外源抗菌肽在转基因鱼腥草中的表达及抗茎腐病研究

[目的]鉴定转基因鱼腥草中外源抗菌肽的表达,分析抗茎腐病的能力。[方法]通过SDS—PAG电泳和Westernblot方法检测转基因鱼腥草植株中外源抗菌肽的表达,接种不同浓度的立枯丝核菌孢子,比较转基因植株与非转基因植株的染病情况。[结果]外源抗菌肽能在转基因鱼腥草中表达;立枯丝核菌的最佳侵染孢子浓度为3×105．／ml,观察时间以3d为宜,转基因鱼腥草较非转基因鱼腥草的抗茎腐病能力增强。[结论]外源抗茵肽的表达能增强转基因鱼腥草植株的抗茎腐病能力。     

不同来源丝核菌对马铃薯植株致病能力及生防效果研究

[目的]探讨不同来源丝核菌对马铃薯植株的致病能力及不同拮抗菌对病害的防治效果。[方法]采用活体接菌法研究了大豆根腐病立枯丝核菌和水稻纹枯病立枯丝核菌对不同品种马铃薯植株的致病能力,并通过喷施生防菌研究了不同拮抗菌(细菌、放线菌和霉菌)对病害的防治效果。[结果]大豆根腐病立枯丝核菌对马铃薯植株的致病能力强于水稻纹枯病立枯丝核菌,其中水稻纹枯病立枯丝核菌对马铃薯叶的病指仅为25%,对茎的病指为50%。细菌对大豆根腐病立枯丝核菌具有一定的防治效果,抑菌率可达88%;细菌与放线菌的混合液对大豆根腐病立枯丝核菌的生防作用较明显,抑菌率达90%。[结论]为马铃薯栽培及黑痣病防治提供了理论依据。     

黄瓜茎基腐病菌拮抗真菌的分离和筛选

[目的]分离和筛选黄瓜茎基腐病菌的拮抗真菌。[方法]从病田土壤采集21个土壤标本,分离得到5种对瓜果腐霉、瓜类腐皮镰孢菌和立枯丝核菌有拮抗作用的拮抗菌,并进行温室盆栽防病试验。[结果]经鉴定,5种拮抗菌分属于长枝木霉、橘绿木霉、康氏木霉、哈慈木霉和绿色木霉,对瓜果腐霉、瓜类腐皮镰孢菌和立枯丝核菌的生长都有强烈的抑制作用。在人工接种条件下,5种拮抗菌对立枯丝核菌引起的茎基腐病的防效在60%以上,对瓜果腐霉引起的茎基腐病的防治效果差些。[结论]该研究筛选出的5种拮抗菌对瓜果腐霉、瓜类腐皮镰孢菌和立枯丝核菌引起的黄瓜茎基腐病均有一定的防效。     

石竹茎腐病病原菌鉴定与生物学特性研究

[目的]明确石竹茎腐病病原菌,以期更好地防治此病害。[方法]使用常规植物病理学和分子生物学方法分离和鉴定病原菌,并研究病原菌生物学特性。[结果]石竹茎腐病病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。立枯丝核菌最适生长温度为28℃,最适pH为7~8,最适生长的碳源为麦芽糖、可溶性淀粉,最适氮源是蛋白胨;尖孢镰刀菌最适生长温度为28℃,最适pH为7~9,尖孢镰刀菌在果糖和蔗糖中生长速度最快,葡萄糖最不利于其生长,最适氮源为蛋白胨。[结论]立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)共同侵染石竹引起石竹茎腐病。这2种病原菌对环境的适应能力较强。     

