6-姜烯酚对斑马鱼肝脏细胞炎症通路和抗氧化作用的影响

为探究6-姜烯酚对鱼类的免疫调节作用,用不同浓度的6-姜烯酚孵育斑马鱼肝脏细胞48 h后,检测其生长率、胞内活性氧(ROS)水平、抗氧化酶活性,并进行抗炎、抗氧化基因表达量的检测.结果显示:高浓度的6-姜烯酚抑制肝脏细胞的增殖(P<0.05);6-姜烯酚抗氧化作用显著,20μmol/L处理组抗氧化酶SOD和GSH-PX...     

亮甲酚蓝染色法评价斑马鱼卵母细胞体外成熟度的实验研究

通过不同浓度亮甲酚蓝(BCB)对斑马鱼卵母细胞进行染色,探讨该方法用于判断鱼类卵母细胞成熟度的可行性,并利用该法对孕酮促斑马鱼卵母细胞体外成熟实验中的卵母细胞成熟情况进行了判断和分析。结果表明:(1)BCB染色法用于判断鱼类卵母细胞成熟度是可行的。(2)低浓度(1 nmol/L和10 nmol/L)孕酮处理6 h,对斑马鱼卵母细胞的成熟并无明显促进作用,高浓度的孕酮(100 nmol/L和1000 nmol/L)不利于卵母细胞的成熟。(3)浓度为100 nmol/L的孕酮处理12 h,对卵母细胞成熟的促进作用显著。     

(-)-羟基柠檬酸调控鸡胚原代肝细胞脂滴沉积的机制

[目的]本文旨在研究(-)-羟基柠檬酸[(-)-HCA]对鸡胚原代肝细胞脂滴沉积的影响及其机制。[方法]选用含(-)-HCA的培养液孵育鸡胚原代肝细胞后,油红染色法检测鸡胚原代肝细胞中脂滴的数量和总面积;试剂盒法检测鸡胚原代肝细胞中甘油三酯、葡萄糖含量及糖代谢、呼吸链关键酶活性。[结果](-)-HCA处理显著降低鸡胚原代肝细胞中甘油三酯含量、脂滴数量和总面积,但对细胞活力和死亡率无显著影响。(-)-HCA处理提高了鸡胚原代肝细胞中葡萄糖消耗量,显著降低了柠檬酸裂解酶活性和细胞质中乙酰辅酶A含量。(-)-HCA处理显著提高了鸡胚原代肝细胞中葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶1、丙酮酸激酶、丙酮酸脱氢酶(E1)、乌头酸酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、柠檬酸合酶、NADH脱氢酶和ATP合酶活性。[结论](-)-HCA通过抑制柠檬酸裂解酶的活性减少细胞质中乙酰辅酶A的供给,并通过增强糖代谢和呼吸链中关键酶活性而加速能量代谢,最终抑制了鸡胚原代肝细胞中脂滴的沉积。     

异育银鲫PTX3基因的克隆与表达分析

为研究Pentraxin 3(PTX3)在鱼类中的作用,克隆得到异育银鲫(Carassius auratus gibelio)PTX3基因,并对其序列结构特征和表达模式进行分析。异育银鲫PTX3序列由3个外显子和2个内含子构成,编码453个氨基酸。异育银鲫PTX3蛋白的前22aa为信号肽,241~453aa为PTX结构域;在PTX结构域有一个非典型的Pentraxin信号。同源进化分析发现,异育银鲫PTX3与其他鱼类聚为一支,且与斑马鱼最为相似(79%);两栖类和哺乳类各自聚为一支。实时荧光定量PCR结果显示,PTX3在异育银鲫的心脏、肝脏、脾脏、头肾、体肾、鳃、脑、肌肉、肠、血液、性腺等11个组织中都有表达。在嗜水气单胞菌攻毒后,肝脏、脾脏、头肾、肠和血液中PTX3mRNA水平都显著上调。在感染后3h,脾脏中PTX3 mRNA水平即出现显著上调;感染后6h,血液中PTX3mRNA水平即达到了峰值。这些结果表明,PTX3作为急相反应蛋白在鱼类受到病原侵袭中发挥免疫保护作用。     

