基因重组酵母细胞检测养殖场污水中环境雌激素

用细胞生物学分析方法，对某养殖场污水处理厂水样中的类雌激素活性进行了分析，其中处理前水样6份，处理后水样9份。水样中的雌激素类化合物分别用大孔树脂富集，依次用丙酮、甲醇、乙醚洗脱，洗脱液经水浴蒸发挥干并用二甲亚砜定容。用重组人雌激素受体酵母细胞测其类雌激素活性，报告基因为编码β-半乳糖苷酶的Lac Z基因。结果发现，处理前水样雌激素活性较高，而处理后水样对β-半乳糖苷酶的诱导水平较低。经17β雌二醇（E2）标准曲线换算成雌二醇当量，发现处理前水样雌激素活性在0．0001至0．15nmol·L^-1 E2当量，而处理后水样雌激素活性明显下降，有17个水样雌激素活性低于检出限，这说明畜牧厂污水中的雌激素类化合物通过污水处理厂处理后可下降。     

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

【目的】研究耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达,并检测其酶学性质,为耐热β-半乳糖苷酶的应用和工业化生产奠定基础。【方法】利用基因工程的原理和方法,将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆到大肠杆菌pET表达系统(pET-28a(+)),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。将构建的重组菌(pET28a-bgaB)在含硫酸卡那霉素的液体LB培养基中以IPTG为诱导剂,对表达产物的最适反应温度、最适反应时间I、PTG诱导浓度、热稳定性及酶促动力学进行检测。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bgaB,并测得耐热β-半乳糖苷酶的最适反应温度为65℃,最适反应时间为6 h,IPTG的最佳诱导浓度为1 mmol/L,且具有良好的热稳定性;在诱导后6 h,耐热β-半乳糖苷酶的表达量占菌体总可溶性蛋白的20%,表达效率较高;对透析蛋白进行蛋白质定量,蛋白质量浓度为0.75 mg/mL,透析蛋白的耐热β-半乳糖苷酶活性为75 U/mL,比活性为100 U/mg;酶促动力学研究表明,耐热β-半乳糖苷酶的反应常数为0.398μmol/mL,最大反应速度为27.435μmol/(min.mL)。【结论】耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中得到成功表达,并且在很大程度上提高了耐热β-半乳糖苷酶的活性。     

报告基因在柞蚕幼虫体内表达的研究

利用柞蚕核型多角体病毒 (Antheraea pernyi Nuclear Polyhedrosis Virus, ApNPV)作为载体研究了报告基因 (β-半乳糖苷酶基因 )在柞蚕幼虫体内的表达.结果表明重组 ApNPV能够使柞蚕幼虫产生典型的脓病病症,但不形成多角体.柞蚕核型多角体病毒作为表达载体能够使β-半乳糖苷酶基因在柞蚕幼虫体内得到高效表达.雌性幼虫个体的表达量为 2.4× 107u,雄性幼虫个体的表达量为 1.8× 107U;雌性个体较雄性个体在表达时相上早 96h;对于同一个体,组织细胞中β-半乳糖苷酶的含量较血淋巴上清液中β-半乳糖苷酶的含量高. SDS- PAGE结果显示 ,所表达的β-半乳糖苷酶分子量为 116kD.     

植物β-半乳糖苷酶研究进展

植物β-半乳糖苷酶是一类糖苷水解酶,能够从β-D-半乳聚糖或寡聚糖支链非还原末端切除β-D-半乳糖残基。β-半乳糖苷酶广泛分布于各种植物中,通过对细胞壁的重塑参与植物生长发育过程。总结了植物β-半乳糖苷酶生化与分子生物学方面的最新研究进展,并就其结构域及催化机制、生化特性、亚细胞定位和表达模式、生理功能等方面展开详述。     

