绵羊痘病毒甘肃流行株膜蛋白ORF23基因的克隆及序列分析

从甘肃景泰县疑似患羊痘的绵羊皮肤组织中提取基因组DNA,PCR扩增膜蛋白ORF23基因.序列分析表明,该基因由1113个核苷酸组成,编码370个氨基酸,A+T含量占69.90%,G+C含量仅占30.10%.绵羊痘病毒甘肃株ORF23基因与A株、NISKHI株之间的核苷酸同源性分别为99.6%和99.5%,氨基酸同源性分别为98.7%和98.4%;与皮肤疙瘩病病毒NW-LW株和山羊痘病毒Pellor株之间的核苷酸同源性均为98.2%.结构预测显示,ORF23膜蛋白为非分泌蛋白,具有一个O连结糖基化位点.可见,ORF23膜蛋白在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,具有潜在的疫苗和诊断研究价值.     

绵羊痘病毒甘肃流行株糖蛋白基因orf118的克隆及序列分析

从甘肃景泰疑似羊痘患病绵羊的皮肤组织中提取基因组DNA,利用PCR技术,克隆糖蛋白orf118基因.比较分析表明,该基因由516个核苷酸组成,编码171个氨基酸,相对分子质量为19 500,其碱基组成极不平衡,其中A T含量占72.48%,G C含量仅占27.52%.甘肃景泰株orf118基因同绵羊痘病毒TU-V02127 株之间的核苷酸同源性最高达99.8%,氨基酸的同源性为100%;与疙瘩皮肤病病毒肯尼亚株和山羊痘病毒G20-LKV 株之间的同源性分别为96.5%和94.8%.结构预测结果显示,orf118蛋白为分泌蛋白,具有2个N键连结糖基化位点和1个跨膜区.以上结果表明,orf118蛋白在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,具有潜在的疫苗和诊断价值.     

绵羊痘病毒甘肃古浪株RING finger基因的克隆表达及序列分析

【目的】对绵羊痘病毒甘肃古浪株RING finger蛋白的基因进行克隆,表达以及序列分析,初步探究绵羊痘病毒RING finger蛋白是否具有E3泛素连接酶活性,为阐明其在绵羊痘病毒感染过程中对泛素蛋白酶体系统的调控作用奠定基础.【方法】以绵羊痘病毒甘肃古浪株DNA为模板,通过PCR扩增RING finger基因.利用Pfam数据库、DNAstar等软件进行序列及遗传进化分析;将RING finger基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-SPPVRFP重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并进行SDS-PAGA和Western-blot分析.【结果】绵羊痘病毒RING finger基因由723个核苷酸组成,编码的240个氨基酸的分子量约为28.5 ku,具有RING finger结构域.不同羊痘病毒株间RING finger基因核苷酸序列同源性高达99.2%,氨基酸序列同源性高达98.3%.不同的RING finger蛋白都含有8个保守的半胱氨酸和组氨酸.SDS-PAGA分析显示,重组SPPVRFP大小约为55 ku,Western-blot分析显示,重组SPPVRFP不能与绵羊痘病毒阳性血清反应.【结论】成功克隆、表达并纯化了绵羊痘病毒RING finger基因,对SPPV GS-GL株RING-finger蛋白进行序列分析,推测其可能具有E3泛素连接酶活性.     

我国草原蝗虫痘病毒资源调查

从我国新疆、内蒙古草原的亚洲小车蝗（Oedaleus asiaticus）、意大利蝗（Calliptamus italicus）、戟纹蝗（Dociostaurus kraussi）、宽须蚁蝗（Myrmeleotettir paipalis）和蒙古硕螽蟖（Deracantha mongolica）上分离痘病毒。病毒包含体球形、椭圆形、近方形、扁圆形,大小为2-12μm,病毒粒子卵圆形,囊膜表面呈桑椹结构,大小为250-350nm。多次观察到蝗虫痘病毒流行病发生,并对其寄主范围、致病力进行考察。     

