5-aza-dc和TSA对广西陆川猪体细胞核移植的影响

为探讨甲基转移酶抑制剂5-aza-dc、去乙酰基转移酶抑制剂TSA对广西陆川猪体细胞核移植效率的影响,用5-aza-dc、TSA处理供体细胞和重构胚.结果显示,5 -Aza-dc联合TSA处理供体细胞、重构胚以及连续处理供体细胞和重构胚,桑椹胚率均显著高于对照组(P＜0.05),但各组间震胚率差异不显著.说明5 -aza-dc联合TSA处理供体细胞和克隆胚能提高猪克隆胚的发育能力,尽管差异不显著.     

5-aza—dC联合TSA对不同供体细胞来源牛核移植胚胎体外发育的影响

为研究5-aza—dC和TSA提高核移植胚胎体外发育能力的作用是否有供体细胞特异性,实验选择皮肤成纤维细胞、胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞作为核供体细胞进行核移植,联合使用20nM（72h）5-aza—dc和50nM（12h）TSA处理供体细胞和重构胚,比较5-ttZa—dC＋TSA对不同供体细胞来源核移植胚胎体外发育的影响。实验结果表明,经5-azaLdC＋TSA处理后,极显著提高了3种供体细胞来源核移植胚胎的体外囊胚发育率（P〈0．01）。虽然胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞得到的发育率稍高于皮肤成纤维细胞组,但各对照组之间以及各处理组之间的体外发育率没有明显差异,5-aza—dC和TSA对核移植胚胎体外发育的影响没有供体细胞特异性。     

5-Aza-CdR 联合TSA对牛核移植胚胎体外发育及表观遗传状态的影响

【目的】探讨5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2-′Deoxycytidine,5-Aza-CdR)联合曲古抑菌素A(Trichosta-tin A,TSA)对牛核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响。【方法】以体外受精胚胎作为对照组,将部分体细胞、核移植胚胎以及体细胞联合核移植胚胎用5-Aza-CdR+TSA(5-Aza-CdR:20 nmol/L,72 h;TSA:50 nmol/L,12 h)进行处理,统计核移植胚胎体外发育率,并对2-细胞、8-细胞和囊胚阶段胚胎进行DNA甲基化和组蛋白乙酰化检测,研究5-Aza-CdR+TSA处理对核移植胚胎体外发育及其表观遗传状态的影响。【结果】与对照组相比,5-Aza-CdR+TSA单独处理供体细胞和核移植胚胎均可以显著提高克隆胚胎的囊胚发育率和囊胚细胞数(P<0.05);供体细胞和核移植胚胎均用5-Aza-CdR+TSA处理后,核移植胚胎体外发育能力进一步提高,囊胚发育率显著高于单独处理供体细胞或核移植胚胎组(P<0.05)。免疫荧光检测发现,体细胞和核移植胚胎均用5-Aza-CdR+TSA处理,不但显著降低了2-细胞和8-细胞阶段DNA甲基化水平,而且也显著增加了组蛋白乙酰化水平(P<0.05),使核移植胚胎附植前各发育阶段的表观遗传状态更接近于体外受精胚胎。【结论】5-Aza-CdR联合TSA处理供体细胞和核移植胚胎可以更明显地提高克隆胚胎的体外发育能力,改变核移植胚胎的DNA甲基化和组蛋白乙酰化水平,使它们的表观遗传状态及体外发育率更接近于体外受精胚胎。     

卵母细胞和供核体细胞质量对牛体细胞核移植效率的影响

将未成熟牛卵母细胞进行体外成熟培养,挤压法去除卵母细胞核,以牛耳成纤维细胞作为供核细胞进行体细胞核移植研究,观察形成囊胚组与未形成囊胚组平均每卵巢获卵数、卵母细胞体外成熟率、供核体细胞细胞传代次数、饥饿天数的差异。结果表明:形成囊胚组平均每卵巢获卵数(4.90枚)和体外成熟率(63.9%)均显著高于未形成囊胚组(分别为4.05枚、48.4%)。形成囊胚组供核体细胞代数(4.7代)和血清饥饿天数(4.7d)与未形成囊胚组(分别为6.1代、4.4d)无显著差异。卵巢质量和卵母细胞质量是决定能否形成克隆囊胚的重要影响因素,在供体细胞传代3～8代、饥饿1～9d的范围内,供体细胞传代次数和血清饥饿处理时间对克隆效率无显著影响。     