集胞藻PCC6803染色体上relNEs(ssr1114/slr0664)TA系统的反馈调控作用

细菌染色体上的毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统通过转录水平和转录后水平调控毒素活性,从而控制细胞的生长速度和死亡,使细菌适应各种环境胁迫。为了证明集胞藻PCC 6803染色体上relNEs TA系统的转录调控,构建了以无启动子的β-半乳糖苷酶(lacZ)基因为报告基因的重组质粒,并测定含转录融合重组质粒的大肠杆菌细胞的β-半乳糖苷酶活性。结果表明,抗毒素RelN能显著抑制relNEs启动子的转录活性,而毒素RelEs能部分减弱这种抑制作用,提示relNEs系统的编码产物对该操纵子具有反馈调控作用。     

基于α-半乳糖苷酶基因为筛选标记的酿酒酵母诱导型表达载体的构建及应用

以α-半乳糖苷酶基因为筛选标记,构建GAL1诱导型启动子介导的酿酒酵母表达载体YGM-α-gal质粒,将枯草芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆到此载体中,构建质粒YGMPA-α-gal,转化宿主酵母后,实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母中的分泌表达.结果表明:在2%半乳糖诱导下,摇瓶发酵24h后分泌表达的β-葡聚糖酶活性达到411.9U爛mL-1,而在培养60h后,发酵液中α-半乳糖苷酶活性可达64.2U爛mL-1.说明α-半乳糖苷酶基因可用作酿酒酵母表达载体转化的有效筛选标记,为食品级酿酒酵母表达系统的构建提供了新选择.     

雌激素调控的绿色荧光蛋白在酵母细胞中的表达

采用绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因,用酵母细胞构建环境雌激素(EEH)的评价体系,可敏感、快速、方便地筛选出EEH化合物。通过分子生物学技术,将GFP基因插入到pM P 206/ERE启动子CYC 1的下游,用GFP取代L ac Z基因,并转化于酵母细胞。DNA测序发现ERE-CYC 1-GFP框架正确。对转化子进行PCR鉴定,发现有雌激素受体基因(hER cDNA)和GFP基因特异条带,说明hER cDNA和GFP已重组于酵母细胞。荧光显微镜下发现大量的绿色荧光颗粒,表明GFP基因在酵母细胞中成功表达。酵母细胞经不同浓度雌二醇作用后,与GFP表达量有剂量效应关系。与其他酵母评价体系相比,以GFP为报告基因评价EEH不需要破坏细胞壁,也不需要底物,可在96孔板中完成,这为高通量筛选EEH化合物奠定了基础。     

酵母α-半乳糖苷酶组成型表达基因的重组构建及转化

用PCR方法从酿酒酵母AH109中扩增出α-半乳糖苷酶MEL1基因片段，与乙醇脱氢酶组成型启动子重组后构建成表达重组质粒pGAD-GAL,将重组质粒pGAD-GAL转化不带α-半乳糖苷酶基因的酿酒酵母后，在预先涂布有X-α-Gal的亮氨酸缺陷培养基(SD／-Leu)平板上选择到蓝色菌落，实现了α-半乳糖苷酶在酵母内的组成型表达。     

低温β-半乳糖苷酶的研究进展

低温β-半乳糖苷酶在低温下仍保持高酶活,而具有高活性的低温β-半乳糖苷酶应用于环境工程和食品行业,有着中温和高温β-半乳糖苷酶所没有的优越性,尤其在乳品工业,可在低温下水解乳糖,生产无乳糖乳制品,供乳糖不耐受者食用.而低温β-半乳糖苷酶因其具有的理论和应用上的双重意义,成为近年来的研究热点.综述了微生物低温β-半乳糖苷酶的研究现状,包括酶的微生物来源,分离筛选、分类特征、酶学性质、分子结构及定向进化,并对其前景进行了展望.     

