木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因全长克隆

[目的]克隆木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）小亚基基因cDNA全长序列,为木薯高淀粉品种的分子育种提供依据.[方法]根据木薯AGPase小亚基基因已知片段设计特异性引物,以木薯根、茎、叶为材料,利用PCR及RACE克隆木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列.运用生物信息学方法对其核苷酸序列和推导氨基酸的理化性质、蛋白质三级结构进行系统分析.[结果]克隆获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基cDNA全长1566 bp,其中包括1566 bp的完整ORF,编码一个含521个氨基酸的多肽.其理论蛋白质分子量57.01 kDa,等电点6.1,呈酸性.多重序列比较分析结果显示,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基核苷酸序列与蓖麻、麻风树和杨树相应序列的相似性分别为87％、87％和86％.结合系统进化树分析结果推测,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基在不同物种及进化过程中具有高度的保守性.蛋白三级结构分析结果表明,木薯AGPase小亚基蛋白具有15个α-螺旋、24个β-折叠和多个转角.[结论]木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列与蓖麻、麻风树和杨树等具有较高的同源性.     

桂糖11号Rubisco基因克隆、原核表达及纯化

[目的]通过原核表达及纯化获得甘蔗1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大、小亚基融合蛋白,为获得符合抗体制备条件的高纯度融合蛋白提供技术支持.[方法]以甘蔗品种桂糖11号(GT11)+1叶为材料,根据NCBI公布的甘蔗Rubisco大、小亚基基因(rbcL和rbcS)的编码域序列(CDS)设计特异性引物,PCR扩增rbcL和rbcS基因的CDS,然后连接至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒后转入原核细胞(大肠杆菌Rosetta)中诱导表达,用镍亲和层析柱对融合蛋白进行纯化,并比较分析桂糖11号与其他甘蔗品种在rbcL和rbcS基因的CDS及编码蛋白序列方面的差异.[结果]rbcL和rbcS基因的CDS长度分别为1431和510bp,其中桂糖11号rbcL基因的CDS与Saccharumhybrid cultivar SP80-3280(GenBank登录号AE009947)、Saccharum hybrid cultivar Q155(GenBank登录号KU214867)的一致,桂糖11号rbcS基因的CDS与Saccharum hybrid cultivar GT28(GenBank登录号JN591757)的存在7个碱基差异,但仅有2个氨基酸发生错义突变.RbcL和RbcS融合蛋白以包涵体形式存在原核细胞中,用镍离子亲和层析纯化及超滤浓缩后其浓度均在1.0 mg/mL以上.[结论]从桂糖11号成功克隆Rubisco大亚基和小亚基基因的CDS,大亚基基因的CDS比小亚基的保守性更高,且均可在原核细胞中高度表达,经纯化浓缩获得的高纯度融合蛋白可用于制备Rubisco单克隆抗体.     

SAGP基因克隆及反义表达载体的构建

为了研究不同启动子驱动的反义SAGP抑制内源ADP-Glc PPase小亚基编码基因表达的效果,创造适于外源基因表达的突变体,利用RT-PCR方法,由马铃薯块茎cDNA克隆获得ADP-Glc PPase小亚基编码基因(SAGP)的1 821 bp cDNA。核酸数据库检索和序列比对分析表明,已克隆的SAGP基因cDNA推测编码607个氨基酸组成的多肽,其中第312和411的天冬酰氨均突变为丝氨酸。以pCambia为基础,分别构建了CaMV35S和GBSSI块茎启动子驱动的小亚基cDNA反义结构植物表达载体。     

硝酸银诱导的大豆子叶中大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂的研究

采用二维电泳技术对硝酸银诱导的大豆子叶微粒体膜蛋白进行分离,利用四极杆-飞行时间串联质谱,对仅存在于诱导样品而不存在于对照样品中的蛋白质点进行氨基酸序列测定和分析,以期研究硝酸银处理对大豆子叶微粒体蛋白质的影响。结果显示:硝酸银可以诱导大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(SKTI)的产生,在诱导处理的子叶中大量存在其成熟形式,也存在其5 kDa小亚基,小亚基含有“GIGTIISSPER”和“FIAEGNPLR”氨基酸序列。该研究结果为SKTI的深入研究提供了实践依据,并为其分离纯化提供了简便途径,从而有利于对其更多性质的进一步研究。     

