等过程密切相关。研究结果为深入理解miR-31基因家族的生物学功能奠定基础,也为后续研究提供理论依据。     

少精不育患者体细胞与精细胞的雄性激素受体基因突变的比较与分析

目的：了解雄性激素受体基因（ Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ）突变对少精不育病症发生所起的作用及突变的来源。方法：利用 Ｐ Ｃ Ｒ 对４５ 例精液标本和配对的血液标本 Ａ Ｒ基因８ 个外显子分别进行扩增。扩增产物经琼脂糖电泳和聚丙烯胺的 Ｃ Ｄ Ｇ Ｅ电泳分析，检测基因片段的插入和缺失及点突变。结果：４５ 例少精不育患者的精液标本中，外显子 Ａ 即基因转录激活区发生点突变者３ 例，插入突变４ 例，缺失突变３ 例共１０ 例，占２２．２％ ；外显子 Ｈ 发生缺失突变１ 例、外显子 Ｇ 处发生点突变１ 例、外显子 Ｅ发生完全缺失突变１ 例、不完全缺失突变１ 例；同时他们的血液标本中，只有３ 例在外显子 Ａ发生插入突变。结论：雄性激素受体基因外显子 Ａ 即基因转录激活区的突变是造成少精不育的重要原因。突变一般发生在减数分裂期，少数是亲代遗传。     

抗玉米大斑病单基因处于杂合状态时的效应

单基因Ht1、Ht2、Ht3、HtN处于不同水平抗性杂合状态时对大斑病抗性的基因效应不同。通过单基因Ht1、Ht2、Ht3、HtN与同一水平抗性自交系以及与不同水平抗性自交系组配,研究单基因处于杂合状态时在控制病斑数量、面积、病斑扩展速度、产孢量和潜伏期等方面的单基因、多基因的联合效应。结果表明,抗性单基因HtN处于F1代杂合状态时,控制病斑数和病斑面积的效应最强;单基因处于杂合状态时,湿培48 h病斑全部能产生分生孢子,且处于同一水平抗性杂合状态时,Ht1控制产孢量的效应最强;Ht1处于中水平、Ht3处于高水平和HtN处于低水平垂直抗性杂合状态下,控制病斑扩展效应最强;而Ht2处于高水平垂直抗性杂合状态下,控制病斑扩展效应最弱;抗性单基因处于杂合状态下,控制潜伏期多表现超亲现象,HtN控制病害潜伏期比其它单基因显著。     

Identification,Characterization, and Expression of P450 Gene Encoding CYP6BQ13v2 from the Red Flour Beetle,Tribolium castaneum （Herbst） （Coleoptera： Tenebrionidae）

An allele of CYP6BQI3, named CYP6BQ 13v2 （GenBank accession no. FJ209361）, was isolated from the red flour beetle, Tribolium castaneum （Herbst） （Coleoptera： Tenebrionidae） by RT-PCR. The cDNA sequence of CYP6BQ13v2, 1 563 bp in length, contains an open reading frame of 1 554 nucleotides encoding a putative protein of 518 amino acid residues with a predicted molecular weight of 59.92 kDa and a theoretical pl of 7.60. The putative protein contains the classic hemebinding sequence motif F××G×××C×G （residues 456-465） conserved among all P450 enzymes as well as other characteristic motifs of all cytochrome P450s. It shares 98% identity with the previously published sequence of CYP6BQ13 （GenBank accession no. XP967146） from the T. castaneum genome project. Phylogenetic analysis of amino acid sequences from members of various P450 families indicated that there was closer phylogenetic relationship of CYP6BQ 13v2 with CYP302A1 and CYP307A1 mediating synthesis of the insect molting hormone, distant relationship with CYP6B1 metabolizing plant allelochemicals, CYP6D 1 linking to pyrethroid resistance and other members of CYP6 family. Expression test of the gene in the adults and immature stages of T. castaneum by quantitative real-time PCR revealed that CYP6BQ13v2 is expressed in all life stages investigated. The mRNA expression level in 1st instar larvae was 14.9- and 3.86-fold higher than those in pupae and adults, respectively. The CYP6BQ13v2 expression levels appeared in the order of 1st instar larvae, followed by 4th instar larvae, 7th instar larvae, adult, and pupae from high to low. The more bioinformation of CYP6BQ 13v2 was also analyzed.     

马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因酿酒酵母表达载体的构建

以重组质粒pBAD-LRCP-126为模板,经PCR扩增获得了PLRV缺失突变CP基因的特异性条带。目的片段与pYES2.1/V5-His/-TOPO的连接产物转化大肠杆菌TOP10F′获得了氨苄青霉素抗性菌落,酶切与DNA测序结果确认了酵母表达载体的正确性,该表达载体命名为pYES-LRCP-126。在30℃,酿酒酵母工程菌株INVSc1(pYES-LRCP-126)经2%半乳糖诱导培养16h,SDS-PAGE显示蛋白图谱上有一条23kDa的诱导表达的蛋白条带,其大小与预期的重组CP大小相符,表明PLRV缺失突变基因在酵母菌中实现了表达。     

森林草莓糖基转移酶基因家族生物信息学及其表达分析

【目的】对森林草莓糖基转移酶基因（FvUGT）家族进行生物信息学分析及基因表达分析,为深入研究森林草莓UGT基因功能和探索UGT调控草莓果实发育及花色苷及品质形成提供理论依据。【方法】基于Phytozome数据库鉴定得出138个FvUGT基因家族基因,运用生物信息学方法分析其蛋白理化性质、基因结构、保守结构域和进化关系,并采用实时荧光定量PCR对UFGT候选基因在森林草莓（红果和白果2个类型）各组织（根、叶柄、叶和果实）中的表达量进行分析。【结果】FvUGT基因家族可分为12个类群（A、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L和N）,每个类群分别包含16、2、23、32、8、1、5、5、7、3、21和4个成员;染色体定位发现FvUGT基因家族成员在除2号染色体之外的其他染色体上均有分布,且分布不均;FvUGT基因内含子长度、外显子位置和数目在不同成员间均存在差异,FvUGT基因家族在进化过程中产生较强的分化。实时荧光定量PCR检测结果表明,FvUFGT70基因在森林草莓白果和红果的叶和叶柄中有较高表达;FvUFGT94基因在各组织中均有表达;FvUFGT67和FvUFGT68基因在根中有较高表达;而FvUFGT95和FvUFGT96基因在果实中有表达,且显著高于其他组织（P<0.05,下同）。同时,在果实的小绿期、转色期和成熟期的表达表现为,成熟期FvUFGT33和FvUFGT95这2个基因在森林草莓红果类型的表达量显著高于白果类型。【结论】7个FvUFGT基因表现出明显的组织差异性,其中FvUFGT33和FvUFGT95基因在果实中有较高表达量,且在森林草莓红果类型表达量显著高于白果类型,故推测其在花色苷合成中发挥作用。