一种新的杆状病毒转移载体的构建

从家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)中分别克隆出其P10基因。从BmNPV P10中亚克隆得到其5′端上游片段,经PCR定位突变使之ATG区突变成一个BglⅡ酶切位点。从AcMNPVP 10中亚克隆得到基因3′端下游片段,克隆入经突变的BmNPV P10基因启动子的下游,构建成一个新的转移表达载体pBmAcPV-1,由于BmNPV和AcMNPV P10基因及两端的同源性高达90％以上,该载体可以分别与野生型BmNPV和AcMN-PV DNA进行同源重组。     

从野桑蚕体内分离的NPV与BmNPV、AcMNPV间的RAPD分析

将野外收集的野桑蚕核型多角体病毒进行空斑筛选，纯化后的病毒通过碱裂解法抽提基因组DNA，用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的基因组DNA作对照，用随机引物进行PCR扩增。结果表明，野桑蚕分离的NPV与BmNPV、AcMNPV存在较大的差异性，通过版本为1．3b的Treecomw软件分析，表明野桑蚕体内的NPV与BmNPV的同源关系较近，而与AcMNPV的同源关系较远。     

家蚕核型多角体病毒基因与抗病育种

家蚕(Bombyx mori L.)对家蚕核型多角体病毒(B.mori Nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)抗性为不完全显性,在常染色体上由主效基因控制,在性染色体上有微效基因的协同作用.抗BmNPV相关基因的研究,为生产上进行防治提供了理论基础.RNA干涉(RNA interferenc...     

可感染茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒的构建

【目的】构建能够感染家蚕和茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒（rBmNPV）,解决EoNPV扩增困难而不易获得的难题。【方法】通过Bac-to-Bac系统构建具备BmNPV的多角体蛋白基因（polh）表达盒和EoNPV的解旋酶基因（hel）表达盒的重组家蚕核型多角体病毒。【结果】家蚕或家蚕细胞扩增的rBmNPV可以感染茶尺蠖并致病,表明rBmNPV的宿主域拓展至茶尺蠖。【结论】成功构建了能够感染茶尺蠖的rBmNPV,为利用家蚕作为宿主来生产重组病毒杀虫剂打下基础。     

快速敲除补回家蚕核型多角体病毒ORF29

利用Red重组系统成功敲除家蚕核型多角体病毒ORF29基因（BmNPV ORF29,简称Bm29）,并利用Bac to Bac系统构建补回型的Bm29基因。通过PCR鉴定敲除和补回均成功,为后续的Bm29基因功能研究奠定基础。     

灰斑古毒蛾核型多角体病毒EcoRⅠ-U片段的克隆与序列分析

【目的】分析灰斑古毒蛾核型多角体病毒(Orgyia ericaenucleopolyhedrovirus,OrerNPV)EcoRⅠ-U片段分子生物学特征,为研究其分子特性及其在OrerNPV感染周期中的功能提供科学依据。【方法】克隆、分析Or-erNPVEcoRⅠ-U片段所包含的若干基因,并应用生物软件对OrerNPV泛素基因(Ubi基因)进行了进化分析。【结果】OrerNPVEcoRⅠ-U片段包含Ubi基因、AcORF34同源基因和39K基因部分序列,在该区域中编码Ubi基因的开放阅读框(ORF)由246个核苷酸组成,可以编码81个氨基酸,预计蛋白质分子质量为8.9 ku。OrerNPVUbi基因与苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)、家蚕核型多角体病毒(BmNPV)、薄荷灰夜蛾核型多角体病毒(RaouM-NPV)的同源性最高,均达92%,与小菜蛾颗粒体病毒(Plutella xylostellagranulovirus,PxGV)的同源性最低,为62%。OrerNPV与AcMNPV、BmNPV和RaouMNPV的亲源关系最近。EcoRⅠ-U片段+M13端含有编码39K基因(pp31)的部分序列,该多肽与10种NPV的39K序列有48%~52%的同源性。【结论】明确了OrerNPVEcoRⅠ-U片段的序列特征及OrerNPV Ubi在泛素蛋白家族中的进化关系。     

家蚕核型多角体病毒ie-2基因dsRNA表达载体的构建

为了研究ie-2基因的dsRNA对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果,根据NCBI公布的BmNPV(T3株)基因组序列,克隆了BmNPV极早期表达因子ie-2.将该基因用亚克隆的方法导入到L4440载体中构建L4440-ie-2,并成功转入大肠杆菌HT115(DE3).IPTG诱导可以成功表达相应的dsRNA.     