黑熊-牛异种重构胚最佳供体的研究

选用不同代数的黑熊成纤维细胞(3～6、7～9、10～12代)构建异种重构胚,筛选出最佳供体细胞代数,根据卵裂率、多细胞胚发育率、囊胚率评价黑熊成纤维细胞质量.结果表明,7～9代组与3～6代组、10～12代组卵裂率、多细胞胚发育率差异显著,3～6代组和10～12代组差异不显著,3组囊胚率差异均不显著.说明7～9代黑熊成纤维细胞为最佳供体细胞代数,且异种重构胚发育率最高.     

猪供核细胞不同处理对细胞凋亡及重构胚体外发育的影响

在核移植过程中,为了选择出一种最优的供核细胞处理方法,采用接触抑制、血清饥饿以及75 nmol/L曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)3种方法分别对猪体细胞进行处理。通过AnnexinV-FITC法检测3种处理对细胞凋亡的影响,并将3种方法分别处理过的体细胞作为供核细胞,利用体细胞核移植技术(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)研究供核细胞不同处理方法对猪重构胚体外发育能力的影响。结果表明:接触抑制和75 nmol/L TSA处理组对细胞的早期凋亡、晚期凋亡以及细胞坏死率同对照组比较差异不显著,而血清饥饿处理组无论是早期凋亡、晚期凋亡还是细胞坏死率均显著高于对照组。3种方法处理供核细胞,接触抑制处理组卵裂率同血清饥饿处理组比较,差异不显著,但是其显著高于75 nmol/L TSA处理组。3种方法处理的重构胚囊胚率差异不显著。接触抑制方法处理供核细胞相对于其他2个处理组更有利于重构胚的体外发育。     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎研究

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胞（80.56%）相比无显著差异（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,能够成功克隆出转基因胚胎,并获得转基因囊胚。     

供体细胞来源及预处理对牛体细胞核移植效率的影响

以牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体细胞,比较了不同同步化诱导方式(血清饥饿法与接触抑制法)、供体细胞冷冻与否、供体动物性别与年龄等因素对体细胞核移植效率的影响。结果表明,接触抑制法处理的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于饥饿法(P<0.05);未冷冻的供体细胞核移植胚囊胚率显著高于冷冻供体细胞(P<0.05);成年母牛供体的囊胚率显著高于成年公牛(P<0.05);不同年龄供体细胞的核移植胚囊胚率差异不显著(P>0.05)。试验表明,以接触抑制法诱导未冷冻成年母牛外耳皮肤成纤维细胞为核供体,有利于核移植胚囊胚的发育。     

G418处理核供体细胞对猪克隆胚胎体外发育效率的影响

【目的】探索G418处理供体细胞对其核移植胚胎发育效率的影响。【方法】利用G418单独处理猪成体成纤维细胞6 d后,收集细胞,利用荧光定量PCR的方法检测处理前后细胞中抗氧化应激、细胞凋亡相关基因的表达水平,运用亚硫酸盐结合测序法分别检测基因组重复序列LINE-1、微卫星的DNA甲基化状态,以及其核移植胚胎体外发育的能力。【结果】经不同质量浓度G418处理的供体细胞的抗氧化应激酶相关基因及细胞凋亡基因表达发生显著变化(P0.05),但其DNA甲基化水平没有发生改变(P0.05);经G418处理的供体细胞的核移植胚胎的体外发育效率显著低于对照组(P0.05)。【结论】G418处理供体细胞可能对其克隆胚胎体外发育效率有抑制作用。     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎（摘要）