Serratia sp. NDW3 GADH小亚基基因ga2dh的克隆及表达分析

【目的】克隆葡萄糖酸脱氢酶(GADH)小亚基基因ga2dh并进行鉴定。【方法】研究水稻根际细菌Serratia sp.NDW3溶磷过程中菌株溶磷量、GADH活性与ga2dh基因表达量的变化,对ga2dh基因进行克隆和生物信息学分析,并检测ga2dh基因在大肠埃希菌BL21中的表达。【结果】Serratia sp.NDW3溶磷过程中ga2dh基因的相对表达量在12 h最大,GADH活性在24 h达到最大值,NDW3溶磷量在36 h后趋于稳定。从Serratia sp.NDW3菌株中克隆获得了781 bp的ga2dh基因序列,生物信息学分析发现该序列与Serratia sp.SCBI菌株的基因相似性为99.62%,编码的蛋白属于葡萄糖酸脱氢酶亚基3超家族,主要由3个α-螺旋构成,且氨基酸序列中包含有位于胞内、胞外和跨膜的区域。ga2dh基因在大肠埃希菌BL21体内表达,能够使得菌体GADH的活性显著增加。【结论】Serratia sp.NDW3菌株溶磷的主要机制依赖于直接氧化途径,ga2dh基因编码的小亚基不仅对GADH活性起重要作用,也是介导GADH跨膜结构的重要组成部分。     

天山雪莲rbcS基因启动子的克隆及序列分析

以天山雪莲(S.involucrata Kar.et Kir.)为材料,根据已获得的天山雪莲1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因组序列设计引物,采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和高效TAIL-PCR(hiTAIL-PCR)扩增到rbcS基因5′上游启动子序列,长为1 668bp。用PlantCare和PLACE软件序列分析表明,该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CA AT-box,包含多个胁迫诱导元件,如光诱导元件、赤霉素、低温诱导元件,昼夜节律调控元件等。构建pBI-PsikrbcS-GUS植物表达载体,并成功将其转化进入农杆菌。sikrbcS基因启动子的克隆与分析为进一步研究雪莲1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因的表达调控奠定了基础。     

薄荷GPPS基因的克隆与表达分析

牻牛儿基焦磷酸合酶(GPPS Geranyl diphosphate synthase)为短链异戊烯基合酶家族成员,催化1分子的IPP与DMAPP形成GPP,为单萜提供碳骨架。实验从我国薄荷品种"738"中克隆了GPPS大小亚基cDNA全长序列,对其进行序列分析,并研究GPPS基因在薄荷根、茎、叶、花中的相对表达量。结果:GPPS大亚基cDNA序列ORF全长1131 bp,编码377个氨基酸,GPPS小亚基cDNA序列ORF全长942 bp,编码313个氨基酸。研究获得的GPPS基因所编码氨基酸与薄荷属其他种的GPPS氨基酸序列高度相似。GPPS大亚基基因在薄荷品种"738"不同组织中均有表达,幼叶中的表达量最高。     

小麦A GPase4个亚基的克隆及其组织特异性表达

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号发育籽粒中克隆出小麦淀粉合成关键酶-AGPase的胞质型小亚基(cytosolic small subunit,SSU Ⅰ)、质体型小亚基(plastidial small subunit,SSU Ⅱ)、胞质型大亚基(cy-tosolic large subunit,LSU Ⅰ)和质体型大亚基(plastidial large subunit,LSU Ⅱ)的cDNA序列.所克隆的基因cDNA序列长度分别为1 465、1 631、1 941和535 bp.序列比对结果显示SSU Ⅰ、LSU Ⅰ和LSU Ⅱ与已往报道的大麦、小麦、玉米、水稻等相关基因的同源性较高,而SSU Ⅱ的cDNA序列为首次克隆,与大麦SSU Ⅱ相比,5'端缺失编码转移肽的一段序列,表明其可能对质体AGPase活性产生一定影响.通过半定量PCR法发现SSU Ⅰ与LSU Ⅰ在籽粒中表达量较高,而SSU Ⅱ和LSU Ⅱ在叶片中丰富表达.     

