水稻胚乳突变体b140的表型分析及基因克隆

[目的]对水稻粉质胚乳突变体b140进行表型分析和基因克隆,为阐明水稻淀粉合成机制奠定基础。[方法]以粳稻品种‘W017’为野生型,测量‘W017’和突变体b140的农艺性状,分析籽粒的灌浆期干物质积累量和理化性质,并观察淀粉颗粒的结构;构建b140与‘南京11’的F2群体,取隐性极端个体定位基因;利用qRT-PCR测定籽粒灌浆时期的淀粉合成相关基因表达量;测定相关淀粉合成酶活性。[结果]b140表现为粉质胚乳,粒宽、粒厚和千粒质量均显著低于野生型,但粒长和其他农艺性状无显著变化。b140种子的总淀粉和直链淀粉含量均显著低于野生型,而可溶性糖含量显著高于野生型。扫描电镜观察b140胚乳淀粉粒呈球形或不规则形状,排列疏松。突变基因定位在第1号染色体短臂56 kb的区间内,测序发现只有1个已知基因Os01g0179400发生突变。qRT-PCR结果显示,与野生型相比,b140胚乳中淀粉合成相关基因的表达量出现不同程度的下调。b140胚乳中腺苷磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的活性显著低于野生型。[结论]b140由于Os01g0179400基因发生突变,导致粉质胚乳表型。Os01g0179400突变影响了淀粉合成相关基因的表达以及腺苷磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的活性。b140的发现对于了解水稻淀粉合成和调控的机制具有一定的意义。     

水稻心白突变体whc的理化性质和基因定位

[目的]淀粉约占水稻胚乳干物质总量的80%,胚乳中淀粉的组分与含量以及颗粒结构对稻米品质具有重要影响。因此,阐明水稻淀粉合成的分子机制对品质改良具有重要意义。[方法]通过60Co-γ辐照诱变粳稻品种‘中花11’(ZH11),得到1个稳定遗传的胚乳心白突变体white core(whc)。对该突变体的形态学特征、理化性质、淀粉结构等性状进行了分析,并对突变体whc和‘N22’杂交配制的F_2群体进行基因定位。[结果]与野生型相比,该突变体表现为胚乳中心粉质不透明,粒宽与有效穗数增加,千粒质量下降14.5%。whc突变体成熟种子的直链淀粉含量减少24.7%,而总蛋白含量变化不明显。胚乳横截面扫描电镜分析发现,突变体whc的粉质胚乳部位淀粉粒异常。挑选极端单株将whc精细定位在Chr 4染色体长臂的RM349和d1分子标记之间,物理距离为158 kb。测序发现whc突变体中1个编码三角状四肽重复结构域蛋白[tetratricopeptide repeat(TPR)domain containing protein]的基因发生点突变,导致蛋白翻译提前终止。qRT-PCR分析显示,whc突变体中编码AGPase各亚基以及部分淀粉合酶的相关基因表达量发生改变。[结论]水稻心白突变体whc的表型可能是由1个编码TPR蛋白结构域的基因控制。     

