鸭α-干扰素基因疫苗肌肉注射免疫鸭抗鸭瘟强毒感染的研究

将本实验室构建的鸭α-干扰素基因疫苗(pcDNA-SDIFN-α)分别按每只50、100、200μg3个剂量肌肉注射免疫樱桃谷鸭,以PBS、空载体质粒pcDNA3.1(+)和鸭瘟弱毒疫苗为对照,免疫15d后攻击感染鸭瘟强毒,于攻毒后2h、6h、12h、24h、3d、6d、9d、14d、22d、26d、33d和40d采全血,同时取死亡鸭的各组织器官,采用实时荧光定量PCR对鸭瘟病毒在鸭外周血中的动态变化和在各组织器官中的分布及含量进行检测。结果表明:①3个剂量pcDNA-SDIFN-α和鸭瘟弱毒疫苗都对鸭产生良好保护作用,免疫鸭未发生死亡;而PBS和空载体对照组3只鸭中有1只鸭死亡,死亡鸭心、肝、脾、肾、胰和各段肠管中均检测到鸭瘟病毒DNA且其含量大于pcDNA-SDIFN-α免疫鸭外周血病毒DNA含量;②3个剂量pcDNA-SDIFN-α免疫鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量比PBS和空载体对照组低,差异显著(P<0.05),特别是在2h差异极显著(P<0.01);攻毒后24h内,3个剂量pcDNA-SDIFN-α免疫鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量均低于鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭,差异显著(P<0.05);3个不同剂量pcDNA-SDIFN-α免疫组之间外周血鸭瘟病毒DNA含量差异不显著(P>0.05),攻毒初期,200μg免疫鸭外周血鸭瘟病毒DNA含量最低,100μg次之,50μg最高。研究表明,pcDNA-SDIFN-α肌肉注射免疫鸭后能产生一定的抗鸭瘟强毒感染的作用,并在攻毒初期表现出一定的量效关系。     

实时荧光定量PCR技术在鸭胚鸭瘟病毒检测中的应用

用real_time PCR技术定量检测了鸭瘟标准强毒(DPV F37)和鸡胚化弱毒(C_KEC)疫苗毒在鸭胚中的动态分布.结果表明,F37在接种后3~45 h内胚体和绒毛尿囊膜中的病毒荷载量为7.43×10~5.01×103拷贝.μL-1,57~69 h达到平台期,为1.7×104~4.04×104拷贝.μL-1,接种后9~81 h尿囊液中的DPV荷载量始终在2.13~5.11×102拷贝.μL-1,胚体和绒毛尿囊膜中病毒荷载量高于尿囊液,病毒收获时间以接种后69~81 h为宜;C_KEC接种鸭胚后3 h尿囊液中病毒荷载量为7.6×103拷贝.μL-1,9 h下降至1.94×102拷贝.μL-1,21 h呈阴性,以后快速上升到平台期达9.16×103拷贝.μL-1;而绒毛尿囊膜在21 h前、胚体在45 h前的检测均为阴性,之后快速上升,均在69 h达到平台期,为6.40×104.μL-1及4.14×104拷贝.μL-1,C_KEC在鸭胚绒毛尿囊膜及胚体中的含量同样高于尿囊液,收毒时间以接种后69~81 h为佳;对real_time PCR与空斑法两种定量检测结果进行相关性分析,结果显示,两者存在显著的直线相关,说明Real_time PCR技术完全可以替代空斑法定量检测DPV,并可将检测时间由144 h缩短至3 h.     

鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体的研制

用DVH弱毒疫苗和DVH油乳剂苗免疫健康高产蛋鸡制备高免卵黄抗体,研究了高免卵黄抗体治疗雏鸭DVH的疗效。结果表明,高免卵黄抗体治疗DVH的疗效取决于卵黄抗体的中和效价、治疗时间和免疫途径。卵黄抗体的中和效价应达28.5以上,并且在感染DVH 24 h以内对雏鸭进行肌肉注射,免疫效果最好。     

鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体的研制

用DVH弱毒疫苗和DVH油乳剂苗免疫健康高产蛋鸡,可以制备高免卵黄抗体.高免卵黄抗体治疗雏鸭病毒性肝炎疗效的试验表明,用卵黄抗体治疗DVH的疗效取决于卵黄抗体的中和效价及治疗的时间.卵黄抗体的中和效价应达28.5以上,并且在感染DVH24 h以内对雏鸭进行肌肉注射,免疫效果为最适宜.     