苜蓿根腐病多种病原菌的分子检测

[目的]研究苜蓿根腐病病原菌种类和各种病原菌在病株中的出现频率,以及单一病株受到多种病原菌复合侵染的情况,并为该病复合侵染规律及防治奠定基础.[方法]利用已报道的7种病原菌的7对特异性引物,分别对新疆北疆主要苜蓿种植区采集的根腐病混合病样,及单一重病田分单株采集的根腐病病样进行PCR检测.[结果]新疆北疆主要苜蓿种植区根腐病病样中可检出的根腐病病原种类主要有5种镰刀菌和1种丝核菌;其中,立枯丝核菌、木贼镰刀菌、锐顶镰刀菌、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌5种病原菌在病株样品中普遍存在,是新疆北疆部分地区苜蓿根腐的主要病原菌;侵染根部的病原菌中以尖孢镰刀菌、锐顶镰刀菌和立枯丝核菌为优势种群,侵染茎基部病原菌中以茄腐镰刀菌和木贼镰刀菌为优势种群.检测结果还表明苜蓿根腐病病样中两种及两种以上病原菌复合侵染的的比率达到83;.[结论]木贼镰刀菌、锐顶镰刀菌、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌是新疆北疆部分地区苜蓿根腐病的主要病原菌,拟知孢镰刀菌是出现频率较低的次要病原菌;根部病斑与茎基部病斑中优势病原菌种类有所不同;田间病株中多病原复合侵染的情况非常普遍.     

哈茨木霉T_2菌株耐药性的测定及其对几种病原菌的抑制作用研究

[目的]为提高木霉菌的生物防治效果。[方法]研究了哈茨木霉T2菌株对3种病原真菌(齐整小核菌、立枯丝核菌和香蕉枯萎病菌)的抑制作用,分析其对7种杀菌剂的耐药性,并探讨了哈茨木霉T2菌株与杀菌剂联用对立枯丝核菌和齐整小核菌的抑制作用。[结果]哈茨木霉T2菌株对病原真菌的抑制随处理时间的延长而增强。处理后120 h其对齐整小核菌、立枯丝核菌、香蕉枯萎病菌的抑制率最高,分别为63.10%、65.64%和33.84%。哈茨木霉T2菌株对多菌灵的耐药性最强,EC50为4 345.32 mg/L。在浓度为800 mg/L时多菌灵对哈茨木霉T2菌株的抑制率为13.73%,当浓度在50 mg/L以下时抑菌率几乎为0。哈茨木霉T2菌株对代森锰锌、露星较敏感。[结论]哈茨木霉T2菌株与甲霜灵联用,能明显抑制齐整小核菌、立枯丝核菌的生长。     

亚磷酸二氢钾对生姜茎基腐病菌腐霉的抑制作用

由腐霉菌(Pythium myriotylum)引起的生姜茎基腐病是目前危害生姜生产的主要病害,为实现生姜茎基腐病的绿色防治,通过亚磷酸二氢钾的室内毒力测定,观察亚磷酸二氢钾对生姜茎基腐病原菌的抑制作用;采用菌丝生长速率法,测定亚磷酸二氢钾对生姜茎基腐病原菌腐霉以及立枯丝核菌等7种病原菌的抑菌效果。结果表明:亚磷酸二氢钾对小麦纹枯病菌、立枯丝核菌、白菜叶斑病菌、生姜茎基腐病原菌菌丝生长抑制效果较显著,其中亚磷酸二氢钾对生姜茎基腐病原菌菌丝生长抑制效果最好,其次是白菜叶斑病菌,4g·L~(-1)时抑菌率达84.4%,EC_(50)=0.632 6g·L~(-1)。     

新疆奶花芸豆立枯丝核菌菌丝融合群及其致病性研究

从新疆奶花芸豆主产区采集的奶花芸豆立枯病、根腐病、茎腐病病苗及土样中分离得到85个丝核菌(Rhizoctonia DC)菌株,经鉴定均为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn).对85个立枯丝核菌菌株进行的菌丝融合群判定和致病性测定结果表明,在新疆对奶花芸豆造成侵染为害的立枯丝核菌菌丝融合群有AG1、AG2、AG4、AG5,其出现频率分别为16.5;、34.1;、29.4;和20.0;;各融合群对奶花芸豆苗期致病性存在一定差异;在4个融合群中,以AG2分布最广,致病性最强.试验对奶花芸豆立枯丝核菌的菌丝融合群组成,及各融合群对奶花芸豆的致病性进行了研究.     

