植物磷脂酶D对环境胁迫的响应和传导信号的功能

磷脂酶D(PLD)是一种分解磷脂的多功能酶。文章介绍了PLD的生化特性及其在信号转导中的作用,概述了PLD的调控机制及在机械损伤、低温、高渗透压、激素和微生物等环境胁迫下的响应。     

逆境胁迫下植物磷脂酶D的生理功能和作用机制综述

磷脂酶D(phospholipase D,简称PLD)是一类重要的跨膜信号转导酶类,主要存在于植物中,PLD参与的磷脂降解在植物逆境胁迫过程中起重要作用。本文主要阐述了PLD在病原微生物、干旱与机械损伤和低温等生物及非生物胁迫下的响应机制,探讨了PLD在植物逆境胁迫反应中的作用与机制,并对PLD在植物研究中的应用前景进行了展望。     

桃果实磷脂酶Dα基因的电子克隆及序列分析

 【目的】克隆桃果实中的磷脂酶Dα基因,并对其进行序列分析和低温表达模式分析。【方法】采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法分离桃果实PLDα 基因cDNA全长序列;半定量RT-PCR和Northern杂交检测目的基因在桃果实低温贮藏过程中的表达情况。【结果】成功获得全长为2 859 bp的桃果实PLDα基因序列,该序列具有完整的开放阅读框架（ORF,172～2 604 bp）,编码810个氨基酸。对ORF进行的RT-PCR验证结果与电子克隆序列一致。序列分析显示,桃果实PLDα基因编码的氨基酸序列与草莓、番茄、葡萄等物种的磷脂酶Dα氨基酸序列之间具有高度的保守性,含有N端C2结构域及两个保守的活性中心。半定量RT-PCR和Northern杂交分析显示,桃PLDα基因在低温贮藏过程中被诱导表达。【结论】本研究首次通过电子克隆的方法获得了桃果实PLDα基因的全长序列,揭示了其序列特征,并初步明确了其在桃低温贮藏期间的表达模式。结果证明基于EST数据库的电子克隆已经是获取植物新基因的有效途径,同时为更深入研究桃果实的耐冷性及低温贮藏方法奠定了基础。     

蟠桃磷脂酶D基因RNAi表达载体构建

[目的]构建蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体.[方法]以英格尔蟠桃为材料,将CTAB改良法提取的蟠桃总RNA反转录成cDNA作为模板,通过RT - PCR扩增约347 bp的保守片段,将目标片段插入到pSK - int中间表达载体中,获得pSK - PLD - RNAi中间表达载体,然后将其转入植物双元表达载体pCAMBI1301中,构建该基因的shRNAi表达载体pCAMBIA - PLD - RNAi.[结果]经限制性内切酶酶切和测序鉴定证明蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体pCAMBIA - PLD - RNAi已构建成功.[结论]蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表达载体的构建为进一步通过RNAi技术延长蟠桃果实的贮藏寿命奠定了基础.     

陆地棉GhPLDα基因的克隆、序列分析及表达

[目的]棉花磷脂酶D(GhPLDα)基因的克隆、序列功能结构域分析及表达.[方法]以陆地棉胚珠和纤维为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到PLDα基因的cDNA片段,将其构建到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行体外诱导表达,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达,利用分光光度法检测酶活性,采取RT-PCR方法检测基因表达.[结果]从发育的棉花胚珠和纤维混合材料中克隆得到的磷脂酶基因的开放读码框为2 421 bp,编码包含807个氨基酸的蛋白质,分子量约为88 kDa.通过同源序列比对和功能结构域分析,GhPLDα具有典型的磷脂酶D家族(HKD)结构域,同时还存在蛋白激酶C结构域2(C2结构域).构建了pET28a-GhPLDα原核表达载体;获得分子量约为88 kDa左右的重组蛋白GhPLDα.半定量RT-PCR结果表明GhPLDα基因可能参与棉花胚珠与纤维发育过程.[结论]GhPLDα基因的克隆、序列分析和表达为进一步研究棉花GhPLDα基因在胚珠和纤维发育中过程的功能奠定了基础.     

草莓PLDα基因cDNA克隆及反义植物表达载体构建

【目的】获得草莓磷脂酶Dα(PLDα)的HKD2功能区基因序列构建反义植物表达载体。研究PLDα基因对草莓果实耐贮性的影响。【方法】以草莓完熟果实为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到PLDα基因的cDNA片段,将其T-A克隆至pMD19-T simple vector上,测序正确后克隆载体经双酶切消化,目的片断反向插入到植物表达载体pBI121中。【结果】构建草莓PLDα基因的反义植物表达载体pBI121-PLD。【结论】通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导入根癌农杆菌LBA44404,为进一步通过反义技术延长草莓果实贮藏的寿命奠定了基础。     

冬小麦PLD对低温胁迫刺激的响应研究

在冬小麦生长的幼苗期,应用人工霜箱研究了低温胁迫刺激对PLD(phospholipase D.PLD)活性变化的影响.结果表明,在种子萌发及幼苗生长阶段,PLD在生长旺盛的叶片组织中活性最高;响应于低温胁迫刺激,PLD在数分钟内被迅速激活,抗寒型品种与低温敏感型品种中PLD的活性变化规律存在差异,推测PLD参与低温信号传导途径.     

