红鳍东方纯IL-2基因克隆及序列分析

鱼白细胞介素-2是近年来新发现的一类细胞因子。根据Bird等发表的河豚IL-2基因序列设计一对特异性引物,通过RT—PCR方法扩增和克隆了红鳍东方纯（Fugum6却es）白介素-2的核苷酸序列。该cDNA序列由490nt组成,编码由149个氨基酸组成的前体蛋白。序列分析表明,红鳍东方纯IL-2核苷酸序列和氨基酸序列与目前已知的其它物种IL-2的核苷酸及氨基酸的同源性分别位于34％-44％和24％～43％之间,N端存在长22个氨基酸的信号肽,含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸。遗传进化分析表明,红鳍东方纯IL-2在遗传进化上具有其独立性。     

红鳍东方鲀IL-2基因克隆及序列分析

鱼白细胞介素-2是近年来新发现的一类细胞因子.根据Bird等发表的河豚IL-2基因序列设计一对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增和克隆了红鳍东方鲀(Fugu rubripes)白介素-2的核苷酸序列.该cDNA序列由490nt组成,编码由149个氨基酸组成的前体蛋白.序列分析表明,红鳍东方鲀IL-2核苷酸序列和氨基酸序列与目前已知的其它物种IL-2的核苷酸及氨基酸的同源性分别位于34% ～44%和24% ～43%之间,N端存在长22个氨基酸的信号肽,含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸.遗传进化分析表明,红鳍东方鲀IL-2在遗传进化上具有其独立性.     

红鳍东方鲀IL-2基因克隆及序列分析

鱼白细胞介素-2是近年来新发现的一类细胞因子.根据Bird等发表的河豚IL-2基因序列设计一对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增和克隆了红鳍东方鲀(Fugu rubripes)白介素-2的核苷酸序列.该cDNA序列由490nt组成,编码由149个氨基酸组成的前体蛋白.序列分析表明,红鳍东方鲀IL-2核苷酸序列和氨基酸序列与目前已知的其它物种IL-2的核苷酸及氨基酸的同源性分别位于34% ～44%和24% ～43%之间,N端存在长22个氨基酸的信号肽,含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸.遗传进化分析表明,红鳍东方鲀IL-2在遗传进化上具有其独立性.     

红鳍东方鲀SREBP-1基因的电子克隆及生物信息学分析

利用斑马鱼的SREBP-1的氨基酸序列NP_001098599.1为探针,对红鳍东方鲀基因组数据库进行BLAST分析,获得红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)的固醇调节元件结合蛋白-1 (Sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)的cDNA序列及相应的氨基酸序列.采用生物信息学方法对其基本理化性质、蛋白质结构及功能结构域进行分析.结果发现红鳍东方纯SREBP-1基因的开放阅读框全长3 330 bp,共编码1 109个氨基酸;红鳍东方鲀SREBP-1的氨基酸序列与黄斑蓝子鱼、大西洋鲑、斑马鱼、人、牛及原鸡的同源性分别为81％、73％、72％、55％ 、55％、54％和54％;系统进化分析结果表明,红鳍东方纯SREBP-1与黄斑蓝子鱼的进化关系最为密切,亲缘关系最近;红鳍东方鲀SREBP-1蛋白中α-螺旋较多,该蛋白质氨基端包含1个bHLH-zip的结构.     

红鳍东方鲀SREBP-1基因的电子克隆及生物信息学分析

利用斑马鱼的SREBP-1 的氨基酸序列NP_001098599.1 为探针,对红鳍东方鲀基因组数据库进行BLAST 分析,获得红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）的固醇调节元件结合蛋白-1 （Sterol regulatory element bindingprotein-1,SREBP-1）的cDNA 序列及相应的氨基酸序列。采用生物信息学方法对其基本理化性质、蛋白质结构及功能结构域进行分析。结果发现红鳍东方鲀SREBP-1 基因的开放阅读框全长3 330 bp,共编码1 109 个氨基酸;红鳍东方鲀SREBP-1 的氨基酸序列与黄斑蓝子鱼、大西洋鲑、斑马鱼、人、牛及原鸡的同源性分别为81%、73%、72%、55%、55%、54%和54%;系统进化分析结果表明,红鳍东方鲀SREBP-1 与黄斑蓝子鱼的进化关系最为密切,亲缘关系最近;红鳍东方鲀SREBP-1 蛋白中α-螺旋较多,该蛋白质氨基端包含1 个bHLH-zip 的结构。     

