加速溶剂萃取/超高效液相色谱-荧光法检测鸽蛋和鹌鹑蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留

【目的】建立鸽蛋和鹌鹑蛋中尼考(florfenicol,FF)及其主要代谢产物氟苯尼考胺(florfenicol amine,FFA)残留检测的加速溶剂萃取/超高效液相色谱-荧光检测(ASE/UPLC-FLD)法,为动物源性食品中FF和FFA残留检测提供新的安全可靠的方法。【方法】采用加速溶剂萃取(ASE)法,用乙腈﹕氨水(98﹕2,V/V)为提取剂萃取样品,用乙腈饱和的正己烷去脂进行纯化,使用由0.005 mol·L~(-1) NaH_2PO_4、0.003 mol·L~(-1)十二烷基硫酸钠和0.05%三甲胺组成的流动相供UPLC-FLD检测。【结果】鸽蛋和鹌鹑蛋中FF和FFA在定量限(LOQ)～400μg·kg~(-1)范围内,目标物的峰面积与其浓度均呈现良好的线性关系,相关系数(R~2)均大于0.999 2。样品在LOQ、50.0、100.0、200.0μg·kg~(-1)的加标水平下的平均回收率为84.69%～98.04%,相对标准偏差(RSD)均低于3.7%。鸽蛋中FF的检测限(LOD)和LOQ为4.8μg·kg~(-1)和11.2μg·kg~(-1),FFA的LOD和LOQ为1.9μg·kg~(-1)和4.8μg·kg~(-1);鹌鹑蛋中FF的LOD和LOQ为4.7μg·kg~(-1)和10.6μg·kg~(-1),FFA的LOD和LOQ为1.8μg·kg~(-1)和4.6μg·kg~(-1)。【结论】该方法快速、简单、灵敏度高,适合禽蛋中FF及其代谢产物FFA的检测。     

氟苯尼考及其代谢物在淡水小龙虾中残留消除规律的研究

本试验建立了小龙虾组织中氟苯尼考(FF)和氟苯尼考胺(FFA)残留的高效液相色谱检测方法,并采用连续6 d药浴(水温25℃)的方式,研究淡水小龙虾肌肉和肝胰脏中FF及其主要代谢物FFA代谢动力学和消除规律。检测方法是以PBS(pH 6.0)和乙酸乙酯-氨水(体积比为98∶2)作为提取溶剂,采用XTerra@RP18(5μm,4.6 mm×250 mm)反向色谱柱,利用乙腈-磷酸二氢钠缓冲液(体积比为3∶7)为流动相,流速0.8 mL.min-1,紫外检测波长224 nm。在添加20～500μg.kg-1标样时,该方法的回收率大于70%,变异系数低于7.92%。FF和FFA的检出限分别为20μg.kg-1和10μg.kg-1。残留消除试验结果表明:在药浴FF 6 d后,在组织中两种药物均检出,说明其代谢物也有出现。停药后168 h,肌肉中检测不到FFA;停药后336 h,肝胰脏中检测不到FFA残留,肌肉和肝胰脏中均检测不到FF残留。两种药物在肝胰脏的消除速率都慢于肌肉,FF的消除速率均略慢于FF和FFA总量在组织中的消除速率,肝胰脏中的FFA浓度远高于肌肉中的。FF和FFA两种药物残留总量在淡水小龙虾肌肉和肝胰脏的消除曲线方程分别是y=505.06e-0.012 9x和y=775.71e-0.010 0x、y=690.78e-0.013 5x和y=1 778.7e-0.011 1x,消除半衰期(t1/2)分别为51.33 h和62.43 h,在肌肉和肝胰脏中降至100μg.kg-1的理论时间分别为5.94 d和10.8 d。考虑到温度为影响药物代谢和残留的最主要环境因素,建议FF在小龙虾体内的休药期为270℃.d。     