鄂西北野生植物蒲公英提取物对几种真菌的抑制活性

以采自鄂西北山区的蒲公英无水乙醇提取物为供试药液,测定了其对立枯丝核菌Rhizoctonia solani、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、齐整小核菌Sclerotium rolfsii、终极腐霉Pythium ultimum和尖镰孢菌黄瓜专化型Fusarium oxysporum f.sp cucum-ber的抑制活性。结果表明:不同浓度的蒲公英提取物对供试真菌菌丝生长的抑制作用均随菌丝生长时间的延长而降低。蒲公英提取物对这5种真菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用均随着提取物浓度的升高而增强,且对终极腐霉、尖镰孢菌黄瓜专化型、立枯丝核菌和灰葡萄孢菌均有较好的抑制作用,而对齐整小核菌的抑制作用较弱。     

立枯丝核菌AG-1 IB引起白菜、薄荷、莴苣叶腐病的研究*

 云南省西双版纳地区白菜、薄荷、莴苣叶腐病频繁发生,从有叶腐症状的病害组织中分离到立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）菌株。根据培养性状、菌丝直径、细胞核数目、融合群反应、5.8 s rDNA片段序列分析及致病性测定,结果表明引起白菜、薄荷、莴苣叶腐病的病原菌为立枯丝核菌AG-1 IB菌丝融合群。     

三七根腐病病原研究

【目的】三七根腐病是三七的重要病害，是限制三七种植业发展的严重障碍。【方法】在田间进行系统的三七根腐病害观察、调查和采样；在室内进行病原分离、鉴定和室内致病性测定，并进行田间人工接种试验。【结果】发现三七根腐病的主要症状表现有黄腐型、干裂型、髓烂型、急性青枯型、湿腐型和茎基干枯型等，但以黄腐型和急性青枯型较为常见，其中干裂型、髓烂型和茎基干枯型是新发现的三七根腐病症状表现。分离和鉴定结果表明，引起三七根腐病的病原真菌类群主要包括Cylindrocarpon destructans、C. didynum、Fusarium solani、F. oxysporum、Phytophthora cactorum、Phoma herbarum、Rhizoctonia solani等。室内致病性测定结果表明C. didynum、C. destructans、P. cactorum、P. herbarum和R. solani均能导致块根不同程度的腐烂。田间人工接种以P. cactorum和P. herbarum的致病性较强，发病率分别为48.4%和50.0%。C. destructans和C. didynum的致病力虽然较弱（C. destructans为23.5%，两株C. didynum分别为28.0%和15.2%），但在田间分布范围广，分离频率高（Cylindrocarpon属真菌最高组织分离频率为100%），且可导致典型的黄腐型症状。【结论】C. destructans和C. didynum是田间三七根腐病的重要病原真菌。     

植物防御素基因alfAFP(M. sativa)在毕赤酵母中的分泌表达及对水稻病原菌的抑制

 【目的】大多数的植物防御素对不同的病原菌具有抗菌活性,其中来自苜蓿种子的防御素alfAFP的转基因土豆和番茄已经被证明对病原菌具有强抗病性。进一步研究该基因对稻瘟病、纹枯病、白叶枯病三大重要病害的抑制作用,对水稻抗病基因工程研究具有重要的意义。【方法】本试验将alfAFP构建到表达载体pPIC9K上,电转化毕赤酵母（GS115）,再进行蛋白质的分泌性诱导表达,最后进行体外重组蛋白对水稻病菌的抑菌活性检测。【结果】通过15%的SDS-PAGE检测,得到大约6.5 kD的重组蛋白。alfAFP融合蛋白对水稻纹枯病、稻瘟病和白叶枯病均具有一定的抑制活性,其中对纹枯病的作用最为明显。【结论】alfAFP在酵母中成功诱导表达,并对水稻测试病菌具有一定的抑制活性,预示着alfAFP防御素基因在水稻抗病基因工程中具有潜在的应用价值。     