绵羊痘病毒新疆株的分离及结构蛋白P32基因序列分析

[目的]对绵羊痘病毒当地流行毒株的分离和其结构蛋白P32基因的克隆和序列进行分析,明确引起新疆本地绵羊流行痘病的病毒种类,掌握当前流行毒株的变异情况,为绵羊痘的预防控制及将来研制高效安全疫苗提供科学依据.[方法]将两例疑似患有羊痘的绵羊肺脏组织病料接种于MDBK细胞进行病毒分离,细胞病变组织经处理后通过电子显微镜观察分离病毒.以分离病毒基因组DNA为模板,通过PCR扩增绵羊痘病毒结构蛋白P32基因,并对目的基因进行克隆和基因序列和蛋白生物信息学分析.[结果]两例病料组织接种MDBK细胞后均产生明显的细胞病变,电子显微镜观察可见到约200 nm大小、椭圆形有囊膜的典型痘病毒粒子.对两株病毒表面膜结构蛋白P32基因PCR扩增均可获得与预期大小一致的约972 bp片段,氨基酸序列分析表明分离毒株SPV/Miquang/2013和SPV/Kuche/2013病毒P32基因与绵羊痘病毒参考株同源性分别达96.9;～99.4;和97.5;～100;,生物信息学分析发现SPV/Miquang/2013株P32蛋白有两个关键氨基酸位点发生变异,即第78位谷氨酸突变为赖氨酸,第293位异亮氨酸突变为苏氨酸.[结论]从疑似病例中分离到两株病毒,通过电镜观察及P32基因扩增测序,与其他羊痘病毒比对后鉴定分离毒株为绵羊痘病毒,分别命名为SPV/Miquan/2013和SPV/Kuche/2013.SPV/Miquan/2013的P32蛋白同其他绵羊痘病毒的两个氨基酸位点发生明显突变.     

东亚飞蝗储存蛋白基因LmiHex-2的克隆与表达分析

昆虫储存蛋白是在昆虫体内普遍存在的一种特异性淋巴蛋白,在昆虫的生长发育过程中发挥着重要作用。为分析东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis储存蛋白基因Lmi Hex-2的结构和时空表达特性,通过RACE技术获得了Lmi Hex-2基因2 171 bp全长c DNA序列,其中开放阅读框2 022 bp,编码673个氨基酸,预测分子量78.79 k Da。序列比对结果显示Lmi Hex-2基因c DNA序列与直翅目蝗总科储存蛋白基因c DNA序列的相似性达到82%~89%。RT-PCR结果显示Lmi Hex-2基因在东亚飞蝗卵和若虫阶段均有表达,5龄6 d时表达量最大;成虫中脂肪体表达量最高。通过贝叶斯法构建的系统发育树显示直翅目储存蛋白为单系群,昆虫血蓝蛋白与昆虫储存蛋白聚为姐妹群,二者均由甲壳纲血蓝蛋白进化而来。     

山羊痘病毒P32基因的克隆与序列分析

应用PCR技术,用特异性引物扩增出羊痘病毒结构蛋白P32基因,连接于pMD18-T载体,转化到JM109感受态细胞,对重组质粒双酶切、PCR鉴定与序列分析得出:P32结构蛋白基因全长969 bp,编码323个氨基酸.与山羊痘病毒和绵羊痘病毒P32基因序列同源性分别达99%和97%;与山羊痘病毒和绵羊痘病毒P32基因编码的氨基酸同源性分别达98.9%和96%.     

表达禽流感病毒血凝素基因的重组禽痘病毒的构建

 为构建表达禽流感病毒 ( AIV)血凝素 ( HA)基因的重组禽痘病毒 ,将禽痘病毒启动子LP2 EP2驱动的 H7亚型 AIV HA基因 c DNA和大肠杆菌 Lac Z基因插入禽痘病毒疫苗株 F- 0 1 7的复制非必需区。经蓝斑筛选后 ,对重组病毒又进行了 3次蚀斑克隆。以不同代次重组禽痘病毒核酸为模板 ,利用 H7亚型 AIV HA基因特异的引物进行聚合酶链式反应 ,均扩增出 1条特异的1 .7kb DNA条带。收集不同代次的重组禽痘病毒细胞培养物进行免疫斑点试验 ,均检测到 HA蛋白 ,表明 H7AIV HA在重组禽痘病毒中获得了成功表达。该重组禽痘病毒的构建为 AIV病毒活载体疫苗的研制奠定了基础     

表达禽流感病毒凝素基因的重组禽痘病毒的构建

为构建表达禽流感病毒（ＡＩＶ）血凝素（ＨＡ）基因的重组禽痘病毒,将禽痘病毒启动子ＬＰ２ＥＰ２驱动的Ｈ７亚型ＡＩＶ ＨＡ基因ｃＤＮＡ和大肠杆菌ＬａｃＺ基因插入禽痘病毒疫苗株Ｆ－０１７的复制非必需区。经蓝班筛选后,对重组病毒又进行了３次蚀斑克隆。以不同代次重组禽痘病毒核酸为模板,利用Ｈ７亚型ＡＩＶ ＨＡ基因特异的引物进行聚合酶链式反应,均扩增出１条特异的１．７ｋｂ ＤＮＡ条带。收集不同代次的重组禽痘病毒细胞培养物进行免疫斑点试验,均检测到ＨＡ蛋白,表明Ｈ７ ＨＩＶ ＨＡ在重组禽痘病毒中获得了成功表达。该重组禽痘病毒的构建为ＡＩＶ病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。     