低温β-半乳糖苷酶的分离纯化

[目的]分离纯化低温β-半乳糖苷酶。[方法]采用硫酸铵沉淀、凝胶色谱和离子交换色谱对低温菌株Rahnella aquatilis sp.14-1在摇瓶条件下的所产低温β-半乳糖苷酶进行了纯化,并对提纯的酶进行了酶学性质的研究。[结果]摇瓶发酵液经过超声波破碎细胞得到粗酶液体,用硫酸铵分级沉淀,Sephadex G-25凝胶层析和DEAE-cellulose离子交换色谱分离纯化得到低温β-半乳糖苷酶,用SDSPAGE检测显示电泳单一区带,纯化的酶分子量为60 kD。[结论]研究可为低温β-半乳糖苷酶的开发应用提供参考依据。     

小鼠子宫内膜雌激素受体表达规律的研究

为探讨雌激素对子宫内膜容受性的影响,实现主动干预子宫内膜容受性、提高体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的成功率,本研究利用免疫组化法检测了雌激素受体在小鼠发情周期子宫内膜中的表达规律.结果显示,自然发情受孕组、自然发情假孕组(对照组)和超数排卵组小鼠在见栓后第2天,子宫内膜上雌激素受体(ER)表达量3组之间差异不显著(P＞0.05);之后的第4、6、8天,超数排卵组雌激素受体表达量显著高于其他2组(P＜0.05);自然发情受孕组小鼠子宫内膜中ER的表达在第4、6天时显著高于自然发情假孕组(P＜0.05),在第8天时,自然发情受孕组小鼠子宫内膜中的ER阳性率与自然发情假孕组差异不显著(P＞0.05).与自然发情受孕组相比,自然发情假孕组和超数排卵组小鼠子宫内膜容受性下降,窗口期开放延迟,而自然发情假孕组和超数排卵组差异不明显(P＞0.05).以上结果表明,雌激素通过ER对小鼠胚胎着床及窗口期子宫内膜容受性变化具有调节作用.     

雌激素及其受体对雄性哺乳动物生殖的作用

对雌激素及雌激素受体(ERs)在雄性动物生殖器官中产生、表达部位,ERs的结构,ERs在雄性生殖系统中的分布、作用机理和在生殖中的作用进行概述,以期能对同类研究提供参考依据。     

人雌激素受体cDNA在酵母细胞中的表达

根据人全长雌激素受体cDNA序列,用RT—PCR方法使乳腺癌细胞MCF-7株扩增人雌激素受体基因(hER cDNA),通过pGEM—T／hER载体克隆到酵母表达载体中,并转化到酿酒酵母细胞中,用Western blot法和免疫组化法检测hER cDNA的表达。结果表明：hER cDNA在酵母细胞中成功表达,可用于建立环境雌激素的酵母细胞检测体系。     

雌激素与尼古丁对软骨细胞基质代谢影响

雌激素和尼古丁是2种对骨关节炎发病有影响的重要因素,但其影响的具体分子机制仍然存在争议。本研究旨在探讨这2种因素单独和叠加对软骨细胞代谢的影响,从而为骨关节炎的发病机制研究提供一定的参考。鼠胚胎瘤来源的软骨前体细胞系ATDC5在进行铁硒传递蛋白ITS定向诱导能够分化为软骨细胞。研究中对诱导后获得的软骨细胞用雌激素及尼古丁进行了处理。处理后细胞胞外基质蛋白聚糖和二型胶原表达水平分别用甲苯胺蓝染色和免疫组化进行检测,蛋白表达水平和mRNA水平分别进行了Western blot和Real-time PCR验证。研究结果显示尼古丁会造成软骨细胞2种胞外基质分泌的降低,并且促进分解酶MMP13的表达,抑制合成相关蛋白BMP-7的表达。而雌激素能够通过抑制分解酶MMP13和促进基质合成相关蛋白BMP-7的表达来挽回尼古丁对软骨细胞胞外基质的破坏作用。但在mRNA水平,与仅用尼古丁处理相比,雌激素会同时促进mmp13和bmp-7的表达,推测是因为雌激素增强了细胞的代谢效率。这些结果表明,雌激素对受到尼古丁影响的软骨细胞具有保护作用,这可能是骨关节炎初期防治的一个潜在治疗方案。     