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胸（80.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,并成功地克隆出转基因胚胎。     

热应激对牛卵母细胞克隆胚体外发育的影响

为了了解牛卵母细胞经短时间(30 min)热应激和采用不同供体细胞对核移植后重构胚发育的影响,对成熟前牛卵母细胞进行了不同温度(38.5(CK),39.5,40.5,41.5和42.5℃)热应激处理,以牛胎儿成纤维细胞为供体细胞,比较了重构胚的卵裂率和囊胚率;将成熟前牛卵母细胞于41.5℃热应激30 min,以未进行热应激处理的牛卵母细胞为对照,比较了3种不同供体细胞(牛胎儿成纤维细胞、牛卵巢上皮细胞、牛颗粒细胞)核移植后的重构胚囊胚细胞数。结果表明,成熟前牛卵母细胞经41.5℃热应激处理30 min,其卵裂率(72.5%)和囊胚率(18.3%)与对照组(57.6%和13.6%)相比均有显著提高(P<0.05);当温度升高至42.5℃后,虽然卵裂率有所提高,但囊胚率与对照组相比显著降低(P<0.05);其他温度处理的卵裂率和囊胚率与对照无显著差异(P>0.05)。牛卵母细胞经41.5℃热应激处理30 min,3种供体细胞形成的重构胚囊胚细胞数差异不显著(P>0.05),而且与其各自对照的囊胚细胞数差异也不显著(P>0.05)。说明41.5℃可以作为牛卵母细胞热应激处理的最佳温度,成熟前牛卵母细胞经41.5℃热应激处理30 min,能有效提高核移植效率。     

波尔山羊及黄牛耳部成纤维细胞的体外培养

为了获得丰富的核移植供核体细胞,通过活体采集波尔山羊及黄牛耳部皮肤,利用组织块和消化法开展原代培养,并进行传代培养和培养细胞的冷藏、冷冻保存实验.建立了简易的波尔山羊和黄牛成纤维细胞体外培养程序.     

小型猪体细胞克隆试验

[目的]建立体细胞克隆小型猪的技术平台并了解克隆效率。[方法]运用体细胞核移植技术,以小型猪胎儿成纤维细胞作为核移植供体细胞,以体外成熟卵母细胞作为核移植受体细胞进行体细胞克隆猪生产,并利用STR序列对所出生的克隆猪进行个体识别。[结果]将重构胚胎移植到5头代孕母猪体内,其中一头代孕母猪成功产下2头克隆小型猪。经过个体识别试验证实克隆小型猪来自供核细胞,与代孕母猪无直接亲缘关系。[结论]克隆小型猪的成功出生表明所建立的技术平台适于小型猪的克隆。     

猪体细胞克隆技术研究进展

克隆不仅可以保护濒危动物,而且与干细胞工程技术结合应用于克隆性治疗,具有重大的科学意义和应用价值。体细胞克隆猪因其在人类器官移植方面具有巨大的应用潜力,已成为当今研究的热点,但是体细胞核移植技术仍存在许多问题,其中最主要的是体细胞核移植的环节多,克隆效率低。对体细胞克隆猪的关键环节,即供核细胞、卵母细胞、显微操作、克隆胚的激活、培养及移植技术进行了简要综述。     

不同来源山羊体细胞重编程效率比较

[目的]检测克隆奶山羊(♀12003)和转基因克隆奶山羊(♂12001)作为供体细胞,对体细胞重编程效率的影响。[方法]采用慢病毒作为载体,携带多能因子来感染正常山羊(g2)、♀12003和♂12001体细胞,统计克隆形成率和碱性磷酸酶阳性克隆率。[结果]与普通山羊(g2)相比,转基因克隆奶山羊耳成纤维细胞的重编程效率低,出现的细胞克隆在传代之前容易分化;克隆奶山羊体细胞与普通山羊体细胞的重编程效率接近,转基因克隆奶山羊(♂12001)的重编程效率极显著低于克隆奶山羊(♀12003)和普通山羊(P0.01)。[结论]转基因克隆奶山羊体细胞可以被重编程为诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs),但效率较低。     

