基于“多基因聚合-早世代组配”策略的水稻分子改良研究

传统水稻育种技术最主要瓶颈是选择效率低和周期长。为了提高水稻优异材料选育和杂交稻组配效率,创新水稻分子育种策略,利用分子标记辅助选择多基因聚合和早世代杂交组配,展开水稻恢复系分子改良和杂交新组合的调查评价。供体亲本H318与恢复系亲本华占进行杂交,通过选择和设计关键有利基因的分子标记,利用毛细管电泳基因分型技术,将Wxb、fgr、Xa23、Pi2、Pi46以及Pita 6个稻米品质、香味、抗白叶枯病和抗稻瘟病相关功能基因进行聚合利用。通过多世代的田间生物学性状调查,米质、抗性等表型鉴定,获得14份以恢复系华占为遗传背景,目标基因纯合的优质、双抗和香型稳定的水稻株系。依据材料稳定遗传特性,将改良后代株系与生产应用的不育系进行测配和组合的调查评价,筛选获得潜在优良杂交稻。在育种进程中采用"多基因聚合-早世代组配"策略,实现多个有利基因快速聚合,定向改良稻米品质和抗病性等关键性状,并且促进杂交水稻组合的高效选育。     

水稻抗白叶枯病基因Xa21转基因水稻及其杂交稻研究

用基因枪转基因技术将高抗白叶枯病的Xa21基因导入中国三系杂交稻恢复系(明恢63)和保持系(皖B)中，获得转基因水稻系，其中4个株系只含有Xa21基因，不含选择标记潮霉素抗性基因hph。筛选抗白叶枯病转基因纯合系，在田间种植6代，用PCR检测证明，Xa21基因能稳定遗传表达。用转基因水稻配制两系杂交稻，杂交组合F1含有Xa21基因     

利用CRISPR/CAS9基因编辑技术创制香型郑稻19新种质

有特殊香味的稻米深受我国消费者欢迎,是优质水稻的重要指标之一,本研究通过基因编辑创制香型优质水稻新种质。水稻中甜菜碱醛脱氢酶基因Badh2是控制香味的关键基因,以适于直播品种郑稻19为供体材料,利用CRISPR/CAS9技术定点突变水稻Badh2基因。获得T0代转基因阳性植株11株,其中9株子粒有香味,检测6个香型T1株系靶点序列,6个株系均发生突变,发现7种突变类型,5种是缺失类型,2种插入类型,其中3个株系（T1-2、T1-3和T1-7）出现双等位突变。6个T1代株系共测序22个单株,检测到纯合突变10株;T2代检测28株,其中纯合突变21株。以潮霉素抗性基因引物检测T1-2、T1-6和T1-7株系后代单株载体脱落情况,T1代3个株系未获得无载体纯合突变单株,T2代中获得8株无载体纯合突变单株,来源于T1-2株系有3株,来源于T1-7株系5株。T0代9株香型单株子粒2-AP含量1.259±0.072μg/g,T1代8个突变株系2-AP含量0.537±0.111μg/g,均显著高于对照郑稻19。考察中选T1-2、T1-7株系的农艺性状,与郑稻19无显著差异。这些无载体突变单株可作为香型种质在种质创新和育种中应用。     

分子标记辅助选择聚合棉花Rf1育性恢复基因和抗虫Bt基因

胞质雄性不育恢复系0-613-2R与转Bt基因抗虫棉R019(轮回亲本)杂交、回交产生BC2群体。利用CMS恢复基因Rfl紧密连锁的3个SSR标记和Bt基因的PCR标记开展分子标记辅助选择培育聚合有Rfl和Bt的转基因抗虫棉恢复系。在分析的59个BC2单株中55株存在恢复基因标记，54株存在Bt基因；综合标记分析结果，共获得54个同时具Rfl与Bt基因的聚合单株；这些聚合单株自交后，通过标记辅助选择，获得10株含Bt基因且Rfl纯合的单株。为棉花优良恢复系的快速培育提供了重要基础。     

