玉米类LFY基因的克隆及其在不同光周期条件下的表达

采用每天9 h和15 h两种光照条件对热带玉米自交系CML288和温带玉米自交系黄早四进行处理。以玉米茎尖为材料，采用RT-PCR方法，分离到1个1 265 bp的全长cDNA克隆，序列比较表明其为拟南芥LFY基因的同源基因，命名为类LFY（基因登录号为DQ343237）。类LFY与同源基因zfl2、RFL、LFY和FLO的同源性依次为93%、84%、57%和57%。它的DNA序列和推论的蛋白质序列与zfl1同源性最高，其编码的蛋白质与zfl1相比在第28、29和160位分别少1个丙氨酸、脯氨酸和苏氨酸，在188位置多1个甲硫氨酸。该基因在2个供试自交系茎尖中长日照条件下不同生长时期持续表达，短日照条件下生长早期和后期不表达，其功能有待进一步研究。     

玉米光周期敏感相关性状发育动态QTL定位

玉米是短日照作物,大多数热带种质对光周期非常敏感。光周期敏感性限制了温、热地区间的种质交流。研究玉米光周期敏感性的分子机理,有利于玉米种质的扩增、改良、创新,提高玉米品种对不同光周期变化的适应性。本研究以对光周期钝感的温带自交系黄早四和对光周期敏感的热带自交系CML288为亲本配置的组合衍生的一套207个重组自交系为材料,在长日照环境条件下对不同发育时期的叶片数、株(苗)高变化进行QTL分析。结果表明,双亲间的最终可见叶片数和株高差异很大;发育初期CML288的叶片数和苗高都低于黄早四,而发育后期CML288的叶片数和株高都明显高于黄早四;测定各时期F₇重组自交系间也存在显著差异。利用包含237个SSR标记、图谱总长度1 753.6 cM、平均图距7.40 cM的遗传连锁图谱,采用复合区间作图法,分别检测到控制叶片数和株(苗)高发育的QTL 11个和20个。但是,没有一个条件QTL 能在测定的几个时期都有效应。在长日照条件下,控制叶片数与株(苗)高的非条件与条件QTL主要集中在第1、9和10染色体上,特别是在第10染色体的标记umc1873附近均检测到了影响这两个性状的QTL,且在不同的发育时期单个条件和非条件QTL所解释的表型变异分别为4.34%~25.74%和10.02%~22.57%,表明这一区域可能包含光周期敏感性关键基因。     

玉米ClpR2同源基因PL5L15的克隆及其在不同光周期处理下的表达分析

光周期敏感是热带、亚热带玉米种质在温带地区利用的主要障碍。本研究在构建的受长日诱导特异表达的差减文库基础上，以热带玉米CML288为材料，克隆了库中一个基因PL5L15的cDNA序列。该cDNA全长1410bp，具有879bp完整的ORF阅读框，编码一条292个氨基酸残基的肽链，包含一个Clp蛋白家族保守的Clp-protease结构域，是玉米Clp蛋白酶家族的ClpR2-LIKE基因，位于第9染色体上。Real-timePCR分析显示，在短日条件下该基因正常水平的表达有利于生殖分化，而在长日条件下持续过量高表达，推测该基因可能与玉米光周期反应过程中的生殖分化有关。     

玉米籽粒发育相关基因ZmMADS-RIN的克隆及表达分析

玉米籽粒发育及产量是玉米重要的经济性状。本研究以玉米骨干自交系郑58为试材,采用同源克隆法得到一个与玉米籽粒发育相关的基因ZmMADS-RIN。该基因的cDNA全长859 bp,开放阅读框为768 bp,编码255个氨基酸,与玉米B73中所对应的cDNA的编码区序列相比,共有6个SNPs位点的差异,3个氨基酸残基发生了变化。生物信息学分析表明,ZmMADS-RIN蛋白的相对分子量为29.23 kD,理论等电点(pI)为8.84,是一种亲水性蛋白,不含信号肽序列,也不含跨膜结构;具有5个磷酸化位点;二级结构中含有50.20%的α-螺旋(alpha helix)、27.45%的无规则卷曲(random coil)、14.51%的延伸链(extended strand)和7.84%的β-转角(beta turn);该蛋白位于细胞核内;其氨基酸序列中含有高度保守的MADS结构域、相对保守的K结构域、低保守的I结构域和最不稳定的C结构域,是典型的MIKC型MADS-box蛋白;系统进化树分析表明,ZmMADS-RIN蛋白属于AGL6分枝,与水稻基因OsMADS6的相似性最高,为89%。ZmMADS-RIN基因在玉米自交系郑58的籽粒中特异表达,在根及不同时期的叶片中没有检测到表达信号。荧光定量PCR结果显示,ZmMADS-RIN基因的表达量在玉米籽粒发育的不同阶段呈一定规律的变化,在授粉后0~20 d,呈上调表达趋势,授粉后25 d表达量迅速下降至较低水平,而在授粉后30~40 d则检测不到其表达。推测该基因可能与玉米籽粒的发育有关。     