家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展

追踪研究蚕体内的抗家蚕核型多角体病毒（Bombyxmori nuclearpolyhedrosis virus,BmNPV）基因与蛋白,了解家蚕抗BmNPV的机制,对减轻甚至解除血液型脓病、促进桑蚕产业发展具有重要意义。文章就家蚕抗BmNPV基因和蛋白的研究进展进行综述,提出今后对家蚕抗BmNPV的研究策略应是运用多种技术同时从DNA、RNA、蛋白质水平上进行研究,鉴定家蚕抗BmNPV基因或蛋白及其与抗BmNPV的相关性;再采用RNA干涉、转基因技术对家蚕进行基因操作,改变其对BmNPV的抵抗能力,确认这些基因、蛋白的抗病毒功能。另外,使用免疫组化、免疫共沉淀,ELISA等技术探索基因一蛋白、蛋白一蛋白间的相互作用,找到基因或蛋白的上、下游作用因子,解释清楚家蚕抗BmNPV的详细机制,为最终解除家蚕脓病危害、促进蚕业发展提供参考资料。     

柞蚕核型多角体病毒基因组编码的VmiRNA筛选及功能分析

[目的]VmiRNA不仅可以控制自身基因,还可调节宿主的稳定表达,研究VmiRNA的功能有助于从分子水平说明核型多角体病毒与柞蚕的寄生关系,从而改进对病毒的防控措施。[方法]利用生物信息学及实时定量PCR等分子生物学相关技术,对柞蚕核型多角体病毒编码的miRNA及其作用的靶标基因进行研究。[结果]经预测和筛选得到了Ap NPV编码的miRNA MD217,与其有关的宿主靶基因14种,主要参与细胞组成、生化过程以及分子功能等途径,涉及到生物体细胞内一些催化、免疫反应等过程;实时定量PCR结果表明,MD217在病毒感染后上调表达,脂肪体组织内的靶基因MAPKK7表达水平与MD217的表达呈正相关。[结论]miRNA MD217在病毒感染后诱导表达,推测很可能降低了宿主免疫系统的防御能力,并同时影响靶基因MAPKK7的功能表达,从而避免了在免疫应答过程中的免疫清除。     

云南不同地区BmNPV对家蚕致病力的研究

为研究家蚕病毒弱毒株系对强毒株系的交互保护作用,探索利用弱毒苗添食防治家蚕病毒病,试验收集了8种云南不同地区的BmNPV多角体,经纯化后,配制成102~108个/ML7种浓度多角体悬浮液,分别添食3龄起蚕,每种病毒的每种浓度为1个处理,每个处理3个重复小区,每小区30头蚕,调查记录各区蚕死亡头数,连续调查至供试蚕上蔟,累计死亡头数,计算各区蚕死亡率。参照吉田的方法计算其LC。结果表明,8种云南不同地区家蚕核型多角体病毒对家蚕致死中浓度由大到小依次为BmNPV(Heqing)(BmNPV(Xiangyun)(BmNPV(Mengzi)(BmNPV(Qiaojia)(BmNPV(Luliang)(BmNPV(Mojiang)(BmNPV(Zhanyu)(BmNPV(Baoshan)。毒力最强的是保山株,其对3龄起蚕的致死中浓度为5.75×104个/mL,次强是沾益株和墨江株同在一个数量级,陆良株、巧家株和蒙自株中等在同一个数量级,其次是祥云株,最弱为鹤庆株,LC50为8.81×109个/mL,其与最强的保山株(LC50为5.75×104个/mL)相差5个数量级。     

BmNPV对家蚕BmN细胞周期及周期蛋白基因表达水平的影响

【目的】研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedroviruses,BmNPV)对家蚕卵巢细胞系(BmN)细胞周期及细胞周期蛋白基因转录水平的影响。【方法】用BmNPV感染家蚕BmN细胞,分别在病毒感染后的不同时间(12,24,36,48h),应用实时荧光定量PCR方法检测细胞周期蛋白基因CyclinA、CyclinB、CyclinE的表达情况,用流式细胞仪检测细胞周期的变化。【结果】BmNPV感染24h后,BmN细胞出现明显感染症状,变为圆形;48h后细胞核内出现多角体。随着感染时间的延长,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均下降,分别在感染12,24,36h后,表达量降低为0。流式细胞仪检测结果显示,在BmNPV感染后24h左右,抑制于G2/M期的BmN细胞达到68%。【结论】BmNPV感染家蚕BmN细胞后,导致CyclinB、CyclinE基因表达量降低,对CyclinA基因表达量的影响较小;同时BmNPV感染可以将BmN细胞发育抑制于G2/M期。     