绍兴鸭α-干扰素基因克隆、表达及活性测定

采用PCR法从绍兴鸭的肝组织基因组DNA中扩增出α-干扰素基因,插入pUC18载体,进行序列测定及分析;将成熟α-干扰素基因亚克隆到表达载体pET-28α( )中,并转化入大肠杆菌BL21进行表达;表达产物经复性后,进行抗病毒活性的测定.测序结果表明,该基因(sxDuIFN-α)由576个核苷酸组成,共编码191个氨基酸.该基因与GenBank公布的鸭α-干扰素基因(X84764,AB128861)的核苷酸序列同源性分别为99.3%和99.1%,氨基酸序列同源性均为97.9%.表达载体经IPTG诱导表达出相对分子量为20.7 kD的DuIFN-α.该产物经细胞病变抑制法测定,显示出具有明显的抗猪水泡性口炎病毒(VSV)及鸭瘟弱毒疫苗毒的活性.     

鸭副粘病毒弱毒株的选育

应用SPF鸡胚成纤维细胞(CEF)连续传代培育出鸭副粘病毒弱毒疫苗株,并测定该弱毒株的部分生物学特性.结果显示:该弱毒株已失去对无母源抗体番鸭的致病性,在雏番鸭体内连续肓传5代,未见毒力返强现象;对CEF的TCID50稳定在10-6.0～10-6.5·(0.1 mL)-1;无母源抗体的番鸭免疫不同代次弱毒后7 d攻击鸭副粘病毒强毒,保护率均在90％以上.结果表明该弱毒株安全性好、遗传性稳定、免疫原性强,可用于制备鸭副粘病毒病疫苗.     

雏鸭免疫RA疫苗后免疫学动态变化的研究

为探讨RA疫苗对雏鸭细胞免疫、体液免疫机能的影响,以RA油乳剂灭活苗免疫7日龄健康雏鸭,采用SPA菌体花环法、细胞培养技术及MT测定法、酸性α-醋酸萘酯(ANAE)染色法等检测方法对3、7、10、14、21日龄免疫雏鸭外周血T、B淋巴细胞的数量、增殖功能和胸腺、法氏囊、脾脏T、B淋巴细胞的动态变化进行检测.结果表明:免疫RA疫苗后的雏鸭,其外周血液和免疫器官的T、B淋巴细胞数量与增殖功能及免疫器官T淋巴细胞ANAE+率均比对照组和攻毒组高;而攻毒组比对照组明显降低.可见,以RA疫苗免疫雏鸭,对其免疫系统有较强的刺激作用,起到保护效果,而RA强毒对雏鸭的免疫系统有破坏或抑制作用.     

不同鸭坦布苏病毒病疫苗免疫效果的比较

本研究选取鸭坦布苏病毒病弱毒疫苗(ZJ407-168株、WF100株)、灭活疫苗(ZJ407株、HB株)共4种疫苗,在实验室和鸭场对不同日龄的鸭进行免疫试验,并用间接ELISA法检测免疫后不同时期的抗体。抗体检测结果发现:弱毒疫苗免疫组在免疫后2周抗体阳性率就可达到100%,而灭活疫苗免疫组在免疫后4周抗体阳性率才达90%以上。但灭活疫苗免疫组抗体持续时间长,免疫后6个月抗体阳性率还能维持在90%以上,弱毒疫苗免疫组免疫后3个月抗体阳性率已下降至60%~70%。此外,灭活疫苗免疫组检测到的抗体D值离散差异小,而弱毒疫苗免疫组检测到的抗体D值参差不齐。本研究的结果表明,弱毒疫苗免疫组产生抗体比灭活疫苗免疫组要早14 d,但灭活疫苗免疫组检测到的抗体D值整齐,持续时间较长。上述结果可为临床防疫根据不同疫苗产生抗体的特点,合理使用疫苗,制定有效的免疫程序提供依据。     