泽泻提取物对油酸诱导建鲤脂肪肝细胞损伤中生化指标及CYP1A蛋白表达的影响

为了研究中药泽泻提取物对油酸诱导建鲤脂肪肝变性细胞的保护作用,本实验以0.4 mmol·L-1油酸来构建建鲤原代脂肪肝细胞损伤模型,然后用不同浓度的泽泻提取物处理肝细胞24和48 h后,分别收集细胞和细胞培养液,然后测定谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、碱性磷酸酶(AKP)、胆碱酯酶(CHE)、细胞色素酶P4501A1(CYP1A1)和细胞色素酶P4502E1(CYP2E1)的含量等生化指标以及CYP1A的蛋白表达情况。结果显示,0.4 mmol·L-1的油酸与原代肝细胞共培养48 h可以显著提高肝细胞培养上清中GPT、GOT、TG、TC、AKP、CHE、LDH、CYP1A1和CYP2E1的含量(P0.01或者P0.05),可以诱导肝细胞中CYP1A的蛋白表达。将不同浓度的泽泻提取物(0、1、5、10、20、50μg·m L-1)与脂肪肝细胞共培养24~48 h发现,泽泻提取物能不同程度抑制油酸诱导的GOT、GPT、TG、TC、LDH、AKP、CHE水平和CYP1A1、CYP2 E1含量的升高(P0.01或者P0.05),不同程度降低肝细胞中CYP1 A蛋白表达,以作用时间48 h效果较好。研究证实了泽泻提取物对油酸诱导的鱼类脂肪肝细胞损伤具有保护作用,而泽泻提取物作为鱼类脂肪肝的防治药物还需要进一步的在体研究。     

低温胁迫下鱼类鳃中RPL11/MDM2/P53信号通路相关基因及蛋白表达差异分析

为了研究RPL11/MDM2/P53信号通路在鱼类低温胁迫中所起的作用,分别利用mRNA和蛋白表达水平定量技术,对罗非鱼Oreochromis niloticus和斑马鱼Danio rerio两种抗寒能力不同的鱼类鳃RPL11/MDM2/P53信号通路相关因子在低温胁迫下的表达情况进行分析.结果表明:在相同低温胁迫下,罗非鱼鳃中RPL11和P53蛋白表现出随着低温胁迫时间延长而增加的趋势,但斑马鱼鳃中P53蛋白开始增加的时间点晚于罗非鱼;罗非鱼鳃中mdm2转录表达量在8℃、6h后显著升高(P<0.05),表明md2表达量升高可能活化P53;8℃、6h后P53下游靶基因bad和p21在罗非鱼鳃中出现表达量升高的情况,这与罗非鱼中6h时P53蛋白表达量升高是一致的,但在斑马鱼中p21基因表达量变化不大.研究表明,低温能诱导罗非鱼中与凋亡相关的RPL11/MDM2/P53通路中相关蛋白的变化,并且这种表达变化模式与耐低温能力较强的斑马鱼不同,这种物种差异性的基因表达模式可能是不同鱼类低温耐受能力差异的原因之一.     

双歧杆菌脂磷壁酸对胃癌SGC7901细胞SphK1表达的影响

SphK1 mRNA水平采用半定量RT-PCR检测;SphK1蛋白表达水平采用Western blot测定.研究双歧杆菌脂磷壁酸(LTA)对胃癌SGC7901细胞内鞘氨醇激酶1(SphK1)基因和蛋白表达的影响.结果表明,经200、500 μg· mL-1 LTA处理72 h后,SGC7901细胞内SphK1 mRNA...     