水稻粉质胚乳fse3突变体的表型分析及基因定位

【目的】水稻各种类型的胚及胚乳变异突变体是解析胚发育及淀粉合成和调控路径的优良材料。研究旨在通过大规模的粉质胚乳致死突变体的基因克隆和功能鉴定,获得一系列调控胚发育及淀粉合成的关键基因,为稻米品质改良提供理论指导。【方法】从化学诱变剂N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）处理的粳稻品种宁粳3号突变体库中,筛选到一个稳定遗传的胚乳粉质皱缩致死突变体,命名为fse3（floury and shrunken endosperm 3）。将其与9311配制杂交组合,利用F2群体中隐性极端个体进行精细定位;将种子在30℃条件下清水浸种24 h,然后在35℃黑暗条件下用TTC染色2 h检测种子活力;用体视镜观察30℃吸胀9 h后的种子胚结构;从突变体杂合植株上分离粉质成熟种子,去壳后磨成糙米粉进行理化性质分析;用扫描电镜观察成熟淀粉颗粒的结构;制备半薄切片观察发育胚乳中的淀粉颗粒结构;利用qRT-PCR测定籽粒灌浆时期的淀粉合成相关基因表达量;并通过Western-blot检测相关淀粉合成酶的蛋白积累。【结果】与野生型相比,突变体籽粒的千粒重、籽粒大小、总淀粉含量、表观直链淀粉含量等指标均降低,淀粉在尿素溶液中的膨胀能力减弱,淀粉的黏度曲线与野生型也存在显著差异,fse3突变体的最高黏度、热浆黏度、冷浆黏度以及崩解值都显著高于野生型。TTC染色表明其胚活力下降,对发育中的胚纵切片观察发现突变体没有心型胚的分化。对发育中胚乳淀粉结构进行观察,发现fse3突变体的胚乳中产生大量小而不规则排布的单淀粉颗粒,复合淀粉颗粒发育滞后。成熟种子横截面观察发现fse3突变体淀粉颗粒排列疏松,大小不均匀,颗粒间存在较大间隙。利用F2群体中分离出的22个隐性极端个体将FSE3连锁在第9染色体长臂上,随后共用1 400个极端个体将目标基因定位于228 kb的区间内,包含28个开放阅读框。qRT-PCR发现在突变体中多个淀粉合成相关基因表现出不同程度的上调和下调,Western-blot结果表明部分淀粉合成酶的蛋白积累减少。【结论】FSE3是一个新的粉质胚致死基因,基因精细定位在第9染色体228 kb的物理区间,FSE3在水稻种子胚及胚乳的发育调控中起重要作用。     

一个水稻丙氨酸转氨酶新等位基因突变体的鉴定和籽粒特性

从60Co辐射诱变的Kitaake突变体库中筛选到一份心白胚乳突变体M30,其糙米的粒宽、粒厚和粒重显著降低;米粉中的总淀粉含量显著降低,但贮藏蛋白含量显著升高.与野生型相比,突变体淀粉的直链淀粉组分和热浆黏度、崩解值、最终黏度及糊化温度显著降低.突变体胚乳中央复粒淀粉明显减少,含有大量小的单粒淀粉,且淀粉粒之间间隙较大.利用M30/Dular的F2群体中不透明极端个体将突变基因定位到第10染色体的64.9 kb区间,该区间含有7个开放阅读框(ORF),其中ORF4编码水稻丙氨酸转氨酶1(OsAlaAT1).测序发现定位区间内突变体只有OsAlaAT1基因序列上缺失872 bp.在突变位点设计的InDel标记可与定位群体中的不透明极端个体发生共分离,而22个常规水稻品种中不含该突变位点.荧光定量PCR技术检测发育胚乳中淀粉合成相关基因的表达,结果显示突变体胚乳中AGPS1、AGPL2、GBSSI、SSI、SSIIa、SBEI、SBEIIa、ISA1和PUL的表达量显著低于野生型.     

利用CRISPR∕Cas9技术编辑水稻丙酮酸磷酸双激酶基因PPDK

采用CRISPR∕Cas9技术,以水稻丙酮酸磷酸双激酶基因PPDK为靶基因,构建载体,用农杆菌介导的方法转化粳稻品种‘嘉花1号’,获得1个碱基A缺失的编辑突变植株ppdk3。该突变体米粒的胚乳为白色粉质,其淀粉颗粒变小,结构松散,I-KI染色溶液颜色明显比野生型浅,直链淀粉含量下降约5%,抗性淀粉含量略有增加。与野生型相比,该突变体的千粒重和单株穗数下降明显,水稻淀粉合成相关基因的转录表达水平也有大幅下降。试验表明:利用CRISPR∕Cas9技术可以有效地对水稻淀粉合成相关基因进行编辑,为稻米品质改良提供材料。     