桃果实PLDα基因的表达及生物信息学分析

磷脂酶D(PLD)能催化磷酸二酯键水解和碱基交换,其水解产物磷脂酸可以作为第二信使,参与植物信号转导过程。几乎在植物所有的生命阶段及对环境胁迫的应答中,PLD都起着重要的作用。本试验借助分子生物学手段,在体外构建了p ET30a-PLDα重组表达载体,并成功地在表达菌株Transetta(DE3)中进行表达。研究发现PLDα蛋白氨基酸序列存在2个HKD基序,两基序间隔320个氨基酸,亲水性平衡系数为-0.417,表明PLDα蛋白为疏水性蛋白。系统进化树构建结果显示,桃果实PLDα蛋白与草莓PLDα蛋白二者亲缘关系最近;三维结构模拟存在的"洞穴"结构可以很好地解释该蛋白的疏水性。实时荧光定量PCR结果表明,低温能提高PLDα基因m RNA基因表达水平。     

木薯赤霉素途径DELLA蛋白基因克隆及其对干旱胁迫的响应

赤霉素(GA)信号转导途径是通过DELLA抑制蛋白来调控的.笔者利用拟南芥DELLA蛋白基因序列,通过电子克隆方法首次克隆了1个木薯DELLA蛋白基因,长度为1 857 bp,具有完整的蛋白编码框的cDNA序列,命名为MeGAI.生物信息学分析显示,该蛋白具有与拟南芥DELLA蛋白一样的保守结构域,如DELLA结构域、VHYNP结构域、POLY(S/T)结构域、核定位信号、VHVID结构域、亮氨酸结构域、GRAS结构域;该基因在干旱胁迫下的表达模式研究结果表明,该基因在干旱胁迫下是下调表达的;GA生物合成重要基因GA20-氧化酶基因在干旱胁迫下的表达模式研究结果表明,两者在干旱胁迫下的表达模式具有良好的相关性,这说明GA途径可能参与木薯抗旱机制.     

花绒寄甲HSP70基因的特征与表达

为阐明热休克蛋白70(HSP70)在花绒寄甲(Dastarcus helophoroides)发育及雌雄成虫抵抗环境胁迫中的作用,利用实时荧光定量PCR技术分析了其在发育阶段和环境胁迫时的表达情况。从花绒寄甲转录组中获得3条HSP70基因,分别命名为D.h HSP69.09、D.h HSP70.11和D.h HSP71.88。发育阶段定量结果显示,3条HSP70在所有发育阶段均有表达,D.h HSP69.09在1龄幼虫期表达量最高;D.h HSP70.11和D.h HSP71.88在雄虫中表达量最高。在检测的成虫组织中,D.h HSP69.09和D.h HSP70.11在卵巢表达量最高;D.h HSP71.88在脂肪体中表达量最高。HSP70基因随温度升高(23℃升至44℃)、41℃下处理时间(0~270 min)延长、氧化剂浓度(0~70 mmol·L-1)的升高表达量先增加后减少,雌雄表达量差异较大。饥饿试验显示,雌雄虫表达模式不同;随饥饿时间延长,雄虫HSP70基因表达量有所降低,雌虫一定时间内有所上升。因此,花绒寄甲HSP70可能与不同发育期的转换、幼虫的蜕皮行为相关;HSP70对温度、氧化和饥饿胁迫的应激敏感程度和表达水平不同,能够有效应对高温、氧化、饥饿等环境胁迫。     

豌豆叶片内源水杨酸和茉莉酸类物质对机械伤害的响应

 【目的】研究内源茉莉酸类（JAs）和水杨酸（SA）对机械伤害的响应特点。【方法】以豌豆幼苗为试材,设置机械伤害、外施茉莉酸（JA）和SA 3个处理,分别采用ELISA、HPLC和分光光度法测定内源JAs与SA含量,及其合成关键酶活性。【结果】伤害处理后30 min,内源JAs含量显著增加,随后迅速下降;JAs生物合成关键酶脂氧合酶（LOX）和丙二烯氧化物合成酶（AOS）活性增加滞后于JAs含量增加。伤害处理后24 h,内源JAs含量又有小幅升高,此时LOX和AOS活性也维持在较高水平。与此相对应,内源自由态SA在JAs突发时呈下降趋势。外源JA处理后内源SA和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性变化同伤害处理相似。外源SA处理初期显著抑制了LOX和AOS活性,同时叶片内源JAs含量降低。【结论】伤害早期内源JAs含量升高和SA含量降低是植物启动相应防御反应和抵御伤害胁迫的重要机制。     

