玉米Gln1-3 gDNA序列分离、基因结构、保守功能域与等位变异分析

谷氨酰胺合成酶家族是高等植物体内氨态氮同化酶, 是植物体内氮利用与循环的核心构件。玉米Gln1-3基因编码叶肉细胞中的细胞质同工酶, 与全株氮向籽粒蛋白质同化与氮利用效率及产量紧密相关。本研究以玉米自交系辽白371为材料, 采用PCR与接头步移(walking)方法分离得到Gln1-3基因区域基因组DNA(gDNA)全长4 571 bp, 起始密码子至终止密码子序列长3 062 bp。将该基因在GenBank注册, 登录号为EU338535, 并进行了详细注释。该基因由10个外显子、9个内含子组成, 剪接方式主要为5′供位保守的GU与3′受位AG模式。编码的GS1蛋白由356个氨基酸组成, 分子量39.2 kD, 等电点 (pI) 为5.202。保守功能域分析表明, 氨基末端外显子2到外显子6为氨离子结合结构域, 羧基末端外显子8与外显子9构成ATP酶结构域, 在胞内行使催化功能。对50个玉米自交系Gln1-3基因重要分析区域进行了等位变异分析, 鉴定出364个等位变异, 其中313个为SNP变异, 占86%。     

玉米Gln1-4的gDNA序列、基因结构、保守功能域与等位变异

本研究旨在分离玉米谷氨酰胺合成酶(GS)家族重要成员Gln1-4 gDNA序列全长,分析基因结构、保守功能域与自然等位变异,为氮利用效率功能位点关联性分析奠定基础。利用PCR步移(walking)方法分离Gln1-4基因区域基因组DNA序列,用生物信息学方法分析基因结构与保守功能域,测序与序列比对法分析重要区域自然等位变异。结果表明,分离得到自交系Mo17 Gln1-4区域gDNA 3 724 bp,起始密码子至终止密码子序列长2 858 bp,登录到GenBank (登录号为EU369651), 并注释。Gln1-4基因含10个外显子与9个内含子,18个剪接位点均为保守的5'供位GU与3'受位AG模式。编码的GS蛋白由356个氨基酸组成,分子量39.2 kD,等电点(pI)为5.202。氨基末端外显子2到外显子6为氨离子结合结构保守功能域;羧基末端外显子8与外显子9构成ATP酶活性保守功能域。Gln1-4与Gln1-3基因相比,在DNA序列、氨基酸序列、基因结构、保守功能域均很保守,氨基酸序列一致性达98.31%。52个玉米自交系的Gln1-4等位变异分析中,共鉴定出318个等位变异位点,其中242个SNP,45个Indels,占90%。该基因氮利用效率功能关联性分析区间应位于氨离子结合功能域与ATPase活性保守功能域中重要的变异位点,18个剪接位点。     

甘蔗、斑茅及割手密Ⅲ型过氧化物酶基因克隆及比较分析

研究旨在通过比较分析甘蔗及其近缘种割手密和斑茅Ⅲ型过氧化物酶(Prxs)基因差异,探讨这三种植物Prxs功能差异的遗传基础。采用同源克隆方法,成功克隆获得了甘蔗、斑茅和割手密的Prxs基因DNA序列(Genebank登录号分别为KJ001797,KJ001798和KJ001799)。经测序鉴定,克隆获得的这三个基因DNA长度分别为3 030 bp、3 048 bp和3 028 bp,外显子长度均为1 083 bp,其中编码区长度为996 bp,编码331个氨基酸。蛋白质保守结构域分析表明,此三个基因均具有过氧化物酶典型保守结构域,属于依赖于亚铁血红素Ⅲ型过氧化物酶亚类,为目标基因,且在功能位点区域高度保守,只存在一个氨基酸位点差异。基因结构比较分析表明,克隆获得的割手密、斑茅和甘蔗过氧化物酶基因均包含4个外显子,与高粱、玉米和水稻的同源基因外显子个数一致,外显子长度有较小差异,而内含子长度却存在较大差异。高粱、玉米和水稻Prxs同源基因均处在靠近染色体末端的位置,说明此基因存在一定的同线性。本研究结果为深入研究Prxs基因在不同植物中功能差异提供了一定的参考,为研究植物中Prxs基因的进化规律奠定了一定的基础。     

