发根农杆菌侵染大豆产生发根的研究

利用A4发根农杆菌,对不同大豆品种的无菌苗采用针刺的方法对子叶节部位进行接种,诱导毛状根产生,测定毛状根中大豆苷元的含量。结果表明,以合丰35为受体材料,毛状根诱导率最高,为58%,明显高于其他处理。发根中大豆苷元的含量是正常无菌苗和大田幼苗根中含量的2倍。     

不同光照条件下大豆幼苗和不同外植体获得愈伤组织中大豆苷元及染料木素的含量

通过对大豆幼苗光照培养和大豆不同外植体的组织培养,测定不同培养条件下大豆幼苗不同部位及不同外植体培养得到的愈伤组织中大豆苷元和染料木素的含量。结果表明：大豆幼苗光照培养30d时根中大豆苷元及染料木素含量分别是相应培养时间无光照条件根中的3.69倍和3.59倍;在光照培养30d真叶中大豆苷元和染料木素的含量也较高,仅次于根,是相同培养时间无光照条件真叶中大豆苷元和染料木素的含量的2倍。不同外植体培养得到的愈伤组织中,真叶培养得到愈伤组织培养60d时大豆苷元及染料木素的含量最高。正常光照条件下的大豆幼苗,其不同部位大豆苷元及染料木素含量高于对应部位得到的愈伤组织中大豆苷元及染料木素的含量。经过90d组织培养,真叶获得的愈伤组织中大豆苷元、染料木素的总含量较最初的外植体中的总含量分别增加了162.53倍和111.71倍。结合不同外植体诱导出的愈伤组织的重量增长情况。在愈伤组织培养90d时,根、子叶节、子叶作为外植体进行愈伤组织培养,生产大豆苷元及染料木素的效果最好。     

不同耐草甘膦转基因大豆对根际土壤固氮细菌多样性的影响

采用盆栽试验结合DGGE-cloning测序技术比较分析了耐草甘膦转基因大豆M88、GTS40-3-2、ZB及常规非转基因大豆中黄13在成熟期对根际土壤固氮细菌多样性的影响。结果表明,耐草甘膦转基因大豆M88、GTS40-3-2和非转基因大豆中黄13根际土壤固氮细菌多样性指数和均匀度指数无显著差异;抗虫耐草甘膦转基因大豆ZB根际土壤固氮细菌多样性指数显著高于非转基因大豆中黄13,均匀度指数无显著差异。克隆测序结果表明,4种大豆根际土壤固氮细菌主要隶属于α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲、蓝藻纲和一些未知细菌类。相对于不同大豆品种对固氮细菌多样性的影响,耐草甘膦CP4 epsps基因的导入并没有对根际土壤固氮细菌多样性产生显著影响。     

发根农杆菌K599转化大豆绥农28的研究

以大豆绥农28为材料,用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)K599浸染转化后诱导产生发根,通过β-葡聚糖苷酶(GUS)染色进行效率检测,确定毛状根转化的最佳条件。结果表明绥农28大豆品种发根诱导高效转化的条件如下:在1/2MSB5+20g/L蔗糖+琼脂7g/L,p H5.8萌发培养基上萌发5~6d的大豆子叶节为外植体,当菌液侵染时间为20min,共培养基p H5.4的条件时,发根转化率为58.57%。     

花生毛状根诱导及其体外培养

[目的]优化花生毛状根诱导条件,为体外培养毛状根生产白藜芦醇以及培养花生根结线虫奠定基础。[方法]研究不同的发根农杆菌及其菌液浓度、外植体类型、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度对花生毛状根诱导的影响。[结果]发根农杆菌ACCC10060的毛状根诱导率高于ATCC11325;幼叶外植体的毛状根诱导率高于子叶;最佳侵染菌液浓度为0.2～0.4;最佳共培养时间为2 d;最佳侵染时间为10～15 min;菌液中添加75μmol/L乙酰丁香酮(AS)可以提高毛状根诱导率。通过毛状根能在无激素的MS培养上自主生长以及毛状根冠瘿碱检测,确定发根农杆菌中Ri质粒中已整合到花生基因组中。毛状根体外培养的研究表明,液体培养效果好于固体培养,最佳液体培养基为无激素的MS培养基。[结论]该研究建立的花生毛状根培养体系,将为花生转基因技术的完善及利用毛状根生产白藜芦醇和无菌的花生根结线虫提供试验基础。     