双酚A对雄性斑马鱼的内分泌干扰效应

为了探讨双酚A(BPA)内分泌干扰效应,研究了BPA对斑马鱼肝脏雌激素受体(Esr1 mRNA)、芳基烃水解酶受体(AhR2 mRNA)以及卵黄蛋白原(VTG1 mRNA)表达的影响.结果表明:BPA暴露12 h后,Esr1 mRNA和VTG1显著提高(P＜0.05).BPA暴露24 h后,Esr1 mRNA和VTG1 mRNA相对表达量依旧保持相当高的水平(P＜0.05).暴露48 h后,Esr1 mRNA的相对表达量继续升高.暴露72 h后,Esr1 mRNA和VTG1 mRNA相对表达量低于暴露12、24 h和48 h.暴露48 h后,AhR2相对表达量为0h的3.22倍.暴露过程中,Esr1 mRNA和VTG1 mRNA相对表达量变化一致.BPA对雄性斑马鱼的Esr1 mRNA和VTG1mRNA诱导能力较强,但对AhR2诱导能力较弱.表明BPA对斑马鱼的内分泌干扰作用存在多途径过程.     

大豆异黄酮对健康大鼠肝脏CB1R、FAAH、DGAT1表达的影响

【目的】研究大豆异黄酮(Soy isoflavone,SIF)对大鼠肝脏中大麻素1型受体(CB1R)、脂肪酰胺水解酶(FAAH)和二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT1)表达的影响,为SIF活性的研究与应用提供参考。【方法】试验选取40只6周龄SD大鼠,随机分为正常组和低、中、高剂量组,每组10只,分别按0,50,250,500mg/kg的剂量经口灌胃含SIF的羧甲基纤维素钠溶液4周后,麻醉,采血收集血清,全自动生化仪进行血液生化指标检测。解剖大鼠取肝脏组织制备石蜡切片,HE染色进行病理分析,油红O检测脂滴沉积情况,免疫组织化学、实时荧光定量PCR(以β-actin为内参基因)分别对CB1R、FAAH、DGAT1蛋白及其基因进行定量分析。【结果】与对照组相比,SIF低剂量组总胆固醇浓度显著下降(P0.05);中剂量组总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白浓度显著下降(P0.05);高剂量组总胆固醇和低密度脂蛋白浓度极显著下降(P0.01)。各组大鼠肝脏组织学结构正常,均未见异常病理变化。SIF中、高剂量组肝脏脂滴沉积极显著减少(P0.01)。与对照组相比,SIF低剂量组大鼠肝脏中FAAH蛋白的表达量显著增多(P0.05),中、高剂量组CB1R、FAAH和DGAT1蛋白表达量均极显著增多(P0.01)。与对照组相比,SIF低剂量组大鼠肝脏CB1R、FAAH、DGAT1 mRNA表达量均显著降低(P0.05),中、高剂量组CB1R mRNA表达量显著增多(P0.05),高剂量组FAAH mRNA表达量极显著增多(P0.01)。【结论】SIF可影响肝脏内CB1R、FAAH、DGAT1的表达,且存在明显的剂量差异。     

桑叶在肉牛瘤胃中的降解特性研究

为明确桑叶在肉牛瘤胃中的降解率及饲用价值,试验以桑叶为研究对象,选用6头装有永久性瘤胃瘘管的肉牛,采用尼龙袋法,研究桑叶在肉牛瘤胃中停留时间为6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h的降解变化。结果表明,桑叶营养成分丰富,其粗蛋白含量较高,达到20.64%;其干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的降解率均随在瘤胃停留时间的延长而增大,大体上,24 h~72 h的降解率与24 h前的降解率变化差异显著(P0.05);24h之后,降解率变化较为平缓,72 h降解率最大。24 h时干物质的降解率为81.49%、粗蛋白的降解率为88.72%、中性洗涤纤维的降解率为72.59%,酸性洗涤纤维的降解率为18.94%。     