家蚕核型多角体病毒orf79克隆及原核表达

家蚕核型多角体病毒orf79是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒口服感染因子4的同源基因,为了研究orf79蛋白在家蚕核型多角体病毒感染过程中与宿主的互作关系,利用PCR技术克隆orf79基因并构建了原核表达载体,并进行表达条件的优化.结果表明,SDS-PAGE检测结果发现0.2 mmol· L-1的IPTG诱导2h后,orf...     

家蚕核型多角体病毒IE1的多克隆抗体制备及鉴定

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)ie1 基因是BmNPVDNA复制的必需基因,其编码的IE1蛋白能够反式转录 激活杆状病毒早期基因的表达.为了进一步研究IE1蛋白在家蚕核型多角体病毒感染宿主过程中具体的功能,研究 通过PCR扩增BmNPVie1 基因片段,亚克隆到原核表达载体pET32,获得重组质粒pET32-IE1,经测序正确后, 转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株.通过IPTG诱导融合蛋白原核表达后,初步纯化收集抗原,免疫新西兰大白 兔,制备IE1多克隆抗体.应用制备的免疫兔血清进行Western-blot分析,结果显示多克隆抗体能特异识别BmNPV 的IE1和IE0蛋白.免疫荧光结果同样显示IE1蛋白定位于宿主细胞核病毒复制中心.IE1抗体制备的成功为进 一步研究IE1在病毒感染家蚕中的作用机理奠定了基础.     

分子标记技术检测家蚕品种抗BmNPV性能

通过经口添饲家蚕核型多角体病毒BmNPV,比较家蚕新品种871C、872C及其杂交种和871、872及其杂交种对BmNPV抵抗性的强弱,结果表明,家蚕新品种具有很强的抗BmNPV性能。用分子标记技术对不同品种进行辅助选择,抗性品种871C、872C显示为阳性,而易感品种871、872显示为阴性;并在抗病品种中扩增出长度为999 bp的DNA片段,推测该分子片段与家蚕品种的抗BmNPV性能相关。     

家蚕核型多角体病毒ORF 75基因的生物信息学分析

通过对家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori,nucleopolyhedrovirus:BmNPV)ORF 75基因核苷酸序列进行生物信息学分析,BmNPVORF 75基因位于病毒基因组70 485 bp和71 264 bp之间,编码259个氨基酸残基的多肽,预测分子相对质量为30.8 kDa,等电点为7.67,分子式为C1409H2157N351O390S19;蛋白在大肠杆菌内的半衰期大于10 h;酸性氨基酸(Asp Glu)占10.5%,碱性氨基酸(Arg Lys)占10.8%;蛋白的不稳定指数为42.67,是不稳定蛋白.利用Prosite数据库扫描,查到4类9个蛋白修饰位点.通过Blast搜索氨基酸同源序列发现,BmNPVORF 75同源蛋白存在于所有测序的鳞翅目昆虫杆状病毒中,不存在于其他非鳞翅目昆虫杆状病毒中.同源序列比对结果,BmNPVORF75蛋白的氨基酸序列与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica MNPV)ORF92之间的同源性达到100%,应为相同基因.依照BmNPVORF75同源基因序列相似性,对13种昆虫杆状病毒进行进化树构建分析,其中,BmNPVORF75与薄荷灰夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒(Rachiplusia ouMN-PV)ORF89基因进化距离很近,同源性较高.     

家蚕核多角体病毒p10基因的克隆和分子系统进化分析

根据GenBank中家蚕核多角体病毒T3株中p10基因的保守序列,克隆得到了8个不同地区的家蚕核多角体病毒的p10基因,并分别与GenBank中的NPVp10基因进行比对.结果发现p10基因都含有1个213 bp的开放阅读框(ORF)共编码70个氨基酸,8株P10蛋白间氨基酸序列相似性为95%~100%,相似性高.与GenBank中Ac-MNPV和BmNPV的P10蛋白相比,8株BmNPV P10蛋白都缺失了3个保守结构域中的C-端结构域,只含有2个保守结构域,即N-端卷曲螺旋和Pro丰富区.     