水稻巨大胚突变体N2-52垩白形成机制研究

[目的]本文旨在通过对水稻巨大胚突变体进行表型分析和基因图位克隆,阐明垩白形成的分子机制。[方法]以粳稻品种‘宁粳2号’及其巨大胚乳突变体N2-52为材料,分析野生型和突变体的农艺性状和籽粒的理化特性,观察N2-52垩白区域的造粉体发育和淀粉颗粒形态;构建N2-52与籼稻品种‘N22’杂交的F_2群体,进行突变基因的图位克隆;利用蛋白免疫印迹测定淀粉合成相关酶在发育中种子、成熟种子及其垩白部分的蛋白积累量;测定蔗糖合酶的酶活性。[结果]突变体N2-52籽粒表现为巨大胚、高垩白,其结实率、千粒重极显著低于野生型,粒厚、脂肪含量显著低于野生型,株高、垩白粒率、直链淀粉含量极显著高于野生型。扫描电镜观察表明,N2-52垩白部分淀粉颗粒呈疏松的不规则排列,半薄切片也证实该部分造粉体分布疏松,且胚乳细胞内存在空泡。RVA(rapid visco analyzer)和尿素膨胀试验表明,N2-52的淀粉理化性质发生改变。突变基因被定位于第7染色体短臂的1个42 kb的区域内,测序结果表明该区域中只有1个已知基因Os07g0603700发生突变。Western blot结果显示,淀粉合成相关酶在垩白部分的蛋白积累量发生变化。N2-52的蔗糖合酶活性显著高于野生型。[结论]Os07g0603700基因的突变影响淀粉合成相关基因的表达,对淀粉的合成产生重要影响,推测其导致垩白的产生。     

水稻粉质胚乳突变体M37的基因定位及变异分析

在粳稻品种Kitaake的~(60)Co辐射突变体库中筛选到1个稳定遗传的粉质胚乳突变体M37,其粒厚、千粒重、总淀粉和直链淀粉含量均显著降低。对成熟及发育中胚乳淀粉颗粒结构进行观察,发现突变体的胚乳中淀粉颗粒排列松散,产生大量小单粒淀粉颗粒。利用M37/Dular的F_2群体中分离出的682个粉质极端个体将目标基因定位到水稻第1染色体长臂的51.6 kb,该区间含有7个开放阅读框(ORFs)。其中ORF6编码腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶大亚基2 (AGPL2)。对该基因测序分析发现突变体M37在AGPL2第4外显子上发生1个单碱基G到A的替换,导致该位点氨基酸由丙氨酸(Ala)变成苏氨酸(Thr)。氨基酸序列分析发现AGPL2的同源基因主要存在于单子叶中,突变位点在不同物种中均非常保守。该基因与已报道的水稻w24、gif2、eb6和eb7为等位基因。荧光定量PCR分析发现突变体中多个淀粉合成相关基因的表达水平发生显著变化。     

3个水稻不透明胚乳突变体淀粉理化性质分析

构建水稻突变体库并从中筛选到3个胚乳突变体M16、M35和M72,对这3个突变体的籽粒表型及淀粉特性进行分析。结果表明:M35和M72籽粒表现为淀粉颗粒排列松散的粉质胚乳, M16则表现为淀粉颗粒中心有空腔的蜡质胚乳。3个突变体中直链淀粉含量较野生型显著下降。3个突变体和野生型均为A型淀粉,与野生型淀粉相比, M35和M72淀粉有较低的相对结晶度, M16淀粉则有更高的相对结晶度。在95℃下, M72淀粉具有最低的膨胀势和最高的水溶性, M16淀粉具有最高的膨胀势和最低的水溶性。3个突变体的淀粉均具有较低的糊化峰值温度、峰值黏度、热浆黏度、最终黏度和消减值。体外消化表明, 3个突变体的原淀粉具有较高的快速消化淀粉和较低的抗性淀粉。在回生淀粉中3种突变体具有更高的抗性淀粉。     