大豆耐热β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达

以含耐热β-淀粉酶的大豆品种中黄20为材料,从未成熟大豆子叶组织中提取总RNA,利用RT-PCR扩增出预计大小的cDNA片段.将该片段克隆至pGEM-T载体,经酶切分析和测序,克隆的β-淀粉酶的基因的cDNA片段长1 491 bp,与已报道序列只存在个别的碱基差异,同源性达到99%,编码497个氨基酸残基的多肽,预计相对分子质量56 KD.酶切片段与经相同酶酶切的表达载体pET-43.1(a)连接,转入大肠杆菌中,并使其高效表达.SDS-PAGE表明,大肠杆菌表达的大豆β-淀粉酶的相对分子质量约为50 KD.     

大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因(Gm VTE3)的克隆及对转基因烟草种子中生育酚组成的影响

【目的】克隆大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因(GmVTE3),研究其在烟草中过量表达对转基因烟草种子中生育酚(维生素E)组分的影响。【方法】利用EST拼接和RT-PCR技术,从大豆中分离了大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶(VTE3)的全长cDNA序列,通过烟草转化研究过量表达VTE3对转基因植株维生素E组分的影响。【结果】GmVTE3全长1026bp,编码342个氨基酸,与其它物种的VTE3氨基酸同源性很高,在烟草中过量表达该基因使烟草种子中γ-生育酚与δ-生育酚的比值最高增加2倍。【结论】首次克隆了大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因GmVTE3,它能够催化烟草植株中2-甲基-6-植基-1,4-苯醌(MPBQ)的甲基化,从而改变烟草种子中生育酚的组成成分。说明可以利用克隆的GmVTE3来改变植物种子中生育酚的组成和提高α-生育酚的含量。     

槟榔、橡胶化感作用的初步研究

以槟榔、橡胶作为供体,玉米、花生、南瓜、黄豆、稗草、马唐为受体,通过种子萌发的生测和根伸长的生测法来测定槟榔、橡胶的化感作用。结果表明:槟榔叶浸提液在对玉米、南瓜和黄豆的萌发和根生长的影响呈现高浓度抑制、低浓度促进的现象;槟榔叶浸提液高浓度下对稗草和马唐的根生长有抑制作用。槟榔根系周围的土壤对玉米和南瓜的萌发、玉米和黄豆的根生长都有促进作用;而对南瓜的根生长和花生的萌发有抑制作用。橡胶叶浸提液高浓度下对南瓜的萌发有抑制作用;低浓度对花生的根生长有促进作用;橡胶叶浸提液对马唐的根生长有较强的抑制作用。橡胶根系周围土壤对玉米种子的萌发和根生长都有少量促进作用,橡胶根系周围的土壤对花生的萌发和根生长有抑制作用。     

夏枯草RuBPCase大亚基基因的克隆与表达

为从夏枯草中克隆参与光合作用和光呼吸代谢的关键酶RuBPcase大亚基基因rbcL,为今后研究夏枯草RuBPcase的结构和功能以及从分子水平探讨夏枯草的光合作用机理提供必要的基础数据,以夏枯草基因组DNA为模板,采用PCR法对夏枯草RuBPCase大亚基基因(PvrbcL)的克隆与表达进行研究。结果表明:PCR法扩增出夏枯草RuBPcase大亚基基因片段PvrbcL,基因长837bp,编码278个氨基酸,GenBank登录号为JN 692563;经BLAST序列比较,夏枯草PvrbcL基因核苷酸序列与大花夏枯草、鼠尾草、烟草、大豆、水稻、菜豆、葡萄、油菜的相似性为86%～100%,氨基酸同源性为92%～100%;Northern杂交分析表明,PvrbcL基因在夏枯草叶和茎中表达,且在叶中的表达量最大;发育表达模式结果显示,Pvr-bcL基因的表达量随着叶片的生长而增加。PvrbcL基因的克隆和表达模式分析为进一步研究夏枯草RuB-Pcase的结构和功能奠定了基础。     