红鳍东方鲀组织蛋白酶L基因的电子克隆及序列分析

[目的]采用电子克隆技术克隆红鳍东方鲀组织蛋白酶L基因,并应用生物信息学技术分析其推导氨基酸的序列特征,为进一步探索其在免疫功能中的作用奠定基础.[方法]以斑马鱼的组织蛋白酶L核苷酸序列(Y08321.1)为探针,对红鳍东方鲀基因组数据库进行BLASTn分析,将检索到的匹配结果进行碱基3′端及5′端的适当延长,用DNAssist预测其编码信息;然后从GenBank获取若干物种组织蛋白酶L序列,用DNASTAR软件进行比对.[结果]红鳍东方鲀组织蛋白酶L基因全长2005 bp,含7个外显子和6个内含子;包含编码336个氨基酸的开放阅读框(1011 bp);其推导的氨基酸序列具有组织蛋白酶L所特有的氨基酸保守结构域(ERWNIN和GNFD)及由Cys25、His159和Ash175残基组成的保守活性位点,与青鳉、鲤鱼的组织蛋白酶L基因具有较高的序列一致性.[结论]红鳍东方鲀组织蛋白酶L的一些结构域和催化活性位点在进化过程中比较保守,与鱼类物种来源的组织蛋白酶L在氨基酸水平上一致性较高,在进化上亲缘关系较近.     

红鳍东方鲀Sirt1基因的克隆及其原核表达

【目的】克隆红鳍东方鲀Sirtuin1(Sirt1)基因编码阅读框(ORF),并对其进行原核表达。【方法】采集红鳍东方鲀脂肪组织,提取其总RNA,采用RT-PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF,构建其原核表达载体pET32a/Sirt1,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。【结果】红鳍东方鲀Sirt1基因ORF区由2 070个核苷酸组成,编码689个氨基酸。根据红鳍东方鲀Sirt1ORF核苷酸序列推测的氨基酸序列与其他物种进行比对,发现其与罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲齿鲤(Nothobranchius furzeri)、科恩氏假鳃鳉(Nothobranchius kuhntae)、斑马鱼(Danio rerio)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的同源性分别为82%,82%,81%,66%,72%和69%;成功构建了重组质粒pET32a/Sirt1,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约105ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】克隆得到红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF序列,并成功对其进行了原核表达。     

猪圆环病毒Ⅱ型的分离与全基因组序列分析

从福建省表现为断奶猪多系统衰竭综合征的猪群中分离到两株猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2),分别命名为FUQING0401和PUTIAN0401。通过对这两个分离株的全基因组序列测定,并同GenBank登录的12个代表毒株进行了遗传进化分析,结果表明：福建省两分离株的ORF1核苷酸同源率为97.5％,rep蛋白之间有6个氨基酸的差别,ORF2的核苷酸同源率为99.7％,而两者氨基酸同源率为98.7％。福建省两分离株与加拿大、美国、欧洲以及中国其他地方毒株之间的同源性很高,遗传进化分析表明这两毒株与其他代表毒株可分为几个小分支,但它们之间的核苷酸同源率在91.6％～99.9％,并没有发现福建的两个毒株之间存在地区特异性。     

暗纹东方魨中BAFF基因相关序列的性质探讨

[目的]为探索暗纹东方魨基因组中是否存在BAFF基因。[方法]通过比对人、小家鼠、野猪、原鸡的BAFF基因cDNA序列,获取高度保守的同源片断。根据红鳍东方魨基因组文库序列设计引物,从野生暗纹东方纯肌肉样品中提取总DNA进行PCR扩增。并进行PCR产物的克隆与测序。[结果]通过PCR扩增获得3条特异性条带,大小分别为542、349、221bp。在红鳍东方魨基因组文库中未找到与542bp序列匹配的片段。349和221bp序列在暗纹东方能和红鳍东方纯中是保守的。暗纹东方魨与红鳍东方魨序列比对结果表明,碱基突变的主要方式为插入或缺失。[结论]3个扩增条带为BAFF基因相关序列的可能性较小。在鱼类生物体中很可能不存在与哺乳类、鸟类BAFF同源基因。     