鸭坦布苏病毒感染对鸭免疫器官指数和体液免疫的影响

鸭坦布苏病毒是近年来在我国发现的可引起种（蛋）鸭高热、采食量和产蛋量骤降的新病毒。本研究以麻鸭为动物模型,测定麻鸭感染鸭坦布苏病毒后,其免疫器官指数、重组H5亚型禽流感病毒灭活疫苗和鸡新城疫病毒弱毒活疫苗诱导产生的抗体水平。结果表明,鸭坦布苏病毒感染会侵害麻鸭的免疫器官,第1～3d脾脏明显肿大,第7～10d试验组胸腺指数极显著低于对照组,第1～14d法氏囊出现萎缩;与仅免疫疫苗的对照组鸭相比,感染鸭坦布苏病毒后再注射疫苗的试验组鸭产生抗体的时间延迟、抗体的峰值降低,抗体下降加快,且在整个试验期内产生的抗体水平均低于对照组鸭的抗体水平,表明鸭坦布苏病毒感染可抑制鸭对灭活疫苗和弱毒疫苗的体液免疫应答能力。     

鸭坦布苏病毒感染对鸭T淋巴细胞转化功能的影响

以麻鸭为动物模型,测定鸭坦布苏病毒感染后鸭的T 淋巴细胞增殖转化能力.结果显示鸭坦布苏病毒感染的试验组鸭外周血淋巴细胞刺激指数呈先上升后下降再回升的趋势,其中于第3d试验组淋巴细胞刺激指数极显著高于对照组（P〈0.01）,于第5d下降至对照组水平,于第7、15d显著低于对照组（P〈0.05）,于第21d回升至接近对照组水平.以上结果表明,鸭坦布苏病毒感染鸭后7～21d会抑制鸭T 淋巴细胞的增殖转化功能,造成鸭T 淋巴细胞的免疫抑制.     

鸭瘟鸭病毒性肝炎二联弱毒疫苗的研究 Ⅲ、二联苗免疫鸭后抗体消长规律的测定

本文报道了鸭瘟鸭病毒性肝炎二联弱毒疫苗免疫不同品种成年鸭后，其血清中抗鸭瘟病毒（DPV）和鸭肝炎病毒（DHV）的ELISA抗体消长规律，从而为临床上合理地应用二联苗提供理论依据．试验结果表明，二联苗免疫鸭后抗体的消长与鸭的免疫力密切相关。并可以通过检测二联苗免疫鸭后的血清中抗DHV和DPV的ELISA抗体滴度来确定种鸭是否要进行加强免疫。当二联苗免疫鸭后血清中抗DHV的ELISA抗体滴度在1：512以下时或抗DPV的ELISA抗体商度在1：64以下时，需要进行DVH或DP的免疫．     

雏鸭感染鸭肝炎病毒后血清生化指标的动态变化

用I型鸭肝炎病毒标准毒株R85952 人工感染 3日龄雏鸭 ,于感染后 6、12、16、2 0、2 4、2 8、3 2和 3 6h分别采集感染组和对照组雏鸭的血液分离血清进行生化指标测定。结果 :血清中Na+ 、K+ 、Ca2 + 、Mg2 + 、Cl- 、P5+ 等无机盐离子浓度和BUN含量变化不明显 ,OSM的变化也不明显 ;ALT、AST和GGT均较对照组有极显著升高 (P <0 .0 1) ;GLU浓度在攻毒后 2 4～ 3 6h极显著下降 (P <0 .0 1) ;TG、CHOL和VLDL呈极显著升高 (P <0 .0 1) ,表明血糖下降和血脂升高。TBIL和DBIL分别从攻毒后 2 0和 12h开始较对照组有显著的升高 (P <0 .0 5 )。上述的试验结果提示 :雏鸭感染鸭肝炎病毒后肝脏受损最明显 ,呈现急性、坏死性肝炎的病理过程     