腺苷甲硫氨酸对成肌细胞成脂分化及脂肪沉积的影响

【目的】以小鼠成肌细胞（C2C12）为模型探讨蛋氨酸代谢产物腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine,SAM）对肌肉来源的多能干细胞成脂分化及脂肪沉积的影响。【方法】分别用含有0、0.25、1.0和2.0 mmol•L-1 SAM的培养基处理细胞,在处理后的0、24、36和48 h分别对各处理组细胞进行油红O染色观察细胞形态并测定光密度（OD）值;在处理后第2天收集细胞总RNA与总蛋白,分别用RT-PCR和western blotting方法检测细胞成脂相关基因的mRNA与蛋白表达水平。【结果】经SAM处理后,细胞表现出脂肪细胞的形态特征;细胞内脂肪沉积水平上升,并且随SAM处理浓度的升高呈现出剂量依赖效应;细胞的脂肪特异性基因PPARγ、C/EBPα的mRNA及蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）;其它特异性基因aP2、FAS及SREBP-1的表达在经SAM处理后呈剂量依赖性升高（P＜0.05）,其中2.0 mmol•L-1 SAM处理组升高最为显著,三者mRNA表达水平分别上升了6.86（P＜0.01）、3.45（P＜0.05）和3.48（P＜0.01）倍。【结论】SAM可以促进C2C12细胞成脂分化及细胞内脂肪的沉积。     

鸡原代肝细胞培养及叶酸对脂质代谢相关基因表达的影响

【目的】腹脂沉积是目前家禽养殖过程中的一个普遍现象。与哺乳动物不同,家禽的脂质代谢主要发生在肝脏,前人很多研究发现叶酸和IGF2均参与调控动物的脂质代谢,因此,试验旨在建立鸡原代肝细胞培养条件,并研究叶酸对鸡原代肝细胞脂质代谢相关基因表达的影响,为体外探究叶酸调控家禽脂质代谢机制提供依据。【方法】采用胶原酶消化配合鸡淋巴细胞分离液纯化法分离得到鸡原代肝细胞,用高碘酸希夫氏染色方法进行肝细胞鉴定;同时分离得到的肝细胞用正常培养基培养36 h后,更换含不同叶酸浓度的培养基(0,1,5,10,15,和20 mg·L~(-1)),每个叶酸浓度6个重复,处理12 h后收集上清液,并收集细胞提取总RNA,用RT-q PCR法检测基因相对表达量,MTT法检测细胞增殖,商业试剂盒方法检测上清液中LDH含量。并分析基因表达之间的相关性以及叶酸剂量与基因表达之间的回归关系。【结果】采用胶原酶消化配合鸡淋巴细胞分离液纯化法可以获得分离效果好且纯度高的鸡肝细胞;不同剂量的叶酸没有影响肝细胞培养液中的LDH活性(P0.05),也没有对肝细胞的增殖产生影响(P0.05);与1 mg·L~(-1)剂量的叶酸对照组相比,10、15和20 mg·L~(-1)的叶酸显著降低了肝细胞IGF2以及与脂质合成代谢有关的ACC和FAS基因的表达(P0.05),但叶酸并没有对鸡肝细胞中与脂质分解代谢有关的CPT1和PPARα基因的表达产生影响(P0.05);并且鸡肝细胞中ACC和FAS基因的表达与IGF2存在一定的正相关(P0.05);除此之外,鸡肝细胞IGF2,FAS和ACC的表达与叶酸剂量也存在着线性和二次曲线的回归关系(P0.05)。【结论】叶酸的添加可降低鸡原代肝细胞中与脂肪酸合成相关基因的表达,并且FAS和ACC基因的表达可能与IGF2具有正相关关系;本试验中叶酸的最适剂量为15 mg·L~(-1)。     