科研简讯

我校2项研究在2006年5月获北京市科学技术进步奖一等奖:1)“应用体细胞克隆技术生产和拯救优质种牛”以李宁教授为带头人的研究群体,围绕体细胞克隆牛的生产技术开展了全面系统的研究,建立了1套较为完整有效的体细胞克隆技术平台,包括高产奶牛、优秀种公牛和优质地方品种牛在内的不同类型的体细胞系73个;通过比较供体细胞对克隆牛生产效率的影响,建立了有效的供体细胞选择体系;对体细胞克隆生产的关键技术环节进行了优化,提高了体细胞克隆牛的生产效率,其中克隆囊胚的发育率为36·2%、移植妊娠率为36·1%、产犊率为15·8%。冷冻卵母细胞为胞…     

双峰驼黄体细胞的分离与培养

为了探索双峰驼黄体细胞的percoll液分离及体外培养方法,观察黄体细胞的生物学特性,采用胶原酶消化法从双峰驼黄体组织中分离并获得妊娠期双峰驼黄体细胞,通过形态学观察确定了大小黄体细胞的生长特性.结果表明:胶原酶消化可获得数量较多,生长状态良好的双峰驼黄体细胞,而小黄体细胞的数量远远多于大黄体细胞,其形态学和生物学特性具有典型类固醇分泌细胞的特征.试验建立的体外双峰驼黄体细胞原代培养的方法,所获细胞生物学特征稳定,纯度较高,适用于体外试验研究.     

山羊松果体细胞原代培养及其生物学特性研究

目的:观察体外培养山羊松果体细胞的增殖情况和功能状态．为进一步提高季节性繁殖动物的繁殖率提供理论基础。方法:对松果体细胞进行培养,倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖情况,5-HT免疫组织化学染色显示细胞的功能状态。结果:松果体细胞呈圆形或多角形,折光性强,细胞体积有增大趋势;细胞有明显的增殖现象,大约于11d达到高峰;5-HT阳性细胞数量随细胞的增殖而增加。结论:山羊松果体细胞在体外增殖旺盛。     

供核细胞对绵羊体细胞克隆效率的影响

【目的】在制作克隆胚胎时,供核细胞直接制约着重构胚的融合数量和发育潜力。研究供核细胞对绵羊体细胞对克隆效率的影响。【方法】从供核细胞的静置时间,研究传代次数与周期处理,供核细胞不同克隆株,不同羊源细胞等,以重构胚融合率和囊胚发育率为检测指标,判定单因素供核细胞对克隆胚胎的影响。【结果】在供核细胞静置时间方面,供核细胞静置15~30 min内完成重构胚制作的融合率极显著高于静置2 h左右的供核细胞组(90.10% vs 78.84%)(P< 0. 01),但囊胚率差异不显著(15.58%vs 14.65%)(P＞0.05);在供核细胞传代次数(d1~d3)和汇合期生长时间方面(24 and 48 h ),各组的融合率差异不显著(70.37%、76.03%、71.92% vs 72.97%)(P＞0.05),但囊胚率有增高的趋势(5.96%、9.06%、15.85% vs 20.16%);在同一供核细胞不同克隆株方面,供核细胞对融合率和囊胚率存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)的影响;在不同个体方面,供核细胞株对融合率和囊胚率存在极显著的影响(P<0.01)。【结论】15~30 min内的静置供核细胞、传代3次并延长汇合期细胞生长时间(48 h),多选细胞株更有利于克隆胚的制作。     

体细胞胚胎发生及其基因表达的研究进展

在合适的培养条件下,植物体细胞会模仿胚胎发育过程产生体细胞胚胎。体细胞胚胎发生提供一个实验系统,便于研究植物形态建成的分子和细胞机制等方面。文中主要对体细胞胚胎发生的影响因素(激素、胁迫因素和Ca2 等)和该过程中的基因表达与调控方面论述了国内外研究进展。