五株鸡传染性支气管炎病毒流行株的分离鉴定

2012年1月-2014年8月,从全国多地出现传染性支气管炎发病养鸡场(户)中采集病(死)鸡气管、肾脏和腺胃进行流行病学调查。根据各地分离株与YB160株S1基因分子进化树分析,筛选出5个代表性的毒株,在SPF鸡胚中传至第5代,分别进行毒价测定、无菌检验及对SPF鸡的致病力研究。结果,所筛选出的5个流行株在SPF鸡胚传至第5代时,毒价均大于或等于106.1EID50/0.1 m L,菌检阴性,人工感染试验接种1日龄SPF鸡,可引起试验鸡出现典型传染性支气管炎症状。     

2012—2014年我国鸡传染性支气管炎分子流行病学调查

为了解近年来我国鸡传染性支气管炎病毒的主要类型,2012—2014年,从华东、华北和华中等地区出现传染性支气管炎（IB）的养鸡场中,采集病料进行病毒分离。从中分离鉴定出IBV流行株69株。对所有分离株进行S1基因扩增、测序和遗传进化分析。结果显示毒株共包含6个基因型,根据各基因型中包含的毒株数量多少依次为：QX型（54株,占78.26%）、Mass型（6株,占8.7%）、4/91型（3株,占4.35%）、TW-I型（2株,占2.90%）、tl/CH/LDT3/03型（2株,占2.90%）和CK/CH/LSC/99I型（2株,占2.90%）。将GenBank中收录的所有2012—2014年间国内分离株S1基因序列下载并构建遗传进化树,结果表明QX型IBV已成为当前国内流行的绝对优势基因型。     

绵羊痘病毒新疆株的分离及结构蛋白P32基因序列分析

[目的]对绵羊痘病毒当地流行毒株的分离和其结构蛋白P32基因的克隆和序列进行分析,明确引起新疆本地绵羊流行痘病的病毒种类,掌握当前流行毒株的变异情况,为绵羊痘的预防控制及将来研制高效安全疫苗提供科学依据.[方法]将两例疑似患有羊痘的绵羊肺脏组织病料接种于MDBK细胞进行病毒分离,细胞病变组织经处理后通过电子显微镜观察分离病毒.以分离病毒基因组DNA为模板,通过PCR扩增绵羊痘病毒结构蛋白P32基因,并对目的基因进行克隆和基因序列和蛋白生物信息学分析.[结果]两例病料组织接种MDBK细胞后均产生明显的细胞病变,电子显微镜观察可见到约200 nm大小、椭圆形有囊膜的典型痘病毒粒子.对两株病毒表面膜结构蛋白P32基因PCR扩增均可获得与预期大小一致的约972 bp片段,氨基酸序列分析表明分离毒株SPV/Miquang/2013和SPV/Kuche/2013病毒P32基因与绵羊痘病毒参考株同源性分别达96.9;～99.4;和97.5;～100;,生物信息学分析发现SPV/Miquang/2013株P32蛋白有两个关键氨基酸位点发生变异,即第78位谷氨酸突变为赖氨酸,第293位异亮氨酸突变为苏氨酸.[结论]从疑似病例中分离到两株病毒,通过电镜观察及P32基因扩增测序,与其他羊痘病毒比对后鉴定分离毒株为绵羊痘病毒,分别命名为SPV/Miquan/2013和SPV/Kuche/2013.SPV/Miquan/2013的P32蛋白同其他绵羊痘病毒的两个氨基酸位点发生明显突变.     

1株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及生物学特性研究

为跟踪传染性支气管炎病流行情况,2015年我们从在江苏某养鸡场疑似传染性支气管炎发病鸡群采集分离到1株疑似传染性支气管炎病毒,对其进行了鉴定和生物学特性研究。结果在鸡胚上连传6代出现鸡胚典型病变,死亡鸡胚全身出血明显,未死鸡胚发育受阻,呈明显的侏儒胚、蜷缩。分离株S1基因RT-PCR扩增可见到清晰的1. 7 kb左右大小的条带,与引物设计的预期结果相符,与Gen Bank中的IBV序列进行比对和分析,从进化树看,分离株属于IBV当前主要流行的QX型。电镜下观察可见直径为80～120 nm,有囊膜和纤突的冠状病毒粒子;经卵磷脂酶C处理后能凝集鸡红细胞,并能特异性地被该分离株的高免血清所抑制;对热、酸碱、胰酶有一定耐受性,对脂溶剂敏感,符合鸡传染性支气管关病毒(IBV)有囊膜的特性;该分离株的最小致病量为102. 0EID50。该毒株灭活苗0. 25 m L/只免疫即可达到良好的免疫效果。以上结果表明,该分离株符合鸡传染性支气管炎病毒的特性。     

1群4型禽腺病毒的分离鉴定及Fiber-2蛋白的免疫效果分析

旨在鉴定河南某蛋鸡场以心包积液、肝肿大出血为特征的病原,并对病原的免疫原性蛋白进行表达和效果分析。本研究采用病毒分离、血清学试验、PCR检测及测序分析、动物回归试验、大肠杆菌表达、蛋白纯化、攻毒保护等方法进行研究。结果显示,所采集样品经卵黄囊途径接种7日龄SPF鸡胚,盲传2代后获得病毒;PCR可扩增出约900 bp的Hexon基因片段,经测序,其Hexon基因与血清C4型毒株的相似性为100%;血清中和试验结果表明分离的禽腺病毒为1群血清4型禽腺病毒,命名为HN-ZK株。该毒株可在鸡胚原代肝细胞上产生CPE,病毒含量可达10^7.5TCID₅₀·0.1 mL^-1。动物回归试验表明,该分离毒株可使35日龄SPF鸡100%（10/10）表现出发病症状。以分离株的DNA为模板,利用大肠杆菌原核表达系统,获得相对分子质量约为33 ku的Fiber-2蛋白,离心浓缩、纯化后蛋白含量为300 mg·mL^-1。将表达的Fiber-2蛋白用不同的剂量免疫SPF鸡,结果表明20 μg·只^-1的剂量能使鸡完全抵抗强毒株的攻击,说明Fiber-2蛋白具有较好的免疫原性。本研究可为禽心包积水-肝炎综合征的诊断和基因工程亚单位疫苗的研制提供数据参考。