Ⅰ型鸭肝炎病毒鸡胚致弱毒MY株的培育及实验研究

将I型鸭肝炎分离株XC-1适应鸡胚,培育成1株毒力弱而稳定、免疫原性良好的鸭肝炎鸡胚化MY弱毒株.该毒株毒力为1011.40ELD50/0.1mL,1013.62TCID50/0.1mL;对雏鸭无致病性;在雏鸭体内连续盲传5代未见毒力返强;1日龄雏鸭用8,000 ELD)50/0.1mL的MY株致弱毒腿部肌注0.2ml免疫后3d强毒原液0.5mL/只攻击,可产生2/5的保护,第6d-21d产生完全保护,免疫后第3d、5d、6d、7d、9d、14d、21d抗DHV I的中和抗体滴度分别为10-1.38、10-1.55、10-1.64、10-1.65、10-1.68、10-1.8、10-1.89,表明MY是1株理想的鸡胚弱毒疫苗后备株;通过MY株的鸡胚的繁殖规律观察,确定该病毒的最佳收毒时间为接胚后的72h～84h,为疫苗生产条件的建立提供了依据.     

磷酸铝和鸡IL-18在新城疫F基因疫苗中的免疫佐剂作用(英文)

[目的]研究磷酸铝、鸡IL-18分子佐剂pcDNA/chIL-18对新城疫F基因pcDNA/F的免疫佐剂作用。[方法]制备每份(0.2ml/只)含有磷酸铝佐剂(90μg)、pcDNA/F(200μg)、pcDNA/chIL-18(200μg)的疫苗,将实验鸡随机分为6组,每组12只,于7d龄分别肌注新城疫灭活疫苗、pcDNA/F+pcDNA/chIL-18+磷酸铝、pcDNA/F、pcDNA/F+pcDNA/chIL-18、pcDNA/F+磷酸铝、生理盐水;21d龄时以相同剂量进行2免。分别于免疫后0、7、14、21、28d采血,用ELISA检测其抗体水平,以淋巴细胞转化试验(MTT)方法检测T细胞转化率。35d龄时用30LD50的NDV强毒进行攻毒保护试验。[结果]pcDNA/F+磷酸铝+pcDNA/chIL-18免疫组的近期攻毒保护率达8/12,明显高于pcDNA/F组的保护率4/12和pcDNA/F+pcDNA/chIL-18组的保护率6/12;在ND抗体水平上,pcDNA/F+磷酸铝免疫组、pcDNA/F+pcDNA/chIL-18免疫组与pcDNA/F+pcDNA/chIL-18+磷酸铝免疫组无差异(P>0.05),均显著低于传统疫苗免疫组(P<0.05);pcDNA/F+pcDNA/chIL-18+磷酸铝免疫组的T细胞转化水平明显高于pcDNA/F免疫组(P<0.05),而pcDNA/F免疫组与传统疫苗免疫组无差异(P>0.05)。[结论]磷酸铝和pcDNA/chIL-18佐剂共同作用能明显提高NDVF基因疫苗的免疫作用。     

新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体被动免疫持续期试验

为了确定鸭新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体被动免疫持续时间,试验取3批哈药集团生物疫苗有限公司试制的新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体,按1.0 mL·只^-1颈部皮下接种1日龄易感雏鸭,分别在注射抗体后1、3、5、7 d攻毒(抗体试验组),分析攻毒保护情况,剖检试验雏鸭,观察病理变化,同时设攻毒对照组(不接种卵黄抗体但攻毒)和健康对照组(不接种卵黄抗体也不攻毒)。结果显示:雏鸭接种卵黄抗体后1~5 d,卵黄抗体对雏鸭的攻毒保护率均在90%以上;注射后第7天的攻毒保护率为53.3%;攻毒对照组雏鸭均90%~100%发病。剖检发病雏鸭,可见肝脏和脾脏均呈典型的坏死及出血性病理变化;抗体试验组存活雏鸭剖检无病理变化;健康对照组雏鸭均100%健活,剖检无病理变化。说明注射卵黄抗体5 d内能对机体产生良好的保护作用,而7 d后保护作用大幅减弱,确定新型鸭呼肠孤病毒卵黄抗体的被动免疫持续期为5 d。     

水貂株犬瘟热病毒F基因工程疫苗的免疫特性研究

为了了解水貂株犬瘟热病毒F基因工程疫苗的免疫特性,实验将真核重组表达质粒pcDNA3.1-CDVF肌注免疫日本大耳白兔进行免疫,同时设置pcDNA3.1(+)空载体、生理盐水和犬瘟热弱毒疫苗阳性对照组.间接ELISA法检测结果显示,重组表达质粒免疫在家兔体内产生了针对CDV的特异性抗体,且抗体水平随着免疫次数和免疫剂量的增加而升高,体液免疫水平显著高于生理盐水组和空载体组,但不及弱毒疫苗对照组.淋巴细胞转化试验结果表明,重组表达质粒免疫组产生了细胞免疫,但低于弱毒疫苗组.     