不同光照条件下热带玉米自交系间的转录水平差异分析

光周期敏感性差异是影响玉米在不同光长条件下是否能够正常开花结实的重要因子之一.分析比较不同光照条件下热带玉米光敏型与光钝型自交系基因表达差异,能够为解析玉米光周期敏感性变异的分子机制提供更丰富的科学依据.本研究以光钝感自交系QR273和光敏感自交系T32为材料,通过人工控制光照长度分别对其进行长短日照处理,利用RNA-Seq技术对九叶期的基因组表达差异进行分析.结果 表明,不同光照条件能够影响昼夜节律和应答辐射相关基因的表达,其中昼夜节律相关基因在不同光照条件下的表达量均呈极显著性差异.结合材料的光周期反应情况,不同光照长度条件下,影响玉米光反应差异的主要调控途径为GI-CO-FT,初步揭示了热带玉米种质光周期诱导开花的分子调控基础.     

玉米冷响应基因ZmCyp40克隆及其遗传转化

从抗冷玉米自交系W9816中克隆冷响应基因ZmCyp40,对该基因进行序列分析,发现其编码389个氨基酸,与高粱中的同源基因亲缘关系较近。qRT-PCR分析玉米自交系W9816低温(4℃)处理0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h后其根、茎、叶中基因ZmCyp40表达情况,发现ZmCyp40在玉米不同部位冷响应表达趋势不同,但均受冷诱导表达。构建ZmCyp40过表达载体,采用农杆菌介导法转化玉米优良自交系Y423的幼胚和愈伤。PCR检测转化植株,ZmCyp40阳性植株率为5.9%。qRT-PCR分析发现部分阳性植株中ZmCyp40基因的表达量有极显著的升高,可用于进一步的功能分析及玉米抗冷性状的遗传改良。     

玉米抗逆基因ZmqLTG3-1的克隆及功能分析

以玉米自交系豫82为材料,同源克隆了与水稻q LTG3-1基因同源的玉米Zmq LTG3-1基因。序列分析发现,该基因c DNA序列全长606bp,开放阅读框441bp,编码包含147个氨基酸的蛋白。该蛋白含有AAI_LTSS超蛋白家族的LTP(含8个半胱氨酸)保守结构,分子量为14.16k Da,等电点是8.3,与高粱、水稻的相似度分别为92%和88%。荧光定量RT-PCR分析结果表明,Zmq LTG3-1在玉米胚中的表达量最高,其次是茎尖,在叶、根等器官中的表达量较低;随着胚萌发时间的延长,其表达量逐渐增加,在萌发24h时呈现最高丰度表达,之后表达丰度与萌发时间呈现规律性下降。亚细胞定位结果表明,该基因所编码的产物被定位在细胞膜上,是一跨膜蛋白。通过农杆菌介导的花序侵染法将过表达载体OE-Zmq LTG3-1和空载体p CAMBIA1304转入拟南芥,在诸如干旱、高温和盐等非生物胁迫下,与对照相比,T3转基因植株的成活率显著提高,说明Zmq LTG3-1基因对于抵抗非生物胁迫发挥了重要作用。     

一个 T-DNA 插入突变体的分子鉴定及表达分析

突变体在水稻功能基因组研究中具有重要的作用。对水稻OsFCA位点的插入突变体进行了分子鉴定,证实此突变体为纯合突变体,并且发现突变体与野生型植株相比,抽穗期明显延迟。通过RT-PCR结果分析表明, T-DNA插入的突变体植株中OsFCA基因完全不表达。另外,在短日照条件下,对水稻成花相关的2个重要基因Hd1和Hd3a的RT-PCR分析表明,在野生型植株中,2个基因的表达量都明显高于突变体植株,尤其是在夜间的表达量相差较为明显。说明OsFCA在短日照条件下通过正向调控Hd1和Hd3a的表达促进水稻的开花。     