槲皮素对肉鸡脂肪细胞脂质代谢作用

文章以肉鸡脂肪细胞为模型,探讨槲皮素对过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)调节脂质代谢作用。试验分对照组(5%培养液)、DMSO对照组(5%培养液+DMSO)、试验组1(5%培养液+10 mg.L-1槲皮素)、试验组2(5%培养液+20 mg.L-1槲皮素)、试验组3(5%培养液+40 mg.L-1槲皮素)。采用ELISA法检测脂肪细胞加槲皮素培养24、48、72 h后PPARγ、脂肪酸合成酶(FAS)、脂蛋白酯酶(LPL)、脂肪酸转运蛋白1(FATP1)、瘦素(leptin)蛋白含量,利用荧光定量PCR检测PPARγ、FAS、FATP1和LPL mRNA表达,利用酶法检测脂肪细胞甘油三酯(TG)含量。结果表明,与对照组相比,24 h,试验组3 PPARγmRNA表达显著降低(P<0.05);试验组1、2和3FATP1 mRNA表达均显著降低(P<0.05);试验组3 FAS mRNA表达显著降低(P<0.05),而试验组1和2有降低趋势(P=0.052),而试验组3 FAS蛋白含量显著降低(P<0.05);试验组2和3 TG含量均显著降低(P<0.05);试验组3leptin含量显著提高(P<0.05)。48 h,试验组3 PPARγmRNA表达显著降低(P<0.05),而试验组1和2有下降趋势(P=0.053),试验组1、2和3 PPARγ蛋白含量均显著降低(P<0.05);试验组1、2和3 LPL mRNA均显著降低(P<0.05);试验组1、2和3 FAS mRNA表达有下降趋势(P=0.05),而试验组2、3FAS蛋白含量均显著降低(P<0.05);试验组1、2和3 FATP1 mRNA表达和蛋白含量均显著降低(P<0.05);试验组1、2和3TG含量均显著降低(P<0.05);试验组1、2和3 leptin含量均显著提高(P<0.05)。72 h,试验组1、2和3 PPARγmRNA表达和蛋白含量均显著降低(P<0.05);试验组2 LPL mRNA显著降低(P<0.05);试验组3 FATP1 mRNA表达显著降低(P<0.05),而试验组1和2有下降趋势(P=0.057),试验组1、2和3 FATP1蛋白含量均显著降低(P<0.05);试验组1、2和3 FASmRNA表达均显著降低(P<0.05),而试验组3FAS蛋白含量显著降低(P<0.05);试验组1、2和3TG含量均显著降低(P<0.05);试验组1、2和3 leptin含量均显著提高(P<0.05)。综上所述,槲皮素可以抑制脂肪水解、跨膜转运和脂肪胞内沉积,从而抑制脂肪细胞脂肪合成代谢,但作用效果未见槲皮素浓度和时间依赖性。即槲皮素可抑制鸡脂肪细胞PPARγ调节脂肪合成代谢,进而减少肉鸡脂肪沉积。     

斑马鱼不同发育时期血管内皮生长因子受体2基因表达的实时定量PCR分析

[目的]探讨血管内皮生长因子受体2（VEGFR2-）基因在斑马鱼不同发育时期的表达。[方法]分别从12、24、48、72和96 h的斑马鱼胚胎和仔鱼中提取总RNA,用实时定量RT-PCR方法检测VEGFR2-基因表达,采用2^-△△Ct法进行数据分析。[结果]VEGFR2-基因表达量在12-72 h呈上升趋势,在96 h有所下降。12 h表达量最低,72 h表达量最高,与其他发育期均有显著差异。[结论]斑马鱼血管发育至72 h达成熟阶段。血管发育成熟前,VEGFR2-基因表达水平逐步增长;血管发育成熟后,VEGFR2-基因表达水平下降。     

Effects of Yimu Shenghuasan Preparation on the Cytochrome P450 in Endometrial Cells and Immune Function of Dairy Cows

In order to investigate the mode of action ofYimu Shenghuasan preparation in endometrial cells of dairy cows, the primary cultured endometrial cells in cows were isolated and the inflammatory models were made by lipopolysaccharide （LPS） induction. The inflammatory cells were treated with gradient concentration of herbal medicine preparation, Yimu Shenghuasan for 48 and 72 h. The expression of cytochrome P450 （CYP450） was detected by Western blot. The amounts of IgG and lgA in sera were also detected in the endometritis of dairy cows. The expression level of CYP450 in the endometrial cells of dairy cow was increased gradually, and the amounts of IgG, IgA were increased significantly as compared with those in the control group. The expression level of CYP450 in the inflammatory cells was increased significantly in the treatment of 2 000 μg mL^-1 of Yimu Shenghuasan after 48 h of treatment.     