四川白鹅白细胞介素-2基因的克隆及生物信息学分析

[目的]克隆分析四川白鹅白细胞介素-2(IL-2)基因。[方法]参照GenBank中发表的鸭IL-2基因保守序列,设计1对引物,采用RT-PCR技术从ConA刺激的四川白鹅外周血淋巴细胞的总RNA中扩增鹅IL-2基因,并进行测序及生物信息学分析。[结果]四川白鹅IL-2基因全长468 bp,含1个441 bp的开放阅读框(ORF),编码146个氨基酸。生物学软件分析表明该序列编码的氨基酸序列中有4个磷酸化位点,1个糖基化位点,含有21个氨基酸残基组成的信号肽。同源性分析表明四川白鹅IL-2基因与鸭、鸡和火鸡IL-2核苷酸及氨基酸序列同源性均分别为92.2%、77.5%、78.2%和85.8%、65.5%、64.1%,而与其他种属的哺乳动物及啮齿类动物(如人、猴、大鼠、牛、马、猪、猫、小鼠、兔和鹿)的IL-2基因的核苷酸和氨基酸同源性均分别低于45%和28%。[结论]四川白鹅IL-2基因与鸭和鸡具有较近的亲缘关系。     

鲈鱼白细胞介素-8 cDNA序列的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法扩增和克隆了鲈鱼白细胞介素-8(LjIL-8)的编码阅读框。该编码阅读框由300个核苷酸组成,编码由99个氨基酸组成前体蛋白。LjIL-8氨基酸序列与哺乳动物和鱼类IL-8类似物的氨基酸同源性分别为23%~48%和25%~92%。氨基酸序列分析表明,N端存在一长23个氨基酸的信号肽,含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸。分子进化分析表明,LjIL-8与欧洲鲈鱼的亲缘关系最近。将LjIL-8编码序列克隆到原核表达载体pET-28a (+),转化E.coli BL21(DE3)后用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测结果表明,预期分子量大小的小分子蛋白在大肠杆菌中成功表达,Western-blotting检测结果显示,目的蛋白能与抗6×His单克隆抗体发生特异性反应。     

暗纹东方纯微卫星筛选和群体遗传多样性分析

为了解长江野生暗纹东方纯群体遗传多样性现状,采用已发表的16对红鳍东方鲀微卫星引物对暗纹东方鲀基因组DNA进行PCR扩增,结果有10对微卫星引物(占总数62.5％)能扩增出特异性条带.利用这10对微卫星引物对采自长江常熟江段30尾暗纹东方纯群体进行扩增分析,共获得51个等位基因,每个位点等位基因数在2到10之间,平均为...     

新疆油鸡禽流感病毒Xj14分离株PA基因的克隆与序列分析

为了从分子水平上掌握新疆油鸡H9N2亚型禽流感病毒PA基因的遗传进化情况,采用RT-PCR技术对新疆油鸡分离株Xj14的PA基因进行克隆、测序及分子进化分析,将PA基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列与Gen Bank中已经公布的参考序列进行同源性比较。结果表明,新疆油鸡分离株的PA基因由2 151个碱基组成,编码716个氨基酸,与AIV A/Duck/Hong Kong/Y439/97的PA基因处于同一分支,其核苷酸和氨基酸水平的同源性依次为89.9%和96.9%,在系统进化上属于欧亚分支中的Y439谱系。     

鸭IL-18基因克隆与序列分析

[目的]为深入研究鸭IL-18的基因表达及其生物学活性和分子佐剂的应用奠定基础。[方法]依据GenBank中香港鸭IL-18基因的序列设计1对特异引物,以广东水鸭脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆广东水鸭IL-18基因并进行序列分析。[结果]测序结果表明,广东水鸭的IL-18基因开放阅读框为603 bp,编码201个氨基酸,分子量为23.2 kDa。序列分析表明,所获得的广东水鸭IL-18基因与GenBank中香港鸭的核苷酸同源性为98.2%,氨基酸同源性为100%。它与鸡和火鸡的核苷酸同源性分别为86.9%和87.1%,而氨基酸同源性分别为96.5%和97.0%。[结论]进化树分析结果表明,鸭IL-18基因与鸡和火鸡进化关系较近。     