Response of Endogenous Salicylic Acid and Jasmonates to Mechanical Wounding in Pea Leaves

The roles of on endogenous jasmonates （JAs） and salicylic acid （SA） in wounding response were investigated. Pea （Pisum sativum L.） seedlings were treated with three different methods including mechanical wounding, JAs application, and SA application. The contents of endogenous JAs and SA, as well as the activities of the related enzymes were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）, high performance liquid chromatography （HPLC）, and spectrophotometer, respectively. The results showed that endogenous JA rapidly accumulated within 30 min after wounding. The increase in the activities of both lipoxygenase （LOX） and allene oxide synthase （AOS） lagged behind JAs burst. A second slight increase in JAs level was observed at 24 h after wounding treatment, and at the same time point, higher activities of LOX and AOS were also detected. Endogenous free SA content decreased accompanied with JAs burst. Effects of exogenous JA application were similar to those of wounding treatment on endogenous SA level and phenylalanine ammonia lyase （PAL） activity, whereas exogenous SA application led to the significant inhibition of LOX and AOS activities and the decrease of endogenous JAs level at the early stage of treatment. It is thus suggested that JAs burst and SA decrease in early response to wounding may constitute an important mechanism by which plant starts the related defense reaction and adapts to wounding stress.     

鸭梨PAL克隆及其在果实发育和机械伤害过程中的表达

【目的】克隆鸭梨苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）序列,并分析其在果实发育阶段和机械伤害时的表达模式,为研究鸭梨褐变机制提供理论依据。【方法】采用同源克隆方法,获得鸭梨PAL全长序列;利用在线生物信息学软件对其进行分析;采用MEGA 5.1软件构建PAL蛋白系统进化树;利用实时荧光定量PCR技术分析PAL在鸭梨果实发育阶段及受机械伤害过程中的表达。【结果】在鸭梨中获得了2个含完整CDS区的PAL,分别命名为PbPAL1和PbPAL2。PbPAL1 cDNA序列全长为2 232 bp,含2 160 bp完整开放阅读框、60 bp的5′非翻译区及12 bp的3′非翻译区,GenBank登录号为GU906268.1;PbPAL2 cDNA序列全长为2 387 bp,含2 163 bp完整开放阅读框、14 bp的5′非翻译区及210 bp的3′非翻译区,GenBank登录号为GU906269.1。系统进化分析表明PbPAL1和PbPAL2位于分子进化树的不同分支,PbPAL1与西洋梨（Pyrus communis）的PAL同源性较高,而PbPAL2与桃（Prunus persica）的PAL同源性较高。定量PCR分析表明,随着鸭梨果实发育成熟,果皮、果肉和果心的PbPAL1和PbPAL2表达量各异,但均呈下降趋势;且果实发育早期果心中的PbPAL1和PbPAL2表达量显著高于果皮和果肉。损伤处理可迅速诱导鸭梨的果肉褐变,果皮褐变出现较晚;同时,损伤刺激果皮和果肉组织中PbPAL1和PbPAL2表达上调。果皮中PbPAL1表达量在损伤处理后6 h达到高峰,而PbPAL2在损伤处理后48 h才显著上升;果肉中PbPAL1在损伤处理后1 h表达量开始显著上升,而PbPAL2在损伤处理后12 h才显著上升。【结论】鸭梨PbPAL1和PbPAL2属于2个不同的PAL类型,其表达随果实发育呈下降趋势,机械损伤过程中,两基因表达显著上调,表明其参与了损伤引起的组织褐变过程。     

转录因子AtWRKY28亚细胞定位及在非生物胁迫下的表达分析

WRKY转录因子在调控植物逆境诱导反应、生长发育及信号转导等方面发挥着重要的分子生物学功能。对转录因子AtWRKY28进行了亚细胞定位,并采用荧光定量PCR技术,对其进行表达分析。结果表明：AtWRKY28在细胞核中行使功能且其表达受多种非生物逆境胁迫因子的影响,其中受机械损伤、高盐的诱导尤为明显,说明该基因可能在响应逆境胁迫中发挥一定的功能。此外,对启动子序列的生物信息学分析发现,AtWRKY28基因的启动子包含多个与非生物逆境反应相关的顺式作用元件。     

