建立PC-PCR法快速、半定量检测养殖环境和水产动物中的致病性副溶血弧菌

以tl为靶基因,将菌落PCR技术和平板菌落计数法相结合,建立致病性副溶血弧菌快速、半定量检测方法。PCR扩增的目的片段为673 bp,人工污染样品检测最低限固体样品为3.1×102cfu/g,液体样品为1.3×102cfu/mL,菌落PCR每反应体系的检测低限为90 cfu。对人工污染样品的检测结果显示,PC-PCR方法检测结果与常规检测结果一致,可用于养殖环境及水产品中细菌的动态监测。     

扩增内标在副溶血弧菌多重PCR检测方法中的应用

建立扩增内标存在下同时检测副溶血弧菌tlh基因和trh基因的多重PCR方法。以细菌16SrDNA片段为扩增内标对照(internal amplification control,IAC),副溶血弧菌不耐热溶血毒素(thermolabile hemolysin,TLH)基因tlh和相对耐热直接溶血毒素(thermostable related hemolysin,TRH)基因trh为检测基因,设计引物,并优化多重PCR体系。特异性及灵敏度试验结果表明:该多重PCR体系检测致病性副溶血弧菌表现出极好的特异性。纯培养条件下,扩增内标存在时tlh基因和致病基因trh的检测灵敏度分别为1.3×102 cfu.mL-1和1.3×103 cfu.mL-1;人工污染牡蛎样品,不经富集培养,扩增内标存在时tlh基因和致病基因trh的检测灵敏度分别为2.6×103 cfu.mL-1和2.6×104 cfu.mL-1;经过6h的富集培养,tlh基因和trh基因的检测限均能达到2.6×102 cfu.mL-1。该检测体系特异性强、灵敏度高,并且扩增内标的存在可排除PCR检测致病性副溶血弧菌可能导致的假阴性结果,可提高检测的速度和精准度。     

食品中4种致病微生物的多重PCR快速检测技术研究

传统微生物检测方法耗时长、灵敏性差,难以满足食品安全快速检测要求,建立和完善食品中致病微生物快速检测技术具有重要的现实意义.本研究针对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌,根据其特异基因设计出4对引物,通过对食品样品进行梯度离心处理、改良异硫氰酸胍法提取基因组DNA和多重PCR(multiplex PCR)条件的优化,建立了这4种食源性致病微生物的多重PCR检测方法.通过人工污染检测和市场样品检测,同时进行传统方法验证,结果表明:该检测方法简单、快速、准确、灵敏度高,只需经过增菌4～8 h其最低检出限可达1 cfu/mL,具有较强的实际应用价值,可广泛应用于食品卫生检测和临床检验等领域.     

应用Taqman荧光定量PCR快速检测宠物食品中的沙门氏菌

[目的]建立快速检测宠物食品中沙门氏菌(Salmonella)的荧光定量PCR方法。[方法]根据Genbank中登录的沙门氏菌吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白invA基因序列设计合成引物和探针,检测该方法的特异性和敏感性。[结果]该方法具有良好的特异性,对沙门氏菌的检测灵敏度可达到17 CFU/反应(25μl/反应)。应用该方法检测人工污染宠物食品,样品经18 h增菌后,结果均为阳性。[结论]该研究建立的Taqman荧光定量PCR方法可以快速、准确地检测宠物食品中的沙门氏菌。     

食品中4种致病微生物的多重PCR快速检测技术研究

传统微生物检测方法耗时长、灵敏性差,难以满足食品安全快速检测要求,建立和完善食品中致病微生物快速检测技术具有重要的现实意义。本研究针对沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌,根据其特异基因设计出4对引物,通过对食品样品进行梯度离心处理、改良异硫氰酸胍法提取基因组DNA和多重PCR（multiplex　PCR）条件的优化,建立了这4种食源性致病微生物的多重PCR检测方法。通过人工污染检测和市场样品检测,同时进行传统方法验证,结果表明：该检测方法简单、快速、准确、灵敏度高,只需经过增茵4～8h其最低检出限可达1cfu／mL,具有较强的实际应用价值,可广泛应用于食品卫生检测和临床检验等领域。     