两种豆科作物种子萌发对酸雨胁迫的响应

采用室内生物试验方法,研究了不同pH值模拟酸雨溶液对豆科作物大豆和花生种子萌发的影响.结果表明:酸雨胁迫对大豆种子的发芽势、萌发率产生显著的抑制作用,并且随着酸雨pH值的降低其抑制效应不断增强,但花生种子萌发几乎不受酸雨胁迫的影响;另外,酸雨胁迫对大豆和花生种子萌发后的幼芽、幼根生长同样具有明显的抑制效应,随着酸雨浓度的增加,幼苗的芽长和根长逐渐缩短、抑制指数相应上升,其中在酸雨pH≤3.5时的大豆幼苗芽长以及pH≤4.0时的大豆幼苗根长和花生幼苗芽长和根长均显著低于蒸馏水处理,而在酸雨pH≤4.0时2种作物的芽长和根长抑制指数均显著高于蒸馏水处理;种子抗酸雨胁迫能力强弱表现为花生高于大豆.     

落花生,扁豆,黑大豆,绿豆和豇豆的生药学显微鉴定

本文记述了落花生、扁豆、黑大豆、绿豆、豇豆的显微特征,结果表明,5种药材的显微特征清楚,差异也比较明显。     

Development of Soybean EST-SSR Markers and Their Use to Assess Genetic Diversity in the Subgenus Soja

Developing expressed sequence tag-derived SSR （EST-SSR） markers is imperative in genetic research. In this paper, we reported 37 EST-SSR markers which were developed from 286 unigenes obtained from soybean cDNA library. Among the 286 markers designed for the 4 accessions of Glycine max and 6 of its wild progenitor （G. soja） within the subgenus Soja, 209 markers amplified DNA fragments, taking 73.1% and 37 markers appeared to be polymorphic, which was 12.9% of the total. The 37 loci detected a total of 142 alleles, while the PIC values varied from 0.194 to 0.794. Both the number of alleles per locus and PIC value were significantly related to the SSR motif. Six EST-SSR loci may be fixed for different alleles between G. max and G. soja since they were particularly polymorphic among the 6 G. soja accessions. A neighbor-joining tree placed the G. max accessions together as a group within the G. soja, though the average genetic distance among G. soja accessions was much higher. These new EST-SSRs markers will be useful for genetic diversity analysis, genetic mapping construction and gene discovery in Soja subgenus.     

巴西橡胶三品系叶片RuBP羧化酶的免疫酶标定位

通过提纯的RuBP羧化酶制备兔抗RuBP羧化酶抗体,以辣根过氧化物酶进行酶联标记,对典型的C4植物甘蔗、C3植物水稻和巴西橡胶三品系叶切片进行RuBP羧化酶的定位.通过显微及超微观察,结果表明:C4和C3植物叶切片中RuBP羧化酶的分布明显不同,C4植物的特异颗粒颜色反应(棕色)存在于维管束鞘细胞;C3植物的特异颗粒颜色反应(棕色)存在于叶肉细胞.巴西橡胶IAN873、RRIM600品系叶片内RuBP羧化酶在鞘细胞和叶肉细胞的叶绿体中均有特异颗粒颜色反应(棕色);而天任31 45品系只有叶肉细胞的叶绿体中有特异颗粒颜色反应(棕色).试验还表明,叶肉细胞的RuBP羧化酶发育可能在前,鞘细胞RuBP羧化酶发育可能在后.     