大豆GmbZIP16的抗旱功能验证及分析

【目的】通过分析干旱条件下大豆的转录组数据,筛选获得大豆锌指蛋白GmbZIP16,对其进行功能验证,确定GmbZIP16参与大豆抵抗干旱的分子机理。【方法】大豆干旱转录组数据分析得到上调倍数较高的锌指蛋白GmbZIP16,以大豆cDNA为模板克隆获得GmbZIP16。并通过In-Fusion连接酶技术,构建pCAMBIA1302- GmbZIP16和pCAMBIA3301-GmbZIP16表达载体。通过液氮冷冻法将重组载体pCAMBIA1302- GmbZIP16和pCAMBIA3301-GmbZIP16分别转入农杆菌GV3101和大豆发根农杆菌K599的感受态细胞中,通过农杆菌侵染拟南芥花序以及大豆子叶节技术,产生过表达拟南芥植株以及过表达大豆毛状根复合体植株。通过半定量RT-PCR和qRT-PCR分析,确定GmbZIP16在转基因拟南芥和大豆毛状根中能够超表达。分别将正常条件下生长2周龄的转基因和野生型拟南芥植株转移至含有不同PEG浓度（6% PEG和8% PEG）的MS0培养基上继续培养7 d,观察转基因拟南芥和对照野生型拟南芥之间的生物量差异;利用qRT-PCR分析转基因拟南芥和野生型拟南芥植物体中胁迫相关的基因表达情况。将生长良好的转GmbZIP16大豆毛状根复合体施加25% PEG处理1周后,分别采取转GmbZIP16大豆毛状根复合体和转空载体大豆毛状根复合体的叶片,用酶标仪测定植株的脯氨酸、丙二醛和叶绿素的含量。【结果】通过PCR技术扩增得到正确的GmbZIP16序列,通过农杆菌转化技术得到2个稳定过表达的转GmbZIP16拟南芥株系。通过对转基因拟南芥的表型鉴定发现转基因拟南芥在干旱处理下的生物量（鲜重和根长）及存活率比野生型显著提高。在过表达GmbZIP16拟南芥植株中,一些与胁迫相关的基因的表达要高于在野生型,如RD29B、DREB2A和P5CS。转GmbZIP16大豆毛状根复合体植株在25% PEG处理1周后,大豆毛状根复合体叶片中叶绿素和脯氨酸的含量要显著高于转空载体大豆毛状根复合体叶片中叶绿素和脯氨酸的含量,而转GmbZIP16大豆毛状根复合体叶片中丙二醛的含量显著低于转空载体大豆毛状根复合体叶片中丙二醛的含量。【结论】在拟南芥中过表达大豆GmbZIP16提高了转基因拟南芥的抗旱性。过表达GmbZIP16可以提高转基因大豆毛状根复合体对干旱的抗性。GmbZIP16提高植物的抗旱性主要是通过影响与抗逆相关基因的表达来实现的。     

山西不同大豆品种再生体系的筛选

为探究品种对大豆再生体系的影响,试验选取山西省选育的10个大豆品种,对其子叶节再生体系和胚尖再生体系中不定芽诱导率、伸长率、生根率及再生苗成活率进行了研究。结果表明,在子叶节再生体系中,晋豆37号与中黄13号的各个参数值较其他品种高,且差异显著;而在胚尖再生体系中,晋豆36号各参数值均较高。同一大豆品种在不同的再生体系中表现也不同。邯豆5号、晋豆19号、晋豆36号在子叶节再生体系中的4个指标值均明显低于在胚尖再生体系中,而中黄13号与晋豆37号在子叶节再生体系中的各项数值均比在胚尖再生体系中高。初步认为,品种与大豆的再生能力有关,其中,邯豆5号、晋豆19号、晋豆36号较适合胚尖再生体系的研究,中黄13号与晋豆37号较适合子叶节再生体系的研究。这些结果可为进一步进行大豆遗传转化提供较好的受体材料作参考。     

发根农杆菌介导的杨梅遗传转化研究初报

为了建立发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes介导的杨梅Myrica rubra遗传转化体系,利用携带拟南芥Arabidopsis thaliana LEAFYcDNA片段的发根农杆菌R15834感染东魁杨梅M. rubra‘Dongkui’和荸荠杨梅M. rubra‘Boji’的子叶、叶片和茎段。结果表明,只从东魁杨梅子叶上诱导出毛状根,而且产生毛状根的东魁杨梅子叶数在10%以下。杨梅子叶产生毛状根受多种因素影响,新种子比旧种子容易产生毛状根,在1/2 MS(Murashige and Skoog)培养基培养较在MS培养基上培养好。东魁杨梅子叶上的毛状根经聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测和Southern杂交检测,证实已将拟南芥的LEAFYcDNA片段成功导入并整合到东魁杨梅子叶中。图2参10     

黑暗对大豆锈病菌侵染影响的研究

黑暗时长是影响大豆锈病侵染的重要因素之一,为了明确其影响的作用大小,我们应用大豆离体叶片培养技术,在24±1℃、相对湿度饱和的人工控制条件下试验,结果表明:黑暗培养8～16小时,有利于大豆锈病的侵染,延长或缩短黑暗培养时长,均不利于大豆锈病菌的侵染.     

光照条件和共培养时间对大豆的遗传转化效率影响研究

选取不同大豆基因型的胚尖、子叶节和下胚轴为受体材料,运用农杆菌介导法转化GUS基因,通过对GUS基因瞬时表达率的比较,探讨大豆遗传转化的主要影响因素(光照条件和共培养时间等),以寻找适宜农杆菌和外植体的平衡点,并进一步对遗传转化条件进行优化。结果表明:提供10~16h·d-1光照均提高了转化效率,与完全黑暗差异显著;延长共培养时间,显著提高转化效率,以7~10d为宜。该结果对提高大豆的遗传转化效率有重要参考价值。