HIGS-SsCCS转基因拟南芥的菌核病抗性鉴定

【目的】菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的一类真菌病害,核盘菌寄主范围广泛,严重危害多种作物的品质。本研究利用寄主诱导基因沉默（HIGS）的方法在寄主中诱导核盘菌致病相关基因的沉默从而增强寄主的菌核病抗性,为菌核病抗病育种提供新的思路。【方法】铜锌超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化剂,以核盘菌铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因（copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase,SsCCS）为靶基因,通过生物信息学分析该基因的结构特点,并利用MEGA6.0软件构建系统发育树;通过分别比对拟南芥及核盘菌基因组,选择特异的干扰片段进行扩增;采用农杆菌介导的浸花序法,将HIGS载体转入拟南芥Col-0,通过DNA鉴定以及标记筛选出稳定的HIGS-CCS转基因拟南芥;选取4—5周龄的HIGS-CCS转基因拟南芥植株叶片接种核盘菌野生菌株1980,于接种24 h后统计病斑面积,分析转基因株系的菌核病抗性;通过qRT-PCR分析核盘菌侵染转基因植株过程中SsCCS的表达情况;同时在接种6、12、24 h后利用DAB染色的方法检测转基因植株与核盘菌互作过程中H₂O₂的积累。【结果】生物信息学分析结果表明,SsCCS（SS1G_00102）全长为1 010 bp,编码序列长759 bp,共编码253个氨基酸,该蛋白分子质量为27 176.96 Da,等电点（PI）为5.04,与灰霉病菌BcCCS（EDN25358）亲缘关系最近,氨基酸同源性达到87%,与拟南芥AtCCS（AT1G12520.1）亲缘关系较远;通过与核盘菌以及拟南芥基因组比对,选择314 bp特异干扰片段,成功构建SsCCS的HIGS表达载体,转化拟南芥。T₁及T₂代转基因拟南芥接种核盘菌24 h后的病斑面积均小于野生型拟南芥。从T₂代中获得3个稳定表达的T₃代HIGS-CCS转基因拟南芥株系：HIGS-CCS-5、HIGS-CCS-8、HIGS-CCS-13;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥在接种核盘菌24 h后,病斑面积显著减小46%—61%;qRT-PCR结果显示核盘菌在侵染转基因植株过程中,SsCCS的表达量显著低于侵染野生型拟南芥。DAB染色结果表明,在侵染过程中,转基因拟南芥植株中H₂O₂的积累明显少于野生型拟南芥,ROS水平降低。【结论】利用HIGS方法在拟南芥中干扰核盘菌SsCCS的表达能够显著提高拟南芥的抗病性,研究结果为油菜等农作物菌核病抗病改良提供了参考。     

融合杀虫基因对甘蔗的遗传转化

[目的]利用MAR序列介导转基因表达及融合杀虫基因,以期克服外源基因失活,增强抗虫基因表达能力,延缓昆虫抗性的发生,获得高抗虫转基因甘蔗植株.[方法]以甘蔗品种ROC25为材料,进行愈伤组织、芽苗分化和生根的Hyg抗性筛选试验.利用农杆菌介导,将含MAR序列介导融合杀虫基因(AVAc-CpTI)导入甘蔗基因组.[结果]愈伤组织增殖、出芽时Hyg的最佳筛选浓度为50 mg/L,生根时Hyg的最佳筛选浓度为30 mg/L.获得13个MAR序列介导转基因表达基因系,48株Southern杂交阳性甘蔗植株;获得8个无MAR序列介导转基因表达基因系,7株Southern杂交阳性甘蔗植株.MAR序列介导转基因表达使转化过程中转基因系的获得数量提高了62.5%.[结论]建立了ROC25的潮霉素抗性筛选体系;MAR序列介导融合杀虫基因进行甘蔗遗传转化,可提高甘蔗外源基因转化效率.     

甘蓝型油菜抗菌核病材料的筛选研究

为了创造新的抗菌核病油菜种质材料,以品质优良、再生频率较高的甘蓝型黄籽油菜品系SH21,K81和甘蓝型黑籽品系P98的种子、预培养的下胚轴为诱变材料进行不同剂量的γ射线照射处理,以草酸为筛选剂,筛选抗(耐)菌核病材料,结果表明,草酸筛选浓度为700 mg/L,效果较好;3个品系通过草酸筛选,获得14株耐草酸植株,经过菌核病菌丝接种鉴定与筛选,筛选出7株抗性较高的植株。     

转BADH基因和mtlD基因花生幼苗抗盐性研究

[目的]研究转mtlD基因和BADH基因花生幼苗的抗盐性。[方法]通过根癌农杆菌介导将外源mtlD和BADH基因同时导入花生,并检测植株的鲜重、高度、电导率等指标以判断转基因花生的抗盐性。[结果]PCR和Northern杂交都显示,mtlD和BADH基因已成功整合到花生染色体上;转基因植株的鲜重、高度、细胞膜的完整程度都明显高于对照植株。[结论]mtlD基因和BADH基因在花生中的表达增强了转基因花生的抗盐性。