家蚕热休克蛋白HSP90相互作用蛋白的筛选与鉴定

[目的]HSP90是热休克蛋白家族的成员之一,在昆虫的抗逆性和变态发育中发挥重要作用,已有研究表明HSP90能够促进家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV)的增殖,但作用机制尚不清楚.本研究通过鉴定BmHSP90的相互作用蛋白,为其促进BmNPV增殖的作用机制解析提...     

家蚕DNA甲基转移酶功能预测及其在BmNPV感染下的表达特征

【目的】明确家蚕DNA甲基转移酶基因(BmDNMT)生物信息学基本特征及其在家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染前后的表达情况,揭示DNA甲基化在家蚕抗病毒免疫方面的作用机制,为挖掘家蚕抗病毒标志基因和药物靶标蛋白等提供理论依据。【方法】通过OrthoDB、MultiLoc2、SherLoc2、PSORTII、SMART、SWISS-MODEL及Schr?dinger等在线生物信息学分析软件进行BmDNMT蛋白氨基酸同源比对、系统进化分析、亚细胞定位、功能结构域预测、三级结构同源建模及小分子配体对接口袋预测,并采用实时荧光定量PCR分析BmDNMT基因在家蚕感染BmNPV后不同时间不同组织中的时空表达特征。【结果】BmDNMT基因包含BmDNMT1和BmDNMT2,分别位于家蚕8号染色体和11号染色体上,其推导BmDNMT氨基酸序列均与烟草天蛾DNMT氨基酸序列的亲缘关系最近。BmDNMT1蛋白大量存在于细胞核,少量分布在细胞质;而BmDNMT2蛋白大量存在于细胞质,少量分布在细胞核及线粒体。BmDNMT1蛋白的功能结构域多于BmDNMT2蛋白,二者均含有DNA甲基化酶功能结构域,且具有潜在药物结合口袋。BmNPV感染会影响BmDNMT1和BmDNMT2基因在家蚕不同组织中表达差异,BmNPV感染4 h后这2个基因在家蚕中肠的表达差异已非常明显,说明家蚕DNA甲基化可能在病毒感染早期已发生,且中肠可能是最早响应的组织。BmNPV感染后,BmDNMT1和BmDNMT2基因的相对表达量和表达趋势并不一致。【结论】BmDNMT1和BmDNMT2基因的染色体位置、亚细胞定位及功能结构域等存在差异,BmNPV感染后二者在家蚕不同组组织中的相对表达量和表达趋势也不一致,推测BmDNMT1和BmDNMT2基因在家蚕DNA甲基化过程中行使不同的功能。BmDNMT1和BmDNMT2蛋白三维结构具有潜在的药物结合口袋,可能是直接影响DNA甲基化状态的药物靶标。     

广西家蚕核型多角体病毒株gp64基因 克隆与序列分析

[目的]了解广西家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)毒株gp64基因的保守性,并掌握其具体的突变位点,为研究核型多角体病毒(NPV)种内的微进化模式提供参考依据.[方法]对广西不同桑蚕产区的19株BmNPV毒株进行gp64基因克隆与测序,分析完整开放阅读框(ORF)序列的同源性和单核苷酸多态性,并构建基于gp64基因的遗传进化树.[结果]广西BmNPV毒株的gp64基因ORF序列不一致,存在1590、1593和1599 nt三种类型,是由于第94~96位缺失GCG或第97~102位插入GCGCCG所致,且插入核苷酸突变仅在广西BmNPV毒株中出现.仅GXSL毒株与T3毒株的核苷酸及其推导氨基酸序列同源性均达100.0%,其余18株毒株与T3毒株的核苷酸序列同源性在98.5%~99.2%,其推导氨基酸序列同源性在98.7%~99.6%.19株广西BmNPV毒株被分为两个亚群(cladeⅠ和cladeⅡ),其中11株独立形成cladeⅡ,7株独立形成cladeⅠ中的一个亚群;广西毒株在多个位点出现同义核苷酸突变,呈一定的规律性.[结论]广西BmNPV毒株的gp64基因具有遗传多样性,在遗传进化上较独立,插入突变显示出地域特点.