牛心甘蓝蜡粉缺失突变体410M特征的研究

[目的]本文旨在探索牛心甘蓝蜡粉缺失突变体410M的特征和实际应用价值,以丰富甘蓝种质资源,加速新品种创制和改良。[方法]调查牛心甘蓝野生型材料410W和蜡粉缺失突变体410M的农艺性状,测定其营养品质;扫描电镜观察其叶表超微结构;以蜡粉缺失突变体材料410M(P1)与其野生型410W(P2)为亲本分别配制6世代群体,分析410M蜡粉缺失性状的遗传规律;筛选出14个在拟南芥中参与蜡粉合成、转运的基因,并利用实时荧光定量PCR对其在410W和410M中的表达模式进行分析。[结果]蜡粉缺失甘蓝叶色亮绿,突变体410M球叶和外叶的维生素C含量显著高于野生型;其他表型及主要营养成分与野生型无明显差异。叶表超微结构观察显示,突变体叶表面光滑,蜡粉严重缺失;野生型叶表蜡粉分布致密,晶体结构主要为片状和线状。对6世代群体分离比例进行χ~2检测,结果表明410M蜡粉缺失性状为隐性单基因遗传。在参与拟南芥蜡粉生物合成、转运的14个基因中,共有7个基因在野生型中的表达显著高于突变体。[结论]蜡粉缺失突变体410M遗传稳定,商品性好,为育种和蜡粉分子基础研究的优良材料。     

市场粳米食味品质及外观品质性状间的相关关系

[目的]研究市场粳米食味品质、外观品质性状间的相关关系。[方法]通过试验对食味值、直链淀粉含量、蛋白质含量、稻米外观品质性状进行了测定。[结果]直链淀粉含量、蛋白质含量与食味值呈极显著的负相关关系;正常粒率与粉状粒率、茶系粒率呈极显著的负相关关系;胴割粒率与直链淀粉含量呈极显著的负相关关系;千粒重、粒体积与食味值呈极显著的负相关关系,与直链淀粉含量呈显著的正相关关系,与蛋白质含量呈极显著的正相关关系。[结论]在优良食味粳稻育种中应该注重选育蛋白质含量、直链淀粉含量较低的品种,并且不过分追求大粒。在优质栽培中应采取措施促进子粒正常成熟,降低蛋白质含量和直链淀粉含量。     

多环境下水稻品质性状的遗传分析

稻米品质性状的遗传分析表明 :三套遗传控制体系对各品质性状具有不同的遗传效应。胚乳核基因主要以加性方式作用于直链淀粉含量、碱消值和粒长 ,以显性方式作用于胶稠度和蛋白质含量 ,粒重的直接加性效应和直接显性效应几乎同等重要 ;而母体植株核基因主要以显性方式作用于直链淀粉含量、胶稠度、碱消值、粒长、粒宽和粒重 ,长宽比的母体加性效应与母体显性效应差异不大。基因型×环境互作对稻米品质性状的影响一般为母体效应×环境互作和细胞质×环境互作 ,但胶稠度、蛋白质含量和粒重三性状还存在直接加性×环境的互作。不同品质性状的遗传率大小、来源均有一定差异 ,直链淀粉含量、碱消值和粒重以直接遗传率为主 ,而胶稠度、蛋白质含量和长宽比以及粒重的互作遗传率主要表现为母体互作遗传率 ,胶稠度主要表现为直接互作遗传率。稻米品质性状的杂种优势包括胚乳直接杂种优势 (简称胚乳杂种优势 )和母体杂种优势。直链淀粉含量、胶稠度、碱消值和粒重既具有胚乳杂种优势 ,又具有母体杂种优势 ;蛋白质含量仅存在胚乳杂种优势 ,而粒长、粒重和长宽比只有母体杂种优势。此外 ,环境对直链淀粉含量、胶稠度和长宽比的杂种优势有较大的影响。     

水稻品种‘浙粳22’内稃突变体农艺性状和稻米品质特征

以‘浙粳22’内稃突变体为材料,采用与野生型品种相比较的方法,研究内稃突变体水稻的农艺性状、稻米品质等特征。结果表明:水稻内稃突变体植株的株高、穗长与野生型植株没有明显差异,而在单穗重、每穗实粒数、千粒重、二次枝梗上则差异明显,约为野生型植株的一半左右。与对照‘浙粳22’相比,籽粒粒长相近,粒宽明显减小,‘浙粳22’长宽比只有内稃突变体的2/3。籽粒垩白率和垩白度较好,糙米率、精米率和整精米率与对照相近。RVA谱特征值(最高粘度、热浆粘度、最终粘度、消碱值和回复值)降低,直链淀粉含量增加。     