氟苯尼考及氟苯尼考胺在西伯利亚鲟体内的药动学及组织分布

采用液质联用法(HPLC-MS/MS)建立了氟苯尼考和氟苯尼考胺同时检测的方法,研究了氟苯尼考口灌给药西伯利亚鲟后,氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺在西伯利亚鲟体内的药动学和组织分布。水温22℃下,氟苯尼考以15 mg/kg剂量单次口灌给药西伯利亚鲟,检测血浆、肝脏、肾脏和肌肉等组织中氟苯尼考及其代谢产物氟苯尼考胺的浓度,结果显示:氟苯尼考及其代谢产物氟苯尼考胺在西伯利亚鲟体内的药时数据均符合一级吸收二室开放模型,氟苯尼考在血浆中的达峰浓度(Cmax)为3.4μg/mL,达峰时间(Tpeak)为2.943 h,表观分布容积(V/F)为3.267 L/kg,消除半衰期(t1/2β)为31.21 h,药时曲线下总面积(AUC)为76.51μg.h/mL,Cmax(FFA)/Cmax(FF)和AUCFFA/AUCFF仅为5.44%和20.73%;氟苯尼考在各组织中分布广泛,分布规律相近,肝脏、肾脏中药物浓度较高。结果表明:氟苯尼考在西伯利亚鲟体内具有吸收迅速、达峰浓度高、消除相对缓慢及组织中分布广泛的特征且氟苯尼考主要以原形药物形式代谢消除。研究亮点:针对氟苯尼考目前广泛用于水产养殖中细菌性疾病防治的现状,本文首次采用液质联用法进行了氟苯尼考及其代谢产物氟苯尼考胺在西伯利亚鲟体内分布及代谢规律的研究。建立了比较简单的样品处理方法,并从药物本身和代谢产物整体来研究药动学及组织分布特征,为制定该药安全使用方法提供了理论基础。     

高效液相色谱-串联质谱法同时测定鸡肉中氯霉素类药物 及其代谢物残留方法的建立

建立了鸡肌肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺残留检测的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析方法。样品在碱性条件下用乙酸乙酯提取后,再用正己烷去除脂肪,MCX小柱净化,洗脱液经浓缩,0.22μm滤膜过滤后,用高效液相色谱-串联质谱测定。采用电喷雾电离正负离子切换,多反应监测(MRM)模式测定。4种药物在2～100 ng·mL-1的系列浓度范围内均呈良好线性关系,相关系数r均大于0.990。样品中氯霉素的检测限为0.1μg.kg-1,定量限为0.3μg.kg-1;氟苯尼考的检测限为0.2μg.kg-1,定量限为0.5μg.kg-1;甲砜霉素和氟苯尼考胺的检测限为1.0μg.kg-1,定量限为3.0μg.kg-1。4种药物在0.2～2.0μg.kg-1的添加浓度范围内,平均回收率为79.3%～97.3%,相对标准偏差(RSD)均小于20%。满足了鸡肉中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留的确证分析,同时对其主要代谢产物氟苯尼考胺进行了痕量监测。     

超高效液相色谱荧光法检测猪肉中甲砜霉素残留

为建立猪肉中甲砜霉素残留检测的超高效液相色谱-荧光检测(UPLC-FLD)方法,采用加速溶剂萃取(ASE)技术,全自动提取目标物,用UPLC-FLD进行测定。结果表明:猪肉中甲砜霉素添加浓度在9.4～250.0μg·kg~(-1)范围内,目标物的峰面积与其浓度均呈现良好的线性关系,线性相关系数为0.999 4。甲砜霉素添加浓度为9.4、25.0、50.0、和100.0μg·kg~(-1)时,平均回收率为85.63%～96.14%,相对标准偏为2.60%～3.05%。检测限为3.5μg·kg~(-1),定量限为9.4μg·kg~(-1)。该方法高效、灵敏、快速,为猪肉中甲砜霉素残留的检测提供了新的检测方法。     

氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺在鸡蛋中的残留消除规律

本试验旨在研究氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺在鸡蛋中的残留消除规律。预防组和治疗组蛋鸡分别按体质量以15和30 mg/kg剂量预拌料方式给予氟苯尼考粉药物,连续5 d,分别收集给药期和停药后第1、2、3、5、7、10、12、15、18天的各组鸡蛋,测定全蛋、蛋黄和蛋清中氟苯尼考和氟苯尼考胺的残留量。结果表明:全蛋、蛋清和蛋黄中氟苯尼考和氟苯尼考胺的检出限均为2μg/kg,定量限均为5μg/kg。鸡蛋样品在氟苯尼考添加水平为1.0～5.0μg/kg时平均回收率为78.9%～105.0%,日内精密度为2.22%～4.22%,日间精密度为4.22%～6.54%。停药后,氟苯尼考在预防组和治疗组蛋清中的残留量峰值(520.70、797.12μg/kg)高于蛋黄(285.96、442.40μg/kg),氟苯尼考胺在蛋黄中的残留量峰值(218.40、646.14μg/kg)高于蛋清(87.36、36.89μg/kg),氟苯尼考和氟苯尼考胺在蛋清中的消除速率均快于蛋黄。氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量及其总残留量与给药剂量呈正相关,蛋黄中以氟苯尼考和氟苯尼考胺残留为主,蛋清中主要是氟苯尼考残留。不同剂量组蛋黄中氟苯尼考残留时间为18 d。     