唐菖蒲GhAOS基因的表达特性及其在拟南芥中的过表达分析

【目的】分析唐菖蒲AOS基因的表达模式及其对JAs生物合成的影响,研究GhAOS基因对伤害胁迫的应答机理。【方法】利用基因枪的方法进行GhAOS的亚细胞定位分析;运用Real-time RT-PCR技术分析GhAOS基因的表达模式,采用农杆菌介导的侵染拟南芥花粉法进行GhAOS基因的过表达分析。【结果】GhAOS定位在叶绿体的内囊体膜上;该基因在唐菖蒲各组织中均表达,其中在籽球和匍匐茎中表达量最高;经过0.1-0.5 mmol•L-1的茉莉酸甲酯（MJ）处理后,逐渐提高了GhAOS在球茎中的表达量和内源MJ含量;在拟南芥中过量表达该基因,提高了拟南芥的耐盐性和抗旱性;经过机械损伤后提高了转基因拟南芥相关基因的表达水平和内源MJ含量。【结论】GhAOS促进了唐菖蒲茉莉酸类化合物（JAs）的生物合成,提高了拟南芥的耐盐性和抗旱性;转基因拟南芥机械损伤后提高了相关抗性基因的表达水平以及内源MJ的含量。     

日本结缕草感染立枯丝核菌初期NCED基因的表达及响应分析

以转录组数据为基础,筛选并克隆出"Zenith"品种日本结缕草NCED基因片段。通过荧光定量PCR手段获得NCED基因在立枯丝核菌根部侵染初期(0~48h)表达变化模式。结果表明,胁迫处理后NCED基因表达量比未感染时均升高,且随时间变化呈现先上升后下降的趋势,在36h大量表达达到最高。进一步检测植物根部内源ABA水平发现,0~48hABA水平变化趋势与NCED基因表达模式趋势一致,并在48h之后趋于平衡。结果表明,该基因调控植物内源ABA的合成并进一步参与植物抗病机制。本研究为探究结缕草的抗病分子响应机制及育种方面的研究提供理论依据。     

质膜ATP酶介导机械伤害诱导豌豆叶片的防御反应

【目的】研究质膜ATP酶(H+-ATPase)在机械胁迫诱导植物防御反应形成中的作用。【方法】通过酶活性生化测定、Western blot检测和电镜细胞化学观测方法,研究机械伤害对豌豆幼苗质膜H+-ATPase活性的影响;同时结合药理学实验,进一步探讨了质膜H+-ATPase与活性氧积累在伤害防御反应中的关系。【结果】机械胁迫能诱导质膜H+-ATPase活性提高,但并未改变该酶蛋白含量;抑制质膜H+-ATPase活性,伤诱导的H2O2累积和苯丙氨酸解氨酶活性提高随之被抑制,活性氧清除剂处理对伤诱导质膜H+-ATPase活性提高没有影响。【结论】质膜H+-ATPase参与机械胁迫诱导防御反应相关的信号传递,该酶可能作用于活性氧信号上游,并通过蛋白磷酸化调节来诱导下游防御反应形成。     

qRealTime-PCR检测CsWIP1在柑橘不同组织中的表达

通过实时荧光定量PCR(qRealTime-PCR)检测柑橘伤害诱导基因(CsWIP1)在乙烯胁迫和机械伤害过程中的表达情况.结果显示:CsWIP1仅在外源乙烯处理的叶片和果实离层(AZ-C)中表达,而在伤害、1-MCP+乙烯、1-MCP+伤害处理的叶片中均不表达,由此可见CsWIP1仅受到乙烯信号传导途径调控.     

荞麦BTI全长基因的克隆及表达分析

【研究目的】扩增荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat trypsin inhibitor,BTI)基因,并对其表达特性和氨基酸同源性进行分析。【方法】根据荞麦胰蛋白酶抑制剂氨基酸的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,以荞麦cDNA为模板,扩增BTI基因并进行序列及其表达谱分析。【结果】克隆得到了BTI基因。它的cDNA全长为459bp,含有一个216bp的完整阅读框,编码72个氨基酸。同源性分析表明,其蛋白质序列与已报道的荞麦种子提取的BWI-1的氨基酸序列的同源性达96%,与笕属植物ATI、亚麻属植物Luti、马铃薯蛋白酶抑制剂PPI-I的氨基酸序列的同源性分别为65%、59%、48%。RT-PCR分析表明,BTI基因可在不同的组织中进行表达,但经伤害处理后的叶片中其表达量略高于生长各阶段。这可能与逆境情况(如外界损伤)下的应答等生理过程有关。【结论】荞麦BTI基因的获得,可为荞麦胰蛋白酶抑制剂的基础及应用研究奠定基础。