鸡粪中雌激素的检测及微生物降解

为检测鸡饲料和鸡粪中雌激素，优化其微生物降解条件，应用高效液相色谱（HPLC）法检测蛋鸡饲料和鸡粪中的雌激素，利用11种高效降解雌激素的单一菌株和等体积混合得到的菌群开展雌激素的降解实验。结果表明：只有蛋鸡鸡粪中含有雌二醇（E2），含量为230 ng·g^-1。微生物菌群的降解率高于单一菌株，在27℃下，10 d内能够降解76%的E2。研究表明，蛋鸡鸡粪中有雌激素存在，微生物菌群对雌激素的降解率高于单一菌株。     

雌激素对大鼠脑重量的影响

为了研究雌激素对脑重量的影响,对雌激素下降或去除的老年和去卵巢大鼠补充17β-雌二醇,结果发现,老年和去除卵巢大鼠的平均脑重较之青年大鼠和假手术大鼠显著降低(P<0.05或P<0.01)。而补充外源性17β-雌二醇后,脑的重量有显著增加,基本恢复其正常状态。这些结果表明雌激素对神经元结构和功能的维持是必须的,且对神经元具有营养和保护作用,能够维持其脑的重量,延缓或阻止其重量的降低。     

雌激素对大鼠小脑神经元生长发育的影响

    为了观察雌激素对离体培养神经元的生长发育及神经分泌的影响,取1日龄SD大鼠,对小脑神经细胞进行培养,通过补充17β-雌二醇观察神经细胞生长发育情况及运用免疫组织化学SP法研究雌激素受体(ER)、神经生长因子(NGF)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)的表达变化结果表明,雌激素对体外培养小脑神经元的生长、发育影响显著,可促进胞体的生长、突起的伸长;延长培养神经元的存活时间,阻止神经元的退化、萎缩和死亡雌激素对体外培养小脑神经元的神经分泌功能影响显著,可促进培养神经元ER、NGF和ChAT的表达,显著增加ER、NGF和chAT阳性神经元的数量并呈现出培养时间依赖性的变化说明雌激素通过ER可直接或间接地作用于培养神经元,发挥神经营养和调控神经信息传递的作用     

乳与乳制品中雌激素的分析与控制

随着生活水平的不断提高、生活节奏的不断加快,人们对牛奶、乳制品的需求也在增加,随之而来的是将乳及乳制品的安全性要求放在了首位,对乳与乳制品中激素问题也越来越关注,特别是雌激素。本文对乳与乳制品中雌激素的来源、危害、含量、检测、国家控制等方面进行了分析。     

雌二醇对大鼠下丘脑神经激肽B表达的影响

为研究雌二醇(Estradiol,E2)对大鼠下丘脑神经激肽B(Neurokinin B,NKB)表达的影响,采用免疫组化PV-9003二步法以及DAB显色技术,对外源性E2处理组(E2组)、花生油处理组(C组)、卵巢摘除+E2组(OVX+E2组)和卵巢摘除组(OVX组)大鼠下丘脑的NKB进行检测。结果表明:大鼠阴门开启时间E2组(29.00±0.707)与OVX+E2组(30.20±0.084)早于对照组(43.60±2.074)(P0.01)。NKB主要分布于所有大鼠下丘脑的弓状核、腹内侧核和室旁核,且OVX组和C组室周核上也有少量表达(P0.05),但各组间NKB的平均光密度值有差异,OVX组大鼠下丘脑弓状核(0.33±0.49)、腹内侧核(0.31±0.54)和室旁核(0.30±0.55)均显著高于OVX+E2、C和E2组(P0.05)。雌激素抑制大鼠下丘脑NKB的表达,NKB可能通过雌激素调节生殖作用。     

雌激素对小鼠子宫BDNF、NGF表达的影响

以21日龄雌性小鼠为研究对象,用雌激素处理一周后收集子宫,苏木素-伊红(HE)染色法观察到子宫发生水肿、内膜外膜明显增厚。提取子宫总RNA和总蛋白,通过实时荧光定量和Western-Blot方法检测雌激素对子宫中神经营养因子BDNF及NGF的表达。荧光定量结果表明:试验组BDNF表达显著升高、NGF表达显著降低。Western-Blot结果与荧光定量结果一致。这说明雌激素能够调节小鼠子宫中BDNF和NGF的表达。