不同光温条件谷子光温互作模式研究及SiCCT基因表达分析

光周期和温度是影响作物生长发育、生态适应性和产量的2个重要环境因素,揭示光温互作对作物生长发育的效应及其分子机制对育种实践和理论研究具有重要意义。本研究设置长日照高温、长日照低温、短日照高温、短日照低温4个光温处理,调查‘黄毛谷’抽穗期、株高、叶片数和穗长。结果表明,光周期对谷子的发育起关键作用,温度的改变不影响长日照比短日照延迟谷子生殖生长的效应,温度的作用随光周期的不同而异,短日照条件下,高温缩短谷子营养生长期而低温延长营养生长期,长日照条件下则相反;对谷子生殖生长的促迚作用是短日照高温短日照低温长日照低温长日照高温。利用RT-PCR技术从‘黄毛谷’叶片兊隆了一个CCT结构域基因(SiCCT),该基因编码286个氨基酸,属于CMF亚家族成员,基于CCT域基因氨基酸序列的系统迚化分析,谷子与高粱、玉米亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现, SiCCT基因在‘黄毛谷’叶片中高表达,其次为幼穗和叶鞘;长日照、短日照处理SiCCT基因均表现24h昼夜节律性特点,短日照七叶期表达水平最高,八叶期(抽穗)及穗后表达迅速降低,长日照七叶至十叶期‘黄毛谷’处于营养生长期,SiCCT基因维持较高表达水平;无论高温低温,长日照条件下SiCCT基因在各叶期表达量整体高于短日照处理,长日照条件下低温处理SiCCT基因的相对表达量明显低于高温处理, SiCCT基因的总体表达量与‘黄毛谷’营养生长期存在正相关。总之SiCCT基因受光周期调控,同时也受温度调控,因而推测SiCCT基因参与了光周期途径和感温性途径,并通过二者互作调控谷子营养生长和生殖生长的全过程。     

结球甘蓝BoLH01和BoLH02基因的克隆与表达

bHLH类转录因子在植物叶片形态建成和发育过程中发挥重要的生理功能。本文通过结球甘蓝转录组数据分析,筛选出莲座期和结球期的茎尖间与叶片间均显著差异表达的2个bHLH类转录因子,命名为BoLH01和BoLH02基因,获得了2个基因的编码序列,其中BoLH01基因CDS全长为966 bp、编码321个氨基酸;BoLH02基因CDS全长870 bp、编码289个氨基酸;序列分析表明BoLH01和BoLH02分别与拟南芥AtbHLH18和AtbHLH19氨基酸同源相似性最高,达81%和74%,均具典型bHLH结构域特点和完全保守的13E-16R和9H-13E-17R以及Leu23对应的关键氨基酸位点;分子进化上BoLH01、BoLH02与AtTCP2/3/4/10/24亲缘关系较近,与AtTCP9/11/14/15较远;转录组和荧光定量PCR分析表明BoLH01和BoLH02在平展的莲座叶中表达量较低,在卷曲的球叶中高量表达;序列分析BoHB7、BoHB12和BoILL6的ATG上游均包含能被bHLH功能域识别的E-box序列,对BoHB7、BoHB12和BoILL6荧光定量PCR分析表明, 三者与BoLH01和BoLH02在不同时期叶片中表达量的变化趋势完全一致;说明BoLH01和BoLH02可能通过正向调控BoHB7、BoHB12、BoILL6基因的表达来参与甘蓝叶片卷曲的调控。     

玉米非生物逆境响应基因ZmASK1的克隆及表达特性分析

类Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因在植物发育和逆境应答中起着十分重要的作用。通过RT-PCR方法从玉米中克隆了一个与Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因同源的全长cDNA, 命名为ZmASK1(abiotic stress-induced kinase)(GenBank accession No., AY722707)。推测ZmASK1蛋白含有426个氨基酸, 分子量为48.5 kD, 等电点为8.7。半定量RT-PCR分析表明, ZmASK1可以被甘露醇、高盐和脱落酸(ABA)诱导。另外, 在不同的组织中, ZmASK1的表达模式也不一样, 在子房中的表达量最高。这些结果表明, ZmASK1可能在植物逆境反应及生殖生育过程中起多重作用。本文是玉米类Shaggy/GSK-3蛋白激酶基因参与胁迫和发育过程的首次报道。     