玉米类LFY基因的克隆及其在不同光周期条件下的表达

采用每天9 h和15 h两种光照条件对热带玉米自交系CML288和温带玉米自交系黄早四进行处理。以玉米茎尖为材料，采用RT-PCR方法，分离到1个1 265 bp的全长cDNA克隆，序列比较表明其为拟南芥LFY基因的同源基因，命名为类LFY（基因登录号为DQ343237）。类LFY与同源基因zfl2、RFL、LFY和FLO的同源性依次为93%、84%、57%和57%。它的DNA序列和推论的蛋白质序列与zfl1同源性最高，其编码的蛋白质与zfl1相比在第28、29和160位分别少1个丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸，在188位置多1个甲硫氨酸。该基因在2个供试自交系茎尖中长日照条件下不同生长时期持续表达，短日照条件下生长早期和后期不表达，其功能有待进一步研究。     

TcLr35小麦β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因cDNA全长的克隆及分析

根据已发表的植物β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,从被小麦叶锈菌诱导的小麦抗叶锈病基因近等基因系材料TcLr35中获得一个β(1,3;1,4)葡聚糖苷酶基因cDNA全长,命名为PR34,该基因全长序列为1416bp,具有一个编码335个氨基酸的开放阅读框(ORF),其起始密码子ATG位于13bp处,终止密码子TAG位于1015bp处,3'末端有20bp的poly(A)尾,379bp的3'非翻译区。与GenBank中小麦、大麦等多个葡聚糖苷酶基因具有较高同源性;对其推断的氨基酸序列进行分析,含有Glyco_hydro_17保守结构域,为葡聚糖苷酶基因蛋白结构域。Southern杂交显示,该基因在TcLr35小麦基因组中为低拷贝。     

银杏扩展蛋白基因的鉴定与特征分析

扩展蛋白是植物细胞壁重要的组成部分,在植物生长发育和逆境抗性等方面发挥着重要的作用。为探讨银杏(Ginkgo biloba)中扩展蛋白基因家族的组成和特征,本研究利用扩展蛋白的保守结构域,从银杏基因组中鉴定了28个扩展蛋白基因,包括20个EXPA基因、1个EXPB基因、4个EXLA基因和3个EXLB基因。银杏扩展蛋白基因的编码区长度在684~837 bp之间,编码227~278个氨基酸的蛋白质,具有保守的功能域、基序和氨基酸。不同亚家族基因在序列一致性、保守基序及内含子-外显子结构组成上有所不同,呈现亚家族特征。密码子分析显示,扩展蛋白基因具有密码子使用偏性,包含8个高频密码子。银杏扩展蛋白基因信息将有助于理解其在银杏基因组中的地位和作用,为深入研究功能提供基础。     

峨眉拟单性木兰B类基因的克隆及系统进化分析

MADS-box基因是一类在花发育进程中起重要作用的基因。本研究通过同源克隆技术从峨眉拟单性木兰花芽中分离得到3个B-class MADS-Box基因的CDS全长,分别命名为PaomAP3、PaomPI1、PaomPI2,并对其进行生物信息学分析。结果表明,PaomAP3基因ORF(开放阅读框)长度为642 bp,编码214个氨基酸;PaomPI1基因ORF长度为633 bp,编码210个氨基酸;PaomPI2基因ORF长度为636 bp,编码211个氨基酸。氨基酸序列分析结果表明,三个基因均含有典型的MADS结构域及K结构域。PaomPI1、PaomPI2基因末端有典型的PI-derived保守基元,PaomAP3基因末端有Paleo AP3保守基元和PI-derived保守基元。木兰科植物在科内分类上存在很大争议,因此本研究利用MEGA6软件中最大简约法(MP)构建了部分木兰科植物B类基因的系统发育树,结果表明玉兰亚属与木兰亚属亲缘关系较远;拟单性木兰属独成一属,其与含笑属、玉兰亚属亲缘关系较近,而与木兰亚属亲缘关系较远。     

玉米液泡ATP酶亚基A基因的克隆及表达分析

V-ATPase在植物应对非生物胁迫中起着十分重要的作用, 对其关键亚基基因的克隆及分析有助于阐释其在逆境下的调节及响应机制。本文利用RACE技术从玉米自交系CN165花期水分胁迫下的总RNA中克隆出液泡ATP酶亚基A基因, 命名为ZmVHA-A。该基因cDNA全长2 414 bp, 含5′-UTR(293 bp)、3′-UTR(257 bp)及编码区(1 863 bp), 编码620个氨基酸。序列比对及结构域预测结果表明, ZmVHA-A基因编码的氨基酸序列与亲缘关系比较接近的禾本科作物如水稻、小麦和大麦的氨基酸序列同源性分别达92.7%、89.8%和89.8%, 且在编码蛋白的氨基酸序列上有两个与核苷酸的磷酸基团相互作用的保守结构域“GAFGCGKT”和“PSVNWLISYS”, 可见该亚基是相对保守的。Northern杂交分析结果表明, ZmVHA-A基因在花丝中被水分胁迫诱导表达且在苗期对盐胁迫、冷处理和ABA处理具有不同的表达响应方式, 因此认为VHA-A基因是一个比较保守的功能亚基,并且通过转录表达调节参与了V-ATPase对逆境胁迫的适应。     