检测鸡蛋中沙门氏菌的LAMP方法的建立及初步应用

根据GenBank上公布的沙门氏菌invA基因序列中的保守区域,设计一套环介导等温扩增(LAMP)引物,将其用于沙门氏菌的检测,结果成功地扩增出特异性的梯形条带。LAMP方法检测沙门氏菌纯培养的灵敏度为1.04×102 cfu.mL-1,对11株不同细菌进行LAMP检测,仅沙门氏菌获得阳性结果。应用该方法对扬州市场上销售的鸡蛋进行沙门氏菌检测,检测结果与传统培养方法相符合。因此,LAMP方法检测沙门氏菌具有灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便等特点,有望发展成为快速检测鸡蛋中沙门氏菌的有效手段。     

免疫磁珠捕获-PCR检测牛乳中沙门氏菌的研究

实验建立了沙门氏菌的磁捕获-PCR检测方法。筛选了最佳包被液和最适包被条件,用于制备包被有抗沙门氏菌抗体的磁珠。用制备的免疫磁珠捕获样品中的沙门氏菌,用于PCR检测。此方法操作简便,用时短,检出率高。用所建立的免疫磁珠捕获-PCR技术检测牛乳中的沙门氏菌,检测灵敏度为9cfu/mL,所用时间为7h(包括前增菌时间)。     

定量PCR快速检测动物食品中沙门菌污染

沙门氏菌是动物性食品中的重要食源性致病菌,建立其快速检测方法对动物性食品的质量控制具有重要作用.根据沙门氏菌16srDNA、dT fermentation等基因或DNA功能区序列设计PCR引物,通过比较3种不同的基因组DNA提取方法,提取待检样品总DNA,进行多基因定量PCR检测.结果表明,该方法简单快速且灵敏度高,在动物食品中的检测灵敏度可达10 cfu/g,整个检测时间在10h以内.说明该方法对检测动物中沙门氏菌具有特异性高且灵敏、快速等特点,适用于快速、准确地检测动物中沙门氏菌的需要.     

食品中克罗诺杆菌(原阪崎肠杆菌)双重PCR检测方法研究

根据克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)16S rRNA基因以及局部大分子合成(MMS)操纵子特异序列设计2对引物,经反应体系和条件优化,建立了双重PCR检测方法。特异性检测结果显示,Cronobacter spp.菌株PCR扩增均可见2条特异性条带,而其他菌株PCR扩增均为阴性。纯菌检测双重PCR的灵敏度为6.3×103 CFU.mL-1,而相对应单重PCR的灵敏度分别为6.3×101 CFU.mL-1和6.3×103 CFU.mL-1;人工污染的食品样品(奶粉、牛奶、鸡肉)在经过24 h增菌后,检测限均可达100 CFU.mL-1或100 CFU.g-1。在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)存在的条件下,双重PCR的检测限没有受到影响。表明本试验建立的双重PCR检测方法具有很好的特异性和灵敏度,能克服食品样品基质及杂菌的干扰,可应用于食品中Cronobacter spp.的检测。     

牛奶中活沙门氏菌BCAC-EMA-Rti-LAMP快速检测方法的研究

研究以沙门氏菌的invA基因序列设计特异性引物,结合蒙脱石封闭的活性炭(BCAC)吸附、叠氮溴化乙锭(EMA)前处理牛奶样品,建立了一种基于实时荧光环介导等温扩增法(Rti-LAMP)非预增菌快速检测牛奶中低浓度活沙门氏菌的方法。以每份25 mL牛奶样品,人工模拟不同浓度沙门氏菌污染,用4.0 g蒙脱石封闭的活性炭吸附处理样品,然后对回收精制的细菌样品用4.0μg/mL EMA终浓度作用处理,提取细菌样品DNA用于RtiLAMP扩增检测,该方法检测灵敏度为1×10~1CFU/mL活沙门氏菌,整个检测过程约5 h。以沙门氏菌国标检测法为参照,采用BCAC-EMA-Rti-LAMP检测生鲜牛奶样品27份,结果显示:2种方法均检测到同一份沙门氏菌阳性牛奶样品,而BCAC-EMA-Rti-LAMP另检测到3份牛奶样品沙门氏菌阳性。研究表明,建立的BCAC-EMARti-LAMP检测方法较国标检测法更灵敏、快速,可用于牛奶沙门氏菌污染的快速检测。