左归降糖益肾方含药血浆对高糖培养小鼠足细胞凋亡的影响

目的 探讨在高糖作用下,体外培养的小鼠足细胞凋亡及bax、bcl-2表达水平的变化,及左归降糖益肾方含药血浆的调控作用。方法 将体外培养的小鼠足细胞随机分为空白组（A组,25 mmoL/L葡萄糖,10%空白血浆）、高糖组（B组,200 mmoL/L葡萄糖,10%空白血浆）、左归降糖益肾方含药血浆组（C组,200 mmoL/L葡萄糖,10%含药血浆）,4-苯基丁酸（4-PBA）含药血浆组（D组,200 mmoL/L葡萄糖,10%含药血浆）。采用间接免疫荧光细胞化学法检测足细胞凋亡情况;MTT自动比色法检测足细胞活力,蛋白质印迹法和逆转录-聚合酶链反应法分别检测bax及bcl-2蛋白或mRNA表达水平的变化。结果 与A组相比,B组足细胞活力降低,bax及 bcl-2蛋白或mRNA的表达水平均升高（P<0.01）;与B组相比,C组、D组足细胞活力升高,bax蛋白或mRNA的表达水平均降低（P<0.05或P<0.01）,bcl-2蛋白或mRNA的表达水平均升高（P<0.01）;与C组比,D组足细胞活力升高（P<0.05）,但bax及bcl-2蛋白或mRNA的表达水平,差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 bax及bcl-2蛋白或mRNA表达水平的升高,是足细胞损伤的分子机制之一;左归降糖益肾方含药血浆可以通过影响bax及bcl-2蛋白或mRNA的表达水平,从而抑制足细胞凋亡。     

阻断大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化与肿瘤发生相关性研究

【目的】分析骨髓间充质干细胞在体外定向分化为脂肪细胞的适宜诱导条件.阻断正常干细胞的分化过程,探讨肿瘤发生机理.【方法】利用贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),通过地塞米松、胰岛素和吲哚美辛联合诱导大鼠BMSCs,使其分化为脂肪细胞.在细胞分化过程中利用3-甲基胆蒽(3-MC)阻断大鼠BMSCs的分化过程.【结果】大鼠BMSCs分化试验显示:诱导30d后经油红O染色,细胞内可见脂肪细胞特有的红色脂滴沉淀,并且随着诱导时间的延长,油红O阳性细胞比例增加,脂滴增大,表明大鼠BMSCs已成功分化为脂肪细胞.大鼠BMSCs分化阻断试验显示:诱导30d后经油红O染色细胞内红色脂滴沉淀明显下降,表明阻断后的细胞具有脂肪细胞的特性,但分化不完全;形态学鉴定表现出:细胞接触抑制消失,细胞核异常,微核畸变率高,核型异常,表明阻断后的干细胞发生恶性转变.【结论】通过地塞米松、胰岛素和吲哚美辛的联合作用,诱导BMSCs成功向脂肪细胞分化.在BMSCs向脂肪细胞分化的过程中加入阻断剂3-MC,阻断其分化过程,表明干细胞分化过程受到阻断,细胞停止在分化的中间阶段,有转化成肿瘤细胞的趋势.     

隐丹参酮对人胆管癌HCCC-9810细胞增殖、survivin基因及caspase-3蛋白表达的影响

目的 了解隐丹参酮对人胆管癌HCCC-9810细胞增殖及凋亡相关因子surv1vin、caspase-3表达的影响.方法 HCCC-9810细胞用不同浓度隐丹参酮处理24、48、72 h,分别用MTT法、RT-PCR、Western blot检测细胞生长及survivin mRNA、caspase-3蛋白表达.结果 隐丹参酮抑制HCCC-9810细胞增殖;随时间延长,HCCC-9810细胞中survivin mRNA表达逐渐降低,而caspase-3蛋白表达逐渐增高(P＜0.05).结论 隐丹参酮可通过下调survivin基因表达及上调caspase-3蛋白表达来诱导HCCC-9810细胞凋亡.     