鸡蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留的检测技术研究

用高效液相色谱法检测鸡蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺的残留,鸡蛋样品经乙酸乙酯提取、正己烷脱脂、氧化铝柱净化、提取物蒸发浓缩至于、流动相溶解、微孔过滤,进行HPLC分析.结果表明:用该方法测得氟苯尼考和氟苯尼考胺的最低检测限值皆为5 ng/g,氟苯尼考回收率为81.0％ ～92.3％,氟苯尼考胺回收率为78.0％～ 85.3％,能够满足鸡蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量检测技术要求.     

水温和药物剂量对德国镜鲤体内氟苯尼考和氟苯尼考胺残留的影响

在实验室条件下,研究了不同水温(16、26℃)和不同药物剂量[15、45 mg/kg(鱼体质量)]下,氟苯尼考(FF)及其代谢物氟苯尼考胺(FFa)在德国镜鲤Cyprinus carpio mirror体内的残留消除规律.试验采用混饲口灌给药,在16、26℃水温条件下,以15 mg/kg(鱼体质量)剂量给药;在26℃水温条件下,以15、45 mg/kg(鱼体质量)剂量给药,于给药后0.5、1、2、4、6、8、12、24、72、120、168、216、264 h分别取鱼体肌肉、肝胰脏和肾脏组织,采用高效液相色谱荧光检测法测定鱼体各组织中FF和FFa的含量.结果表明:鱼体各组织中的FF和FFa,高温组较低温组消除快,高剂量组较低剂量组消除慢;高水温(26℃)下,用药后168 h时鱼体肌肉中的FF检测不出,而FFa浓度为36.3 μg/kg,低水温(16℃)下,用药后264 h时鱼体肌肉中的FF浓度为23 μg/kg,而FFa浓度为49μg/kg;低剂量组在用药后168 h时,鱼体肌肉中的FF和FFa的浓度之和为36μg/kg,而高剂量组在用药后264 h时,鱼体肌肉中的FF和FFa的浓度之和为59μg/kg;药物在德国镜鲤各组织中的消除顺序依次为肌肉＞肝胰脏＞肾脏.     

氟苯尼考制剂中磺胺二甲嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶检测方法的研究

为建立测定氟苯尼考制剂中非法添加的磺胺二甲嘧啶(SM2)和磺胺间甲氧嘧啶(SMM)高效液相色谱分析方法,本研究使用C18色谱柱,以乙腈-0.2%冰醋酸溶液(27∶73)作为流动相进行等度洗脱(流速1.0 mL/min);采用二极管阵列检测器,检测波长270 nm;进样量20μL。结果表明,磺胺二甲嘧啶(SM2)和磺胺间甲氧嘧啶(SMM)分别在进样浓度为31.25~500.00μg/mL和12.50~200.00μg/mL范围内呈良好线性关系(r2分别为0.9996和1.0000);平均回收率分别为98.6%(SM2)和99.8%(SMM);检出限分别为0.125μg/mL(SM2)和0.225μg/mL(SMM)。建立的方法简便、准确、可行,适用于氟苯尼考制剂中非法添加的磺胺二甲嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶的检测。     

氟苯尼考PEG6000固体分散体的制备与表征

以聚乙二醇6000(PEG6000)为载体,采用熔融法和溶剂熔融法制备氟苯尼考(florfenico1,FF)固体分散体,用红外光谱法、显微观察法、差示热分析法和溶出速率法验证固体分散体,比较FF、FF和PEG6000的物理混合物、氟苯尼考PEG6000固体分散体的溶解度,用分光光度法测定固体分散体中FF的含量.结果表明,氟苯尼考、混合物、固体分散体的差示热曲线、红外光谱和溶出速率差异很大,固体分散体的溶解度为1.118mg/mL,氟苯尼考的平均回收率为100.5%,相对标准差1.0%,FF对照品溶液浓度为50.0～350.0μg/mL时,吸光度(y)与浓度(x)线性关系良好,回归方程为y=0.0027x+0.0073,r=0.9998.氟苯尼考PEG6000固体分散体制备方法简单,质量可控,可以显著提高药物的溶解度.     