红鳍东方鲀gsdf基因的克隆及表达模式分析

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes的性别决定因子(gonadal soma derived factor,GSDF),利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)首次克隆了红鳍东方鲀gsdf基因(Trgsdf)的c DNA全长序列(Gen Bank登陆号:KR914667)。结果表明:Trgsdf c DNA序列全长为1734 bp,其中5'端非编码区144 bp,开放阅读框648 bp,3'端非编码区942 bp,共编码215个氨基酸;预测的氨基酸序列中存在1个长度为19个氨基酸的信号肽和相同长度的跨膜区,1个N-糖基化位点NST,1个TGF-β家族成员特有的保守结构域;BLAST同源性分析结果显示,红鳍东方鲀GSDF氨基酸序列与其他鱼类的相似性为26%~58%;系统发育分析结果显示,鱼类GSDF单独聚为一支,与TGF-β超家族内的其他成员分开,红鳍东方鲀与青鳉Oryzias latipes GSDF的亲缘关系最近,先聚为一支,后与三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus聚在一起,与矛尾鱼Latimeria menadoensis的GSDF亲缘关系最远;应用RT-PCR技术检测Trgsdf mRNA在雌性和雄性红鳍东方鲀成鱼不同组织中的表达,结果显示,Trgsdf mRNA在卵巢和精巢中高表达,在皮肤和肌肉组织中微量表达,在其他组织中无表达;采用相对实时荧光定量PCR方法比较了成鱼卵巢和精巢中Trgsdf mRNA的表达量,结果显示,Trgsdf mRNA在精巢中的表达量显著高于卵巢(P0.05),约为卵巢表达量的6倍。研究表明,gsdf基因可能在红鳍东方鲀的性腺尤其是精巢的分化和发育过程中起着重要的作用。     

红鳍东方鲀IgM重组表达与多克隆抗体制备

红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）是我国重要的海水养殖经济鱼类，探究红鳍东方鲀IgM的结构与功能对其病害防治与免疫系统的研究均有重要意义。本研究克隆获取了红鳍东方鲀IgM的重（H）链恒定（C）区序列，序列大小为1326bp，编码442个氨基酸，将获得的IgM序列连接至pET28a表达载体上，利用大肠杆菌BL21进行体外重组表达，SDS-PAGE结果显示：重组蛋白红鳍东方鲀IgM（TrIgM）大小约为62kDa，重组表达的IgM主要以包涵体形式表达。通过体外复性获得可溶性TrIgM蛋白, 将制备的TrIgM蛋白免疫BALB/c小鼠，获得了TrIgM鼠抗血清，Western blot检测结果表明：制备的鼠抗血清可以与重组TrIgM蛋白和红鳍东方鲀天然血清中的IgM的重链蛋白特异性结合。本研究中制备的抗血清可作为检测红鳍东方鲀IgM的特异性抗体，为红鳍东方鲀相关免疫检测提供基础。     

磨盘和富有柿果实ACS基因片段的克隆

利用RT-PCR的方法,从磨盘、富有柿果实中克隆了ACC合成酶(ACS)的3个DNA片段。序列分析表明：Mopan-ACS1、Mopan-ACS2与平核无柿果实DK-ACS1的核苷酸同源性为75．6％,氨基酸同源性分别为98.7％和98.2％。Fuyu-ACS与DK-ACS1的核苷酸同源性为99．2％,氨基酸的同源性为99．4％。3个片段编码的氨基酸序列中,均含有植物ACS的保守氨基酸区和不变氨基酸残基。     

红鳍东方鲀BAC数据库和ESTs数据库中微卫星的筛选与应用

利用Tandem Repeats Finder软件在红鳍东方鲀Takifugu rubriper BAC数据库和ESTs数据库中查找微卫星标记.选取其中22个序列(11个BAC-SSRs序列、11个EST-SSRs序列)设计引物,并将22对引物用于庄河、河北Ⅰ和河北Ⅱ3个群体,均能扩增出产物,其中EST-SSRs有2对引物扩增产物比预期扩增产物偏大,可能是相应基因组中有内含子导致.研究结果表明,EST-SSRs标记要比BAC-SSRs标记的多态性低,其中11个BAC-SSRs和9个EST-SSRs标记有很好的多态性,可以用于红鳍东方鲀的遗传多样性分析和重要经济性状筛选等方面的研究.     