转Bt+Sck双价基因棉花的遗传稳定性研究

外源基因在转基因植物中遗传和表达的稳定性,直接关系到转基因材料的应用前景。本研究以转Bt+Sck双价基因棉花纯合株系312-5T2、332-2T2的T0,T1,T2和T3及T4连续世代为材料,Southern杂交进一步证明外源基因已经整合到棉花的基因组,并稳定地遗传给后代;RT-PCR以及抗虫性测定表明,外源抗虫基因在各个转基因世代稳定的表达,为该材料的育种应用打下了基础。     

转双价广谱抗病基因创造甘蓝型油菜抗菌核病新品种的研究

菌核病严重威胁着我国长江中下游地区甘蓝型油菜的生产，几乎每年都会导致甘蓝型油菜的大面积减产。来自于烟草的葡聚糖酶(Glucanase)基因，其编码产物能降解真菌的细胞壁结构成分一葡聚糖。来自于烟草的植物蛋白AP24则属于细胞程序性死亡(PCD)的诱导蛋白，对多种真菌具明显抑制作用。前期已成功地将这两个广谱抗病基因导入甘蓝型油菜，并且通过表型鉴定，在T0和T1代检测到了核盘菌抗性。本实验对转基因T2代和T3代甘蓝型油菜进行分子鉴定和田间抗病性鉴定。经过PCR分子鉴定，从14个转基因T3代甘蓝型油菜株系中筛选到4个外源基因已经纯合的株系。对株系GA02—2的RT—PCR鉴定则进一步证明外源广谱抗病基因在RNA水平上的大量表达。田间抗性鉴定主要利用苗期离体叶接种和成株期茎杆插签接种这两种方法。结果表明，T2代转基因株系中有5个株系表现为抗病基因初步纯合，5个株系表现为隐性纯合，12个株系处于分离当中，其中株系GA02—2的抗病性鉴定结果与RT—PCR鉴定的结果吻合。18个T3代转基因甘蓝型油菜株系中有7个株系表现为抗性纯合，3个株系剖现为隐性纯合，其余8个株系基本上仍在分离中，其中株系GA02—2—1的抗病性鉴定结果与前面的分子鉴定以及上代的抗病性鉴定完全吻合。综合分子鉴定和抗病性鉴定结果，筛选出抗病效果良好的转基因纯合株系应用于抗病育种。     

分子标记辅助选择Xa23基因改良杂交稻亲本的白叶枯病抗性

白叶枯病是世界上影响水稻产量最严重的病害之一,本研究利用携有目前已知的、抗谱最广和抗性最强的显性基因Xa23的水稻材料CBB23作为基因供体,以感白叶枯病的杂交水稻的3个骨干亲本培矮64S、明恢86和C418作为受体,采用杂交和复交,在分离群体中利用与Xa23紧密连锁的SSR标记RM206进行分子标记辅助选择。通过分子标记检测、田间抗性鉴定和农艺性状选择,BC3F3株系中获得Xa23基因纯合且农艺性状稳定的培矮64S、明恢86和C418。获得的恢复系或不育系及配制的杂交组合在田间对我国7个以及菲律宾P1和P6白叶枯病生理小种都具有抗性。     

利用广谱抗病基因Pigm改良水稻稻瘟病抗性

为改良已选育的高产优质粳稻高代新品系的稻瘟病抗性,以引进的携带有水稻广谱抗稻瘟病基因Pigm的籼稻品种谷梅4号和粳稻材料MP3为供体,利用花粉管通道技术将其基因组DNA导入到SD-2、SD-3、SD-4、SD-5、SD-6、DJ13、ZD15、14PB1和14PB4等高代品系和品种宁粳43号中,利用Pigm基因的显性标记M26205和M80410对受体及获得的导入系进行检测,结果表明:在所有受体中,两个标记均未扩增出条带,说明所有受体本身都不含Pigm基因;在检测的854株导入株系中,利用标记M26205检测总共有328株能够扩增出856 bp,或1 019 bp和856 bp的条带,初步推断这328个株系携带有Pigm基因,平均阳性株率为40.51%;利用标记M80410检测总共有169株能够扩增出517 bp的条带,推断这169个株系可能携带有Pigm基因,平均阳性株率为19.83%。选择两个标记能同时检测出的阳性植株107株作为Pigm基因的导入系,进行进一步的加代培育和辅助选择。     