氟苯尼考在鸡粪中的降解特性研究

为探明鸡粪中氟苯尼考的降解特性,采用气相色谱法,分别研究微生物、有机质、光照、氟苯尼考起始浓度与鸡粪中氟苯尼考降解的关系,以20 ℃恒温培养箱中避光培养的未灭菌、未去有机质的鸡粪中氟苯尼考降解为对照,结果表明,对照氟苯尼考的降解半衰期为1.9 d,降解动力学方程为Ct=7.81×e-0.369 9t,11 d的降解率达95%;与对照相比,高温灭菌和去除有机质后,鸡粪中氟苯尼考的降解能力显著下降,半衰期分别提高到6.4、7.2 d;光照处理与避光处理(对照)鸡粪中氟苯尼考降解的半衰期、降解速率常数和降解速率方程均无明显差异;氟苯尼考起始含量5、10 mg/kg的半衰期差异不大,分别为1.8、1.9 d,而20 mg/kg的半衰期延长至5.6 d.     

不同温度下氟苯尼考在鳗鲡体内药代动力学的比较

采用对个体连续采血的方法,研究了不同水温条件下氟苯尼考以30 mg/kg的单剂量混饲口灌给药后在日本鳗鲡（Anguilla japonica）体内的药代动力学特征。利用DAS软件的统计矩原理计算每个个体的药时曲线关系,获得药动学参数,单因素方差分析结果表明,不同温度实验组间多个药动学参数存在显著性差异（P<0.05）。20 ℃、24 ℃和28 ℃实验组药物峰浓度（Cmax）分别为（7.839±1.125）、（13.010±2.334）和（18.267±3.717） μg/mL,达峰时间（Tmax）分别为（6.500±2.070）、（4.500±1.414）和（3.429±0.926） h,这表明温度越高吸收越多越快。表观分布容积（Vz/F）分别为（3.964±0.594）、（2.466±0.672）和（1.841±0.485） L/kg,表明温度较高时氟苯尼考与血浆蛋白的结合更多。平均滞留时间（MRT0-∞）分别为（31.503±7.117）、（22.881±4.940）和（22.134±6.204） h,消除半衰期（t1/2z）分别为（21.243±5.166）、（14.994±4.293）和（14.656±5.061） h,24 ℃和28 ℃水温下的消除速率显著快于20 ℃实验〖JP〗组。药时曲线下面积（AUC0-∞）分别为（235.580±62.013）、（271.983±75.023）和（353.192±92.491）μg·h/mL,表明水温对相对生物利用度有显著影响。     

适温条件下氟苯尼考在罗非鱼体内的药物动力学

采用HPLC-MS-MS方法,研究了给罗非鱼Oreochromis niloticus×O.caureus单次口服（12 mg/kg）氟苯尼考后其体内的药代谢规律。结果表明：氟苯尼考在罗非鱼体内吸收迅速,1 h后血液和肌肉中的药浓度均超过1.0μg/mL（mg/kg）,能够有效杀灭绝大多数水产病菌,Tmax和Cmax分别为5.05 h、6.67μg/mL和6.80 h、8.49 mg/kg,维持有效药物浓度（以MIC=1.0μg/mL计）以上的时间大于50 h,组织滞留时间较长;血液和肌肉中的t1/2β分别为11.18 h和12.67 h,药时曲线下面积分别为148.8μg/（mL.h）和225.2 mg/（kg.h）;氟苯尼考在血液中的吸收和消除速率均快于肌肉,但最高药物浓度较肌肉中低。在本试验条件下,给药59 h后罗非鱼各组织中的药物含量均低于美国FDA（1 mg/kg）及加拿大标准（0.8 mg/kg）,说明氟苯尼考具有良好的应用价值。     