红鳍东方鲀感染哈氏弧菌前后组织中socs3基因的表达差异分析

为研究红鳍东方鲀Takifugur ubripes免疫系统相关细胞因子信号传导抑制因子-3(Suppressor of cytokine signaling,SOCS3)的表达情况,采用相对实时荧光定量PCR方法比较了体质量为(290.34±5.13)g的健康红鳍东方鲀脑、脾脏、肠、鳃、肌肉和肝脏6个不同组织中socs3基因表达量,以及感染哈氏弧菌Vibrio harveyi后肝脏、脾脏和肠组织socs3基因表达量的变化。结果表明:socs3基因在健康红鳍东方鲀肝脏组织、肌肉组织中均有显著表达(P<0.05),在鳃、脑、脾脏、肠组织中表达不显著(P>0.05);感染哈氏弧菌的红鳍东方鲀,在感染后的24、48 h时,肝脏组织socs3的表达量显著高于0 h(P<0.05),分别约为初始时的10倍和8倍,其他组织变化不明显(P>0.05);利用NCBI的ORF Finder程序鉴定所得红鳍东方鲀SOCS3(NP_001072096.1)序列的潜在开放阅读框(ORF),通过模块化结构研究工具来鉴定保守结构域和信号肽,表明socs3的cDNA序列全长1533 bp,其中5′端非编码区为215 bp,开放阅读框(ORF)长度为606 bp,3′端非编码区为713 bp,共编码201个氨基酸;利用MEGA 6.0软件进行氨基酸序列比对并构建系统发育树,结果显示,硬骨鱼类单独聚为一支,与哺乳动物、两栖动物及鸟类分开,硬骨鱼类中的SOC3b单独聚为一支,红鳍东方鲀与其同科的黑青斑河豚Tetraodon nigroviridis的SOC3聚在一起,并与三刺鱼Gasterosteus aculeatus属于同一分支。本研究结果可为红鳍东方鲀免疫应答的研究提供数据支持。     

红鳍东方鲀感染哈氏弧菌前后组织中socs3 基因的表达差异分析

为研究红鳍东方鲀Takifugur ubripes免疫系统相关细胞因子信号传导抑制因子-3(Suppressor of cytokine signaling,SOCS3)的表达情况,采用相对实时荧光定量PCR方法比较了体质量为(290.34±5.13)g的健康红鳍东方鲀脑、脾脏、肠、鳃、肌肉和肝脏6个不同组织中socs3基因表达量,以及感染哈氏弧菌Vibrio harveyi后肝脏、脾脏和肠组织socs3基因表达量的变化。结果表明:socs3基因在健康红鳍东方鲀肝脏组织、肌肉组织中均有显著表达(P0.05),在鳃、脑、脾脏、肠组织中表达不显著(P0.05);感染哈氏弧菌的红鳍东方鲀,在感染后的24、48 h时,肝脏组织socs3的表达量显著高于0 h(P0.05),分别约为初始时的10倍和8倍,其他组织变化不明显(P0.05);利用NCBI的ORF Finder程序鉴定所得红鳍东方鲀SOCS3(NP_001072096.1)序列的潜在开放阅读框(ORF),通过模块化结构研究工具来鉴定保守结构域和信号肽,表明socs3的cDNA序列全长1533 bp,其中5′端非编码区为215 bp,开放阅读框(ORF)长度为606 bp,3′端非编码区为713 bp,共编码201个氨基酸;利用MEGA 6.0软件进行氨基酸序列比对并构建系统发育树,结果显示,硬骨鱼类单独聚为一支,与哺乳动物、两栖动物及鸟类分开,硬骨鱼类中的SOC3b单独聚为一支,红鳍东方鲀与其同科的黑青斑河豚Tetraodon nigroviridis的SOC3聚在一起,并与三刺鱼Gasterosteus aculeatus属于同一分支。本研究结果可为红鳍东方鲀免疫应答的研究提供数据支持。