玉米中QM同源基因的克隆及其差异表达分析

利用cDNA-AFLP技术和5'' RACE技术在玉米自交系黄早四Ht2上分离并克隆了QM（编码核糖体蛋白L10）同源基因(命名为ZmQM)。其cDNA全长为967 bp, 开放阅读框为738 bp,。该基因编码245个氨基酸的ZmQM蛋白,分子量为27.78 kD, 等电点(pI)为10.69, 预测含蛋白酶C磷酸化位点、N-酰基化位点和酰胺化等位点。玉米ZmQM蛋白与包括人类等l3个物种QM蛋白的同源性比较发现, 氨基酸序列相似性为66%~92%。RT-PCR分析表明, 在接种玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum) 1号小种12 h后, 黄早四Ht2中ZmQM基因表达量较黄早四中明显上调,推测ZmQM基因可能参与黄早四Ht2对玉米大斑病菌1号小种的抗性反应。     

棉花转录因子基因GhMYB的克隆及特征分析

从棉花中克隆了1个MYB基因,命名为GhMYB(Gen Bank No.HQ234875)。该基因c DNA全长1264bp,具有1个774 bp的开放阅读框,5'非编码区为250 bp,3'非编码区为240 bp,编码256个氨基酸,预测分子量约为28.867 k Da,等电点为8.56,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GhMYB基因组序列长度为1355 bp,包含2个外显子和1个内含子。氨基酸同源分析发现,GhMYB与来自可可、陆地棉和巴旦木的MYB同源性较高。亚细胞定位结果表明,GhMYB:GFP融合蛋白定位于细胞核中。SDS-PAGE电泳分析表明,p ET-28a-GhMYB最佳诱导表达条件为1.0 mmol·L-1 IPTG在37℃下诱导4 h。电子表达谱分析表明,GhMYB基因在棉铃中特异表达,在根和叶中受水涝胁迫的诱导表达。     

玉米光周期敏感类Hd6基因的克隆和实时定量表达分析

水稻Hd6基因在调节水稻光周期敏感中起重要作用。本研究以热带玉米自交系CML288为材料, 利用同源基因克隆法结合3¢RACE技术克隆了与水稻Hd6基因同源的玉米类Hd6基因。该基因序列中999 bp的开放阅读框可编码332个氨基酸。BLAST分析发现, 该基因与玉米中编码蛋白激酶CK2的一个基因高度同源, 所推测的氨基酸序列包含2个CK2活性区域, 1个N末端区域, 1个ATP结合位点和1个丝氨酸/ 苏氨酸蛋白质激酶活性位点,与玉米、小麦、水稻和拟南芥的CK2氨基酸序列也有较高的同源性。建立了SYBR GREEN法实时荧光定量RT-PCR表达分析系统, 研究了不同光周期处理下类Hd6基因在光周期敏感自交系CML288茎尖和叶片中的表达。结果发现, 该基因在茎尖和叶片中均有表达。在短日条件下, 该基因在6~8叶期茎尖中的表达量存在明显差异, 在光周期敏感的7叶期出现表达高峰, 在叶片中的表达量均低于茎尖。在长日条件下, 该基因在茎尖中6叶期表达量较低, 在光周期敏感的9叶期在叶片中高量表达。由此可推测, 该基因与玉米光周期敏感密切相关, 可能在光周期敏感调节过程中发挥一定的作用。     

玉米分子伴侣基因ZmBiP2在逆境下的功能分析

BiP(binding protein)基因编码的蛋白是一类重要的分子伴侣,在动植物的逆境胁迫响应过程中具有重要的作用。从玉米抗旱自交系旱21中分离到分子伴侣基因ZmBiP2,序列分析结果显示,该基因开放阅读框长1989 bp,编码含663个氨基酸的蛋白,包含热激蛋白家族特有的TVIGIDLGTTYSC保守结构域和ATP结合位点。实时荧光定量PCR结果显示,Zm Bi P2基因在玉米的雄穗和子房中表达量最高;在盐、甘露醇胁迫条件下,该基因在植株的地上部分上调表达。过量表达Zm Bi P2基因的拟南芥转基因株系在种子萌发时期对盐和甘露醇胁迫的耐受能力减弱,在苗期对盐胁迫敏感。推测在植物响应非生物胁迫的过程中,过量表达的ZmBiP2蛋白可能发挥负调节蛋白的功能。     