高粱胚乳淀粉体发育研究

[目的]研究高粱胚乳细胞中淀粉体的发育情况。[方法]采用光学显微镜和电子显微镜相结合的技术观察高粱胚乳细胞。[结果]发育前期,高粱胚乳中的淀粉体主要由前质体发育形成,此时主要为单粒淀粉,少部分为复粒淀粉。发育中后期胚乳细胞中1个或多个淀粉体发生中心出现,淀粉体发生中心处有许多质体,质体以先形成环状膜结构、后积累淀粉的方式形成淀粉体,此时胚乳细胞中的淀粉主要为单粒淀粉和半复粒淀粉,也有少部分为复粒淀粉。[结论]该研究为高粱胚乳淀粉体的发生和发育方式的多样性提供了理论依据。     

水稻条斑和颖花异常双突变体的生理生化特性检测

[目的]探究突变后植株叶片的生理生化变化。[方法]以1份务班和颍花异常的水稻突变体为材料,研究该突变体生长阶段的几个不同时期几种酶活性变化和稻米的氨基酸含量变化。[结果]在条斑颖花突变体生长过程中,分蘖中期SOD的活性高于野生型,在开花前和开花末期的活性又低于野生型;突变体POD活性在3个时期中呈先上升后下降的趋势,在开花前期最高,野生型植株POD活性变化趋势与之相反;CAT在突变体的3个生长时期活性呈递减趋势,在分蘖中期活性很高,在野生型中活性变化趋势相反;MDA的活性在3个时期活性变化递增,野生型的活性相对较高;突变体中可溶性糖含量低;总氨基酸含量上升。[结论]突变体性状的表达与SOD、POD、CAT和MDA活性变化有一定关系．这些变化使突变体免于死亡,最终导致米质改变：     

水稻黄叶突变体yl的遗传分析与基因定位

[目的]水稻叶片作为重要的光合器官,是作物产量的形成基础。叶色突变体不仅可以作为育种标记,还是研究叶绿体发育和培育高光效水稻品种的先决条件之一。[方法]从籼稻品种‘9311’的~(60)Co-γ射线辐射诱变突变体库中筛选获得了1个水稻黄叶突变体yl。利用yl/‘宁粳4号’杂交的F2群体进行基因定位。[结果]与野生型相比,yl突变体的幼叶表现出明显的黄化,叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量下降。突变体叶绿体中类囊体片层结构排列松散。与野生型相比,yl突变体的每穗粒数、结实率和千粒质量下降。该性状受1对隐性核基因控制。该基因初步定位于第9染色体长臂上,进一步开发分子标记把定位区间缩小在14.5 kb内,该区域包含3个候选基因。经测序比对分析发现,yl突变体的第3个ORF的第5外显子发生碱基突变(2131CTA→G),从而造成蛋白第233位氨基酸发生改变并导致翻译提前终止,形成了1个包含原有232个氨基酸和16个新形成氨基酸残基的蛋白,该基因与已报道的水稻黄叶基因YLC1是等位基因。[结论]本研究明确了YLC1参与叶绿素的合成,为叶绿体色素合成和叶绿体发育的研究提供了基础。     

拟南芥SGR2基因参与叶绿素降解和衰老过程

[目的]研究拟南芥SGR2基因参与叶绿素降解和衰老过程。[方法]购得SGR2(stay green rice,水稻滞绿基因)基因的T-DNA插入突变体,并进行叶绿素荧光分析、叶绿素含量和可溶性总糖测定、qRT-PCR等试验以及生物信息学分析。[结果]突变体叶绿素a含量较WT(colo-0野生型)降低;可溶性糖含量高于WT;RBCS(Rubisco,核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶的小亚基)和CAB(Chl a binding protein,叶绿素a结合蛋白)基因表达下调。而突变体开花明显比野生型延迟。[结论]证明了SGR2基因参与了拟南芥叶绿素降解和衰老过程。     

低直链淀粉du基因在水稻品质育种中的利用

稻米暗胚乳突变体即低直链淀粉突变体,是由理化诱变而产生,受单隐性基因-du基因控制.暗胚乳突变体的直链淀粉含量变动范围从几个百分点到15个百分点,是处于粳米和糯米之间的新型米.国外通常把控制低直链淀粉含量的基因称作混浊基因(du),而云南则把含du基因的水稻品种叫作软米,其基本特征为米饭外观油润,有光泽,食味独特,冷不回生,冷饭食口性也很好,是方便食品及米类点心的重要原料.     