A novel Tos17 insertion upstream of Hd1 alters flowering time in rice

Heading date 1 (Hd1) is one of the major determinants of flowering time and regional adaptability in rice (Oryza sativa L.), because there is a significant correlation between Hd1 allelic diversity and phenotypic differences in rice cultivars. In this study, we isolated a novel rice mutant with a Tos17 retrotransposon insertion upstream of Hd1. The Tos17 insertion mutant of Hd1 [designated as Tos17(Hd1)] had decreased photoperiod sensitivity and mRNA expression of Hd1, as compared with wild‐type Nipponbare. Between Tos17(Hd1) and Nipponbare, expression levels of OsPRR1 and OsGI were similar, whereas those of two florigen genes Hd3a and RFT1, were significantly different under both short and long‐day conditions. Tos17(Hd1) showed photoperiod sensitivity intermediate between that of Nipponbare and a near‐isogenic line having a non‐functional allele of Hd1, indicating that Tos17(Hd1) has an attenuated but functional Hd1 allele. Our results revealed that allele mining of Hd1 may provide good opportunities to develop novel rice cultivars showing different levels of photoperiod sensitivity.     

性别决定基因TASSELSEED2在水稻中的功能歧化性浅析

花器官的发育不仅影响农作物的生产,通过性别决定产生单性花的机制亦是重要的基础理论问题。TASSELSEED2基因是与JA合成有关的调控玉米单性雄花产生的性别决定基因,对一些植物中TS2同源基因的表达分析表明TS2蛋白可能在进化过程中产生了功能歧化。为探究TS2蛋白在进化过程中其功能是否发生了歧化,首先通过生物信息学手段对水稻和玉米的TS2基因进行了比较分析,分子进化分析表明,TS2基因在一些植物中可能并不仅仅局限于抑制雌蕊发育的性别决定功能。因此,猜测两性花植物水稻中的TS2可能具有其他功能。利用蛋白质三维结构预测软件,发现水稻TS2基因编码典型的SDR蛋白,含有保守的GASGIG和YTASK基序,其作用底物可能与玉米TS2蛋白类似。启动子分析表明OsTS2和玉米TS2的激素应答元件存在差别。随后,利用RNA-seq数据进行了OsTS2与玉米TS2的组织器官表达分析,并利用实时荧光定量技术考察外源Me JA喷施处理对OsTS2与玉米TS2基因表达的影响。结果表明,OsTS2主要在花序中表达,经外源MeJA处理后其表达量明显升高;而玉米TS2在雄穗分化关键期的叶片中表达量最高,其表达量基本不受外源Me JA影响。OsTS2与玉米TS2表达方面的差异提示水稻TS2可能具有与玉米TS2不同的功能,为深入了解TS2在两性花植物中的功能提供了线索。     

水稻灌浆期叶鞘蛋白质差异表达分析

为研究叶鞘在籽粒灌浆期间代谢的分子机理, 应用差异蛋白质组学方法分析了大穗型水稻“金恢809”在籽粒灌浆不同时期, 叶鞘的蛋白质组变化趋势, 共检测到23个差异蛋白质点, 其中11个得到鉴定, 并按其表达丰度的变化分为6类。第1类, 随着灌浆进程表达量逐渐降低, 如α-亚基草酰乙酸脱羧酶; 第2类, 表达量先升后降, 如二磷酸核酮糖羧化酶小链和ADP-核糖基化因子１; 第3类, 表达量先降后升再降低, 如生长素响应因子、锌指-C3HC4型家族蛋白、液泡H+-ATP酶和二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活化酶; 第4类, 表达量先升后降再升又降, 如核酮糖α亚基结合蛋白; 第5类, 表达量先降后升, 如金属硫蛋白II相似蛋白-1A和牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶; 第6类, 表达量逐渐升高, 如蛋白激酶家族蛋白。这6类蛋白分别参与叶鞘光合作用、激素调节、物质转运、植株衰老的抗性反应以及细胞信号转导, 共同调控叶鞘的源、库、流转化。     