猪骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定及其生物学特性

【目的】建立猪骨骼肌卫星细胞体外分离、纯化及鉴定的方法,并对其生物学特性进行探讨,为进一步研究猪肌肉生长发育提供良好的细胞模型。【方法】选取1日龄仔猪背最长肌为材料,无菌状态下将背最长肌剪碎为肉糜状。此后采用浓度为0.2%的Ⅰ型胶原酶消化90 min,再加入浓度为0.25%的胰蛋白酶37 ℃联合消化30 min。经终止消化、过滤、重悬后将分离得到的细胞置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养。选用反复差速贴壁法对骨骼肌卫星细胞进行纯化,第一次纯化选择在细胞接种2 h后,将未贴壁细胞转移至新培养皿。上清液继续培养18 h后,对卫星细胞进行第二次差速贴壁纯化。当细胞密度达70%—80%时可对细胞进行传代或冻存处理。利用细胞免疫荧光技术检测P2代卫星细胞标志基因Pax7、MyoD的蛋白表达情况,并绘制卫星细胞生长曲线。分别添加不同诱导分化液使卫星细胞定向分化为肌细胞、脂肪细胞、成骨细胞,检测成肌分化标志基因MHC的免疫荧光,鉴定卫星细胞肌管形成情况;油红O染色及油红O定量鉴定卫星细胞诱导成脂分化效果;茜素红染色鉴定卫星细胞成骨分化能力,qRT-PCR检测成肌、成脂、成骨进程中关键基因的表达。【结果】通过两步酶消化和反复差速贴壁法分离纯化得到了纯度较高的卫星细胞,刚分离的细胞折光性强,贴壁后呈梭形或纺锤形,此后细胞延展并开始快速增殖。卫星细胞特异标志蛋白Pax7、MyoD细胞免疫荧光鉴定结果呈阳性,表明分离细胞为骨骼肌卫星细胞。骨骼肌卫星细胞增殖过程经潜伏期、生长期最终达到平台期,细胞生长曲线呈“S”型。当细胞生长至90%密度时,卫星细胞会出现自融合现象。对分离的骨骼肌卫星细胞成肌诱导分化后,可见邻近卫星细胞融合形成大量粗长肌管,多核肌管呈方向性排列,成肌标志蛋白MHC染色呈阳性。qRT-PCR结果显示标志基因MyoD、MyoG在成肌诱导分化过程中二者均呈先上升后下降趋势。经成脂诱导后细胞形态变为三角形,连续诱导发现脂滴出现并聚集成大脂滴,油红O染色可见大量红色葡萄样脂滴。油红O定量检测结果表明,成脂诱导过程中甘油三酯含量呈稳步上升趋势,各时间点均存在极显著差异（P<0.01）。qRT-PCR结果显示,PPARγ基因表达量在诱导中后期高表达;FABP4在诱导分化第6天达到最高,极显著高于其余时间点（P<0.01）;CEBP/β和HSL表达趋势一致,均呈先升高后降低趋势。诱导成骨分化后,发现细胞形态变为不规则状,诱导后期细胞复层生长形成骨钙结节,茜素红染色可见圆形不透明钙化结节,数量和密度较未诱导时期都明显增加,结果表明细胞出现成骨向分化。成骨标志基因BGLAP、RUNX2的表达量也随诱导进程呈稳步上升趋势,相比未诱导细胞差异极显著（P<0.01）。【结论】建立了基于联合酶消化和反复差速贴壁实现猪骨骼肌卫星细胞分离和纯化的方法,所得细胞增殖能力强且具有多向分化潜能,为猪骨骼肌卫星细胞作为种子细胞用于未来组织工程研究提供了技术平台。