家蚕核型多角体病毒ORF 75基因的生物信息学分析

通过对家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori,nucleopolyhedrovirus:BmNPV)ORF 75基因核苷酸序列进行生物信息学分析,BmNPVORF 75基因位于病毒基因组70 485 bp和71 264 bp之间,编码259个氨基酸残基的多肽,预测分子相对质量为30.8 kDa,等电点为7.67,分子式为C1409H2157N351O390S19;蛋白在大肠杆菌内的半衰期大于10 h;酸性氨基酸(Asp Glu)占10.5%,碱性氨基酸(Arg Lys)占10.8%;蛋白的不稳定指数为42.67,是不稳定蛋白.利用Prosite数据库扫描,查到4类9个蛋白修饰位点.通过Blast搜索氨基酸同源序列发现,BmNPVORF 75同源蛋白存在于所有测序的鳞翅目昆虫杆状病毒中,不存在于其他非鳞翅目昆虫杆状病毒中.同源序列比对结果,BmNPVORF75蛋白的氨基酸序列与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica MNPV)ORF92之间的同源性达到100%,应为相同基因.依照BmNPVORF75同源基因序列相似性,对13种昆虫杆状病毒进行进化树构建分析,其中,BmNPVORF75与薄荷灰夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒(Rachiplusia ouMN-PV)ORF89基因进化距离很近,同源性较高.     

马唐炭疽菌Colletotrichum hanaui三类Gα亚基基因的克隆与序列分析

利用同源克隆的方法,首先克隆马唐炭疽菌Gα亚基基因的同源片段,再通过TAIL-PCR扩增基因片段的上下游邻接序列,经过序列拼接最终成功获得了3类Gα亚基基因cagA, cagB和cagC的全长序列。根据基因序列及CDS序列,运用相关生物学软件对基因序列及其推测蛋白进行了生物信息学分析。基因cagA全长1 380 bp,含5个内含子,编码355个氨基酸;cagB全长1 283 bp,含3个内含子,编码353个氨基酸;cagC全长1 382 bp,含4个内含子,编码354个氨基酸。蛋白同源分析表明,该菌的这3类基因推测蛋白与稻瘟病菌、小麦赤霉病菌中同类基因编码蛋白高度同源,同源率均在75%以上,最高可达99%。     

猪戊型肝炎病毒新疆株swCH25全基因序列的分析

 设计18对PCR引物分片段扩增猪戊型肝炎病毒新疆分离株swCH25全基因，对两末端采用末端快速扩增方法（RACE）进行扩增，扩增产物克隆到pMD18-T载体并测序。用DNAstar软件进行序列同源性分析，PHYLIP软件绘制基因进化树，在全基因序列的基础上比较猪HEV与其它HEV基因型的差异和人源HEV的关系。结果显示swCH25全序列除去3′poly（A）尾，由7 243个核苷酸组成，ORF 1～3分别编码含1070，674和114个氨基酸的蛋白质。全基因序列与HEVⅠ、Ⅱ和Ⅲ型同源性73.5%～75.7%，与Ⅳ型的同源性为83.5%～89.8%，其中与Ⅳ型中国人源T1株最高，达89.8%。ORF1与Ⅰ～Ⅲ和Ⅳ型的核苷酸同源性分别为71.6%～74%和82.3%～89.4%，氨基酸同源性为80.7%～86.1%和94.3%～96.0%；ORF2与Ⅰ～Ⅲ和Ⅳ型的核苷酸同源性分别为78.4%～81.3%和87.1%～90.9%，氨基酸同源性为89.7%～93.8%和97.2%～98.2%；ORF3与Ⅰ～Ⅲ和Ⅳ型的核苷酸同源性分别为84.4%～87.3%和95.4%～96.8%，氨基酸同源性为74.8%～83.2%和93.8%～97.4%,基因进化树显示swCH25与基因Ⅳ型人源T1株最接近，在同一分支上。swCH25株是国内第一个测出全基因序列的猪戊型肝炎病毒。     

萨能奶山羊乳腺组织5-HTR2基因的克隆与序列分析

以容易获取并具代表性的乳腺组织——奶山羊乳腺为载体,进行哺乳动物乳腺组织中5-HTR2基因的克隆,为下一步研究奶牛乳腺组织中5-HTR基因的分布及生物学特性提供理论基础.根据GenBank其他物种5- HT受体- 2(5 - HTR2)基因序列的同源序列,对奶山羊5-HTR2基因设计1对克隆引物,从奶山羊乳腺组织提取总...     