一个新的玉米Vp15基因等位突变体的遗传分析与分子鉴定

在玉米繁种过程中发现一个玉米穗发芽突变体(viviparous), 命名为vp-like4。经过连续多代自交发现该突变体性状能稳定遗传, 并且表现为隐性单基因控制。以vp-like4与自交系Mo17杂交构建F₂遗传定位群体, 利用BSR-Seq方法, 将目的基因定位于玉米第5染色体173.8~175.6 Mb之间。通过基因组序列信息分析发现, 在此定位区间内存在一个已报道的Vp15基因。Vp15基因编码钼喋呤合酶小亚基, 参与类胡萝卜素裂解为ABA的过程。利用2个独立的vp15突变体vp15-umu1和vp15-DR1126的杂合体, 分别与vp-like4突变体杂合体做杂交进行等位测验, 发现杂交后代中正常籽粒与穗发芽籽粒比例符合3∶1分离比。基因组序列分析发现vp-like4突变体中Vp15基因在第2外显子末端及3°非翻译区有60个碱基的缺失, 与所报道的vp15突变体vp15-umu1、vp15-DR1126均在第2个外显子有Mutator转座子插入的突变方式不同。进一步通过RT-PCR检测发现, vp-like4突变体中Vp15基因的表达量显著降低。以上实验证据表明, vp-like4是一个新的Vp15基因等位突变体。     

玉米氮效率的杂种优势分析

在氮高效自交系筛选工作的基础上,利用NCⅡ设计进行了杂种优势分析,同时探讨了氮高效育种中亲本选配等问题。结果表明：以农大108在两个氮水平下的产量为对照,18个自交系组配的72个杂交组合中,在高氮(200 kg N·hm-2)条件下有7个组合优势超过对照10%,在低氮(不施氮)条件下有5个组合优势超过对照10%,而且氮高效杂交组合     

甘蓝型油菜oleosin基因片段的克隆及序列分析

以油菜（Brassica napus）基因组DNA为模板,通过设计一对特异性引物,利用多聚酶链式反应（PCR）扩增获得oleosin基因片段。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明,该基因由878个碱基组成,含一个内含子,编码193个氨基酸。不计附加的18 bp凝血酶切割序列,与已报道的序列相比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为79.20%和91.21%。推测的氨基酸序列构成的蛋白质具有oleosin的基本结构特点,包含3个结构区域：两性N末端区（an amphipathic N-terminal region）,中心疏水区（a central hydrophobic domain）,两性C-末端区（an amphipathic C-terminal domain）。     

玉米籽粒发育相关基因ZmMADS-RIN的克隆及表达分析

玉米籽粒发育及产量是玉米重要的经济性状。本研究以玉米骨干自交系郑58为试材,采用同源克隆法得到一个与玉米籽粒发育相关的基因ZmMADS-RIN。该基因的cDNA全长859 bp,开放阅读框为768 bp,编码255个氨基酸,与玉米B73中所对应的cDNA的编码区序列相比,共有6个SNPs位点的差异,3个氨基酸残基发生了变化。生物信息学分析表明,ZmMADS-RIN蛋白的相对分子量为29.23 kD,理论等电点(pI)为8.84,是一种亲水性蛋白,不含信号肽序列,也不含跨膜结构;具有5个磷酸化位点;二级结构中含有50.20%的α-螺旋(alpha helix)、27.45%的无规则卷曲(random coil)、14.51%的延伸链(extended strand)和7.84%的β-转角(beta turn);该蛋白位于细胞核内;其氨基酸序列中含有高度保守的MADS结构域、相对保守的K结构域、低保守的I结构域和最不稳定的C结构域,是典型的MIKC型MADS-box蛋白;系统进化树分析表明,ZmMADS-RIN蛋白属于AGL6分枝,与水稻基因OsMADS6的相似性最高,为89%。ZmMADS-RIN基因在玉米自交系郑58的籽粒中特异表达,在根及不同时期的叶片中没有检测到表达信号。荧光定量PCR结果显示,ZmMADS-RIN基因的表达量在玉米籽粒发育的不同阶段呈一定规律的变化,在授粉后0~20 d,呈上调表达趋势,授粉后25 d表达量迅速下降至较低水平,而在授粉后30~40 d则检测不到其表达。推测该基因可能与玉米籽粒的发育有关。     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析

以苎麻 [Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.] 栽培种湘苎3号为材料, 通过简并引物RT-PCR结合RACE技术首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基因BnCesA1 5′端450 bp序列以外的全部cDNA 序列, 序列长3 276 bp, 编码一段938个氨基酸的蛋白质。经基因比对及蛋白质结构分析确证是苎麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析显示：BnCesA1在苎麻根、茎、叶和芽组织中均有表达, 其表达量为茎＞叶＞芽＞根, 相对表达量依次为 0.791、0.381、0.319和0.183。从其表达模式可以推测该基因同时参与了苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素的合成。