大豆CML38-like基因的克隆及表达载体构建

类钙调蛋白(CaM-likeprotein,CML)在植物抵抗逆境中发挥了重要的作用,因此研究CML基因是植物抗逆分子育种的一个重要分子基础。本实验室在前期工作中筛选得到1个片段大小为264 bp的大豆CML基因,对该基因序列设计特异性引物,利用PCR技术对该基因进行扩增,并获得大小为264 bp的片段,利用无缝克隆技术连接到pMD18T载体上,获得克隆载体。通过对该基因的核苷酸序列分析,在NCBI上发现该基因序列与大豆Calcium-binding protein(CML38-like)基因序列相似度为98.53%。目前对CML38-like基因的功能还未见报道,本研究根据克隆测序得到的基因序列构建系统进化树并分析,随后对该基因的蛋白质二级结构和蛋白质三级结构进行预测,发现该基因可能对大豆抗旱有着一定的影响。最后通过克隆载体构建CML38-like基因的过表达载体以及RNA干扰表达载体。本研究为鉴定大豆CML38-like基因的功能和了解该基因对大豆的非生物胁迫反应的影响提供了理论依据。     

一个新的水稻逆境响应基因OsMsr1的表达与克隆

为深入了解植物的逆境反应机理和发现新的水稻耐逆基因, 采用Affymetrix水稻表达芯片(含51 279个转录本)分析了超级稻两优培九母本培矮64S不同生长发育时期、不同组织器官全基因组在低温、干旱、高温逆境胁迫下的表达水平, 筛选出众多表达水平显著升高与降低的基因。OsMsr1 (Oryza sativa L. multiple stresses responsive gene 1, GenBank登录号为EU284112) 是其中一个受高温、低温与干旱诱导、在各生长发育时期与组织器官均显著上调的基因, 用实时定量PCR方法对其表达水平进行了进一步的分析, 所得结果与基因芯片结果基本吻合, 因此, 此基因为一多逆境响应基因。用RT-PCR方法扩增获得了包含其完整ORF (open reading frame)的cDNA克隆。根据其ORF序列进行预测, 此基因编码一个包含89个氨基酸残基的小分子蛋白, 分子量约为10 kD, pI约为5。搜索有关数据库, 在水稻、玉米、小麦与拟南芥中找到有高相似性的基因, 但功能未知, 也未发现相同与类似的已知功能的基因保守结构域。对其可能的启动子序列分析, 发现5个与逆境反应有关的顺式作用元件。因此, 我们认为该基因为一新的水稻耐逆候选基因, 进一步的研究正在进行。     

超级中籼杂交水稻氮素积累利用特性与物质生产

在大田条件下比较了5个超级稻品种和对照汕优63的物质生产及氮素吸收利用特性。结果表明, 超级稻物质生产与积累优势始于拔节期, 并随着生育进程而扩大, 抽穗以后的干物质量积累优势明显。超级稻对氮素的吸收积累总量达196.5 (184.3~200.8) kg hm^-2,较对照的176.5 kg hm^-2增加20.0 kg hm^-2, 其中拔节前与对照相当, 拔节至抽穗期增加9.2 kg hm^-2, 抽穗至抽穗后25 d增加4.9 kg hm^-2 , 抽穗后25 d至成熟期增加4.3 kg hm^-2。氮素吸收速率拔节至孕穗阶段达最高峰, 超级稻为3.68 (3.44~3.96) kg N hm^-2 d^-1, 对照为3.55 kg N hm^-2 d^-1; 孕穗期以后吸氮速率随着生育进程而逐渐下降, 抽穗25 d以后, 对照基本不具再吸收能力, 而超级稻仍具一定吸收能力(0.36 kg N hm^-2 d^-1)。超级稻生育中、后期氮素吸收利用能力的提高促进了抽穗和灌浆结实期植株特别是叶片含氮率的提高, 孕穗期、抽穗期、抽穗后25 d、成熟期叶片含氮率均与相应生育阶段的干物质积累量显著相关, 与最终总生物量极显著相关。超级稻在10.5 t hm^-2产量水平下的百千克籽粒吸氮量在1.83 kg左右。     

水稻抽穗期控制候选基因的SNP/InDel多态性分析

抽穗期是水稻的一种重要农艺性状，但其遗传控制机理还不清楚。本文利用数据库搜索的方法，搜索并分析了30个与拟南芥光周期调控途径花期控制基因同源的水稻基因。利用水稻多态性数据库，得到了发生在这些基因以及Hd6、Ehd1、OsSOCl上的820个SNP及191个InDel位点。分析表明，这些位点不是平均分布到每个基因上。SNP／InDel含量较高的基因存在SNP／InDel的热点片段。14．1％的SNP位点，及7％的InDel位点分布在基因的编码区。本文也分析了侯选基因侧翼5Kb范围内的SNP／InDel多态性位点。按照侧翼多态性位点数目的分布可以将侯选基因分成4种类型，即两侧保守型、两侧热点型、单侧热点型、一侧热点一侧保守型。