银翘散对鸭试验性大肠杆菌病防治作用的研究

通过体内和体外两种方法研究银翘散抗试验性鸭大肠杆菌病的作用。体外抑菌作用测定银翘散水煎液对鸭大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.0125 g/mL;体内抑菌作用通过对15日龄雏鸭的攻毒与治疗试验,发现各组鸭的死亡数和死亡时间与给药剂量和给药时间存在剂量依赖性和时间依赖性,经X2检验,第4组(攻毒前3 d开始以10 g/kg体重连续给药)、5组(攻毒前开始7 d以1 g/kg体重连续给药)、6组(攻毒前7 d开始以1 g/kg体重连续给药)的存活率与第7组(感染对照组)比较,差异显著。试验结果表明,银翘散可以用于防治鸭大肠杆菌病。     

外源T3对鸭胚骨骼肌发育和MyoD mRNA表达的影响

甲状腺激素(thyroid hormones,THs)是体内肌肉发育的重要调节因子,MyoD在骨骼肌特异基因的转录调控,肌细胞的定向和分化中起着主要作用。为探讨三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3)对鸭胚骨骼肌生长发育和Myod mRNA表达的影响,分别注射100μL含0.25μg(注射组)和0μg(对照组)T3的生理盐水溶液到入孵前的鸭种蛋蛋清内,检测鸭胚骨骼肌发育和MyoD mRNA的表达情况。结果表明,外源T3对鸭胚胸肌率、腿肌重和腿肌率的影响不显著(P0.05),但显著提高27胚龄鸭胚的体重和胸肌重(P0.05);胸肌MyoD mRNA表达与胸肌重的变化趋势相一致,其中27胚龄注射组胸肌的表达水平显著高于对照组(P0.05);注射组腿肌MyoD mRNA表达在13胚龄显著提高(P0.05),与腿肌发育早于胸肌相一致;注射组胸肌MyoD mRNA表达与胸肌重呈显著正线性相关,胸肌率呈负相关,腿肌MyoD mRNA与腿肌重呈负线性相关。结果显示,外源T3提高了出雏前鸭胚的体重和胸肌重,可能是通过调节MyoD mRNA表达参与胸肌的生长发育。     

鸭肠炎病毒US2基因的序列测定与分析

以鸭肠炎病毒(DEV)SD-01株DNA为模板,根据GenBank上已发表的基因序列设计一对引物,利用PCR技术扩增出US2全基因,将目的条带连入pGM-T载体,得到的阳性重组质粒命名为pGM-US2并进行序列测定。将测序结果与疫苗株、鸭瘟鸡胚化弱毒疫苗(C-KCE)株和单纯疱疹病毒-1型(HSV-1)、马立克氏病病毒(MDV)、伪狂犬病病毒(PRV)的US2基因同源性进行比较,发现核苷酸和氨基酸的序列同源性分别为100%~25.8%和100%~28%。结果表明,US2基因在DEV中是完全保守的,但与其它疱疹病毒相比同源性较低。     

鸭疫里氏杆菌病的诊断与治疗

鸭是鸭疫里氏杆菌(Rimerella anatipestifer,RA)的主要宿主。本病主要感染1~8周龄的鸭,其中尤以2~3周龄雏鸭最易感,而1周龄内幼鸭和8周龄以上大鸭则少见发病。该病一年四季均可发生,冬季发病率最高,病鸭主要通过粘液、粪便等废物中排出病菌,经消化道、呼吸道和损伤的皮肤等途径传播,已成为危害养鸭业的主要细菌病。自RA发现以来,已经报道的公认的血清型有21个,养殖场同时可发生多种血清型的混合感染,RA各血清型缺少交叉保护,不同血清型对异型强毒没有保护或保护力很低,几乎所有血清型均只对同源抗血清发生特异型反应,这给本病的预防带来极大困难。目前,已研制出弱毒疫苗、灭活疫苗和中药来控制该病。