利用CRISPR/Cas9技术创制香稻

[目的]随着人们生活水平的不断提高,具有香味的优质稻米日渐受到消费者的欢迎.水稻的香味性状主要受第8染色体上的BADH2基因控制,该基因突变造成稻米中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉的积累而产生香味,加速香稻培育的进程.[方法]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以适宜江西种植的粳稻台南11为研究材料,在BADH2基因的第3外显子处设计靶位点创制BADH2基因突变株系,利用潮霉素抗性标记筛选获得阳性转基因植株,经测序和PCR分析获得无转基因成分的稳定突变株系.利用气相色谱质谱联用仪测定野生型和T3代突变体材料中2-乙酰-1-吡咯啉的含量.考查分析野生型和T3代突变体材料的产量及品质.[结果]成功获得了BADH2基因突变株系,对这些株系进行鉴定分析,获得4种突变类型,其中插入突变1种,缺失突变3种;突变体材料中的2-乙酰-1-吡咯啉较野生型含量均显著提高;与野生型相比,突变体材料中的有效分蘖数、每穗总粒数、结实率等产量性状呈现显著性差异,产量平均减少8.7％;突变体材料中的蛋白质含量、整精米率、垩白度、长宽比等品质相关性状与野生型相比呈现显著性差异,品质在一定程度上有所提高.[结论]通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功对水稻中的BADH2基因进行了敲除,显著提高了水稻中香味物质的积累,缩短了培育香稻的时间,为进一步选育香稻提供理论技术和材料支撑.     

红掌突变体花青素含量的测定与比较

[目的]为在分子水平研究突变体的形成及调控机制提供理论基础。[方法]以红掌品种阿里巴巴的野生型及突变体为试材,对绿色突变体与野生型进行外部形态的观察。通过高效液相色谱（HPLC）测定了2种材料各部位的花青素种类和含量。[结果]突变体与野生型红掌花青素含量显著不同。在野生型的佛焰苞、叶片、叶柄中含有3种花色苷：花青素-芸香糖苷、花葵素-芸香糖苷、甲基花青素-芸香糖苷;而在突变体中,除了在叶柄中检测到花青素-芸香糖苷一种花色苷外,佛焰苞的叶片中检测不到任何花青素成分。[结论]突变体中可能出现了不可恢复的突变,造成花青素在合成与积累过程中出现问题,导致无法呈现正常的颜色。     

Bacillomycin D突变体在生物膜形成中的转录组分析

[目的]植物促生细菌的根际生物膜形成过程是其功能发挥的关键因素,本研究利用转录组技术遴选参与这一过程的相关基因。[方法]利用转录组技术分析解淀粉芽孢杆菌SQR9的突变体SQR9M1和野生型SQR9生物膜形成24 h时基因的表达差异,并用定量Real-time PCR验证;通过电感耦合等离子质谱(ICP-MS)的方法比较突变体SQR9M1和野生型SQR9的胞内铁离子浓度的差异;细胞培养板结合定量PCR监测外源添加铁离子后对突变体SQR9M1生物膜形成表型和相关基因表达的影响。[结果]突变体SQR9M1的生物膜形成能力在培养前期(24 h)显著低于野生型SQR9。与野生型相比,突变体生物膜细胞中共有1 261个基因表达发生改变,其中574个基因上调(P0.01),687个基因下调(P0.01)。功能明确的变化基因约占全部差异基因数量的70%,变化最大的基因功能类群是无机离子转运和代谢。突变体SQR9M1的生物膜形成延迟现象与其铁离子转运能力受损有关,外源添加铁离子能诱导野生型SQR9和突变体SQR9M1生物膜的形成和相关基因的表达。[结论]突变体SQR9M1铁离子ABC转运蛋白Fhu BGC、Feu ABC和Yfm CDEF相关基因显著下调,其胞内铁离子浓度在生长前期显著低于野生型,外源添加铁离子后能恢复突变体的生物膜表型。