犬瘟热病毒扬州分离株融合蛋白F和附着蛋白H基因的序列分析

根据Genbank犬瘟热病毒(CDV)毒株序列分别设计融合蛋白F和附着蛋白H全基因的2对引物,以2个CDV扬州分离株(CDV-YZ0101、CDV-YZ0102)为模板RT-PCR扩增出H基因和F基因2个片段,将其克隆进pGEM-Teasy载体,并进行序列分析.结果表明H基因的开放阅读框架(ORF)为1 824 bp,2种分离株间核苷酸和编码氨基酸同源性达98%左右,与中国长春分离株、美国、日本分离株的同源性分别为96%、93%～95%和90%～91%.氨基酸分析显示扬州分离株与其他分离株的H蛋白有8～9个可能的天冬酰胺糖基化位点,而OP-CDV疫苗株只有4个类似位点.扬州分离株与长春分离株同属一个系,与美国、日本分离毒株以及疫苗株相比,均存在着明显的差异.F基因ORF为1 989 bp,不同毒株间的核苷酸及编码氨基酸差异主要表现在信号肽区域,而编码的F0前体蛋白表现出较高同源性(97%～99%),且所有的13个半胱氨酸残基、4个可能的天冬氨酰糖基化位点和2个疏水区域均完全一致.因此CDV F与H蛋白基因相比有很高的同源性,证明中国分离株与国外参考株有差异.     

鸭疫里默氏杆菌中国分离株的外膜蛋白A基因的克隆与序列分析

为了对鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)中国分离株的外膜蛋白A(OmpA)基因的序列进行分析,根据GenBank中已发表的鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)的外膜蛋白A(Om-pA)基因序列,在其高度保守区设计一对特异性引物,应用PCR技术,分别扩增从中国广东、福建和山东等地分离的8株鸭疫里默氏杆菌中国分离株的OmpA基因,克隆测序后与GenBank中已发表的26株鸭疫里默氏杆菌进行序列比较,结果表明:所有菌株的OmpA基因均为由1164个碱基组成的ORF,编码387个氨基酸组成的蛋白质,起始密码子均为ATG,终止密码子均为TAA,其核苷酸序列非常保守,同源性高达88.2%~100%,氨基酸同源性达到88.9%~100%。试验表明,OmpA基因具有种内相对保守性,其核苷酸与氨基酸同源性与鸭疫里默氏杆菌的血清型、分离时间和地点之间无必然联系。     

水稻盐胁迫相关基因sos5的克隆与序列分析

采用RT-PCR扩增的方法,从水稻(Oryza sativa)中克隆获得了1 574 bp的cDNA片段。基因测序和序列同源性分析结果表明,所克隆的基因片段包含1 284 bp的开放阅读框,编码一个含有427个氨基酸的多肽,该蛋白与拟南芥SOS 5蛋白同源性达45.6%,与小麦同源性达71%。     

高粱红条病病原的分子鉴定

从山西高粱红条病病叶中得到一种病毒分离物,命名为GL-SX.根据甘蔗花叶病毒亚组(SCMV subgroup)外壳蛋白(CP)基因C-端和复制酶(NIb)基因C-端的保守序列设计引物,对GL-SX进行免疫捕获反转录PCR (IC-RT-PCR) 扩增,获得一条长约1.1 kb的扩增片段,扩增片段克隆后测定序列,该序列含1087个核苷酸(nt),编码362氨基酸(aa),取其中的近全长CP氨基酸序列(296 aa)与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)、玉米矮花叶病毒 (Maize dwarf mosaic virus, MDMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus, SrMV)和约翰逊草花叶病毒(Johnsongrass mosaic virus, JGMV) 等4种病毒的对应序列进行同源性比较,结果与SCMV的同源性最高(95.3%),而与SrMV、MDMV和JGMV等3种病毒的同源性相对较低,依次为69.3%、69.1%和55.4%.根据Potyvirus属病毒种类划分的标准,将GL-SX鉴定为SCMV.将GL-SX的近全长CP氨基酸序列与SCMV种内各分离物的对应序列进行同源性比较及构建关系树,结果显示GL-SX与SCMV-MDB具有较远缘的种内亲缘关系,而与德国的一个SCMV玉米分离物(SCVM-Hoe)及中国的两个玉米分离物(SCMV-ZJ和SCMV-BJ)具有很高的同源性.     