两个低谷蛋白基因插入缺失标记的设计与验证

低谷蛋白稻米是肾脏病人极有效的食疗辅助品,培育低谷蛋白功能性水稻品种具有重大意义。低谷蛋白基因Lgc1作为培育低谷蛋白功能性水稻品种的优质资源,受到了育种家的青睐。为提高低谷蛋白基因Lgc1分子标记辅助选择的准确性,我们根据其突变体在两个谷蛋白基因GluB4和GluB5间的碱基缺失,设计出了Lgc1基因的插入缺失标记InDel-Lgc1-A和InDel-Lgc1-B。利用InDel标记对W3660(Lgc1低谷蛋白品种)/南粳46(谷蛋白正常品种)的F2分离群体和13份水稻品种进行检测验证。依据其PCR扩增产物的电泳带型,可准确地区分出低谷蛋白纯合基因、谷蛋白正常纯合基因和杂合基因型3种带型,且3种带型与其植株或品种相应的蛋白性状表现完全一致,表明这两对InDel标记可用于Lgc1低谷蛋白基因资源的鉴定以及分子辅助育种。     

利用 F2 转 Bt 基因抗虫杂交棉新策略

通过不同抗虫棉品系间互交、后代选择的方法选育出聚合整合位点不同的Bt基因纯合抗虫棉种质,开展了培育以 F2 利用为目的的杂交种探索研究.类似 F2 世代 Bt 基因的不同分离类型,聚合有不同数目 Bt 基因的棉株在整个生育期对棉铃虫有显著的抗虫性.并且与单价抗虫棉时空表达一致,生育前期抗虫性好,毒蛋白表达量高,中、后期抗虫性有所下降,毒蛋白表达量降低.因此,用其作为亲本配置抗虫杂交种,是利用棉花F2 杂种优势的途径之一.     

Breeding of transgenic rice restorer line for multiple resistance against bacterial blight, striped stem borer and herbicide

In this paper, we described the breeding of transgenic rice restorer line for multiple resistance against bacterial blight, striped stem borer (SSB) and herbicide by conventional crossing of two transgenic parental lines transformed independently with different genes. Two stable transgenic rice lines used as donor parents were developed, one was Zhongguo91 which contained cry1Ab gene (for insect resistance) and bar gene (for tolerance of herbicide), and the other was Yujing6 which contained Xa21 gene (resistance to bacterial blight). The elite restorer line Hui773 was used as recipient and crossed with the two stable transgenic rice lines. Then five successive backcrosses were made using Hui773 as recurrent parent. Two rice elite restorers, T773-1 expressing cry1Ab and bar genes and T773-2 expressing Xa21 gene, were obtained, which were confirmed by PCR analysis and testing selectable marker genes in the hybrid progenies. The cross was made between T773-1 and T773-2 to select stable restorer line carrying Xa21, cry1Ab and bar genes. Finally, we obtained transgenic restorer line T773 with good agronomic traits and obvious multiple resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae, striped stem borer (Chilo suppressalis) and herbicide. The hybrid F₁ generation produced from the cross between transgenic restorer line T773 and a corresponding male sterile line Zaohua2A maintained obvious resistance to rice bacterial blight, rice leaffolder and striped stem borer, and showed significant heterosis. Our results indicate that it is feasible to develop transgenic hybrid rice cultivar through breeding transgenic restorer lines.     

水稻转录因子WRKY68在Xa21介导的抗白叶枯病反应中发挥正调控作用

白叶枯病是一种严重影响水稻产量的细菌性病害。Xa21是第一个克隆的抗白叶枯病基因,具有广谱抗性,在水稻抗病育种中被广泛应用。转录因子的鉴定对解析Xa21介导的水稻抗白叶枯病分子机制具有重要意义。本研究