不同寄主作物对斜纹夜蛾分布和生长发育的影响研究

广东南雄烟区烟叶、莲藕、芋头、豆角、辣椒、茄子、花生等对斜纹夜蛾分布和生长发育的影响试验结果表明,斜纹夜蛾幼虫在不同作物上的分布数量多少依次为:莲藕>芋头>烟叶>花生>茄子>辣椒>豆角;斜纹夜蛾幼虫取食不同寄主植物的发育历期长短依次为:辣椒>花生>茄子>芋头>豆角>烟叶>莲藕,取食不同作物对幼虫质量、存活率、蛹质量均有明显的影响。     

荧光抗体在热带作物小粒种咖啡的C_3/C_4属性鉴别中的应用

用从烟草提纯的 1,5-二磷酸核酮糖 ( Ru BP)羧化酶制备兔抗 Ru BP羧化酶抗体 ,并以异硫氰酸盐荧光素 ( FITC)标记抗体 .采用直接免疫荧光法对典型 C3植物水稻、C4 植物甘蔗和小粒种咖啡等进行了 Ru BP羧化酶的组织化学定位 .结果表明 :C3和 C4 植物叶切片中 Ru BP羧化酶的分布明显不同 ,C3植物的特异荧光位于叶肉细胞 ,C4 植物的特异荧光绝大部分位于维管束鞘细胞 ;小粒种咖啡的特异荧光仅分布在叶肉细胞 .因此认为 ,小粒种咖啡应属 C3植物     

刺梨RNA的有效提取及Actin基因片段的克隆

[目的]为刺梨的分子生物学研究奠定技术基础。[方法]分别采用改进的CTAB-LiCl法和CTAB法提取刺梨果实中的总RNA和基因组DNA。对刺梨总RNA进行反转录,生成cDNA第1链。根据GenBank上的蔷薇科肌动蛋白(Actin)基因保守序列设计1对跨内含子引物Actin1和Actin2,以cDNA第1链和基因组DNA为模板进行RT-PCR扩增。将含有目的片段的凝胶进行回收纯化,克隆到PMD18-T载体上,转化大肠杆菌TG1感受态细胞,选取带有目的片段的重组质粒进行测序和序列分析。[结果]将目的片段回收后克隆于T载体,可获得298 bpActin基因的cDNA序列。克隆所得核苷酸序列与蔷薇、桃和葡萄的核苷酸序列相似性达83%,与富士苹果、甜菜等的相似性也超过80%。刺梨Actin基因编码的氨基酸序列与梨的相似性最高(达97%),其次是葡萄、花生、大豆、棉花和马铃薯,而与水稻、拟南芥等的相似性也达90%以上。[结论]Actin基因跨内含子,用该Actin基因片段作内标可以减少DNA污染。     

提莫菲维小麦和偏凸山羊草不育细胞质对小麦旗叶光合功能的影响

 本文研究了提莫菲维小麦（Triticum timopheevi）和偏凸山羊草（Aegilops ventricosa）雄性不育细胞质对小麦旗叶光合功能的影响。研究结果表明，与普通小麦细胞质相比，提莫菲维小麦和偏凸山羊草细胞质会在不同程度上对小麦旗叶的光合速率、量子效率、气孔导度、叶肉导度、水分利用效率、光系统Ⅰ活性及Hill反应活性产生负效应，提莫菲维小麦细胞质的负效应小于偏凸山羊草。旗叶全展初期，普通小麦细胞质的RuBPCase初始活性和总活性显著高于提莫菲维小麦细胞质，提莫菲维小麦细胞质又显著高于偏凸山羊草细胞质；而在RuBPCase初始比活性及总比活性方面，普通小麦细胞质和提莫菲维小麦细胞质相近，这两者显著高于偏凸山羊草细胞质。异源细胞质雄性不育系育性恢复后，旗叶光合速率、RuBPCase初始活性和初始比活性等均有显著提高。