Characterization of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Deletion Mutant

The genome of the isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） from China, designated HPBEDV, was sequenced and analyzed. The size of the genome of HPBEDV was 15 334 nucleotides （nt）. Comparative analysis of HPBEDV with the genomic sequences of the domestic and other isolates （JXA 1, HUN4, CH-1 a, B J-4, VR2332, and LV） revealed that HPBEDV shared 98.4, 98.0, 89.0, 88.7, and 88.6% identity with the American strain JXA1, HUN4, CH- 1a, BJ-4, and VR2332, respectively, but only 54.7% identity with the European reference strain Lelystad virus. The NSP2 gene had 2 850 nt and encoded 950 amino acids （aa）, with two discontiguous deletions of 1 aa and 29 aa at positions 482 and 534-562, respectively, relative to VR-2332. Also, phylogenetic analysis with the published PRRSV genomic sequences indicated that the newly emerging isolate form a clade with the VR-2332 isolates. Therefore, HPBEDV was a novel strain with deletions in NSP2 gene.     

甘薯羽状斑驳病毒O株系和RC株系中国分离物全基因组 序列分析及其遗传特征

【目的】对甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）O株系中国分离物（SPFMV-O-Ch1）和RC株系中国分离物（SPFMV-RC-Ch1）的基因组全序列进行克隆,明确SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的基因组结构特征及其遗传变异情况,为研究甘薯羽状斑驳病毒的致病机制打下基础。【方法】根据GenBank中登录的SPFMV基因组全序列设计2对简并引物和3对特异性引物,利用RT-PCR方法,从感染SPFMV的甘薯叶片中扩增SPFMV O株系和RC株系中国分离物的基因组全长序列,将目的片段分别克隆到pMD19-T载体上,经序列测定、分析和拼接,获得SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1的全序列,利用DNAMAN和MEGA7对SPFMV基因组全序列及不同编码区序列进行遗传变异和系统进化树分析,利用RDP软件分析SPFMV基因组重组情况。【结果】经序列测定和拼接,结果表明SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1基因组分别包含10 922和10 851 nt,均包含一个开放阅读框,分别由10 557和10 482 nt组成,编码一个多聚蛋白,分别由3 518和3 493个氨基酸残基组成。两个分离物均在P1蛋白内编码一个P1N-PISPO蛋白,在P3蛋白内编码一个P3N-PIPO蛋白。基因组全序列核苷酸一致性分析表明,SPFMV-O-Ch1与SPFMV-RC-Ch1的一致性为87.3%,与GenBank登录的其他分离物基因组全序列一致性为86.0%—95.8%,与Ruk73分离物的一致性最高,为95.8%,与11-1分离物的一致性最低,为86.0%。SPFMV-RC-Ch1与GenBank登录的其他分离物基因组全序列一致性为85.9%—98.7%,与IS90分离物的一致性最高,为98.7%,与Aus1-2B分离物的一致性最低,为85.9%。基于多聚蛋白基因核苷酸序列的遗传进化树分析表明,SPFMV-O-Ch1与Ordinary、10-O和17-O等O株系的分离物形成一个分支,SPFMV-RC-Ch1与S、IS90和CW137等RC株系的分离物形成一个分支。重组分析结果表明,O-Ch1分离物中发现3个重组事件,分别发生在7 731—9 710、135—10 012和4 825—6 948 nt,RC-Ch1没有发现重组事件。【结论】我国的SPFMV-O-Ch1和SPFMV-RC-Ch1分离物的基因组结构与其他分离物相同,O-Ch1与O株系分离物一致性较高,RC-Ch1与RC株系分离物一致性较高,O-Ch1分离物检测到3个重组事件,RC-Ch1未发现重组事件。     

水稻盐胁迫相关基因sos 5的克隆与序列分析

采用RT-PCR扩增的方法,从水稻(Oryza sativa)中克隆获得了1 574 bp的cDNA片段.基因测序和序列同源性分析结果表明,所克隆的基因片段包含1 284 bp的开放阅读框,编码一个含有427个氨基酸的多肽,该蛋白与拟南芥SOS 5蛋白同源性达45.6%,与小麦同源性达71%.