气相色谱-质谱联用法测定猪肉组织中氟苯尼考残留

为建立动物组织中氟苯尼考残留量测定的可靠、灵敏的气相色谱一质谱联用分析方法．采用乙腈提取猪肉组织试样,经C18固相小柱净化,用体积分数为60％甲醇水溶液洗脱,吹干,用Sylon在50℃衍生20min后,进行检测．采用选择离子监测(m／z178、257、259)模式进行定性定量分析测定,衍生物SIM的总离子流图峰面积与试样质量浓度在5．00-1000．00μg／L范围内呈良好的线性关系,线性回归系数大于0．999,方法最低检出限达2．0t,e,／kg．猪肉组织在1．0、10．0和100．0μg／kg三水平加标平均回收率分别为88．4％、84．0％和71．2％,相应的变异系数分别为8．7％、6．8％和11．5％．同时,对氟苯尼考三甲基硅醚衍生物的Ⅱ质谱可能裂解途径进行了解析．     

氟苯尼考长效混悬注射液的研制及其质量控制

【目的】以氟苯尼考为主药,制备氟苯尼考长效混悬注射液,并对其进行质量控制研究。【方法】采用正交设计进行处方优化筛选,以助悬剂含量、润湿剂含量、研磨时间为可变因素,选用L9(34)正交设计表进行试验,以研磨分散法制备氟苯尼考混悬注射液,对其进行质量评价并建立测定氟苯尼考含量的方法。【结果】氟苯尼考长效混悬注射液的最佳处方为:氟苯尼考15 g,PVP 10 mL,蓖麻油15 mL,司盘-80、吐温-80、抗氧化剂和防腐剂各适量,再以CMC-Na溶液调节总量至100 mL。以紫外分光光度法测定氟苯尼考含量,标准曲线回归方程的相关系数为0.999 1,平均回收率为91.24%,专属性强,简单易操作。质量评价试验表明,该混悬注射液重分散性和通针性良好。【结论】所研制的氟苯尼考混悬注射液符合药典中有关混悬注射液的要求,制备方法简单可行。     

氟苯尼考对杂色鲍的急性毒性及组织毒理学

研究了氟苯尼考(florfen icol)对杂色鲍Haliotis diversicolorReeve稚鲍96 h的急性毒性,其LC50为(162.67±17.41)mg/L(95%置信限)。稚鲍中毒后的临床症状为:分泌大量黏液,附着力明显减弱,内脏团膨大,对外界刺激反应迟钝,呈麻痹状。组织切片观察结果表明:鲍消化腺和肾脏损伤严重,其它器官未见明显病变;随着浸浴时间和药物浓度的增加,消化腺中消化细胞空泡化,并与嗜碱性细胞逐渐从基膜脱落解体,管间结缔组织胶原纤维断裂,呈弥散状广泛坏死;肾腔上皮细胞萎缩,与基膜分离,腔体变小,微绒毛脱落,中毒严重时,肾上皮细胞融合,核解体消失。     

氟苯尼考缓释颗粒的制备及体外释放特性

【目的】延长药物有效血药浓度的维持时间,产生持续稳定的抑菌作用,避免多剂量连续使用氟苯尼考产生胚胎毒性和免疫抑制。【方法】以硬化油、聚乙二醇、甘油酯为辅料,采用离心喷雾干燥制粒技术法制备氟苯尼考缓释颗粒,高效液相色谱法(HPLC)测定氟苯尼考含量。以药物在不同释放介质(pH 1.2盐酸缓冲液、pH 4.3醋酸缓冲液和pH6.8磷酸缓冲液)中的释放特性为指标,对氟苯尼考粉和自制的氟苯尼考缓释颗粒进行溶出试验,考察体外释放特性。【结果】4个批次制备的氟苯尼考缓释颗粒中氟苯尼考实际含量在标示含量中的占比分别为99.19%、100.01%、97.45%和100.72%,相对标准偏差(RSD)分别为0.82%、0.86%、0.77%和0.24%。氟苯尼考粉在0.25 h内完全释放,自制的氟苯尼考缓释颗粒在模拟胃液环境(pH 1.2盐酸缓冲液)基本不释放,在模拟肠液环境(pH 4.3醋酸缓冲液和pH6.8磷酸缓冲液)缓慢释放,5 h内释放量达95%以上。【结论】自制的氟苯尼考缓释颗粒中药物分布较均匀,符合中国兽药典要求。相比于氟苯尼考粉,氟苯尼考缓释颗粒表现出良好的耐酸性体外缓释性,可为后续的临床试验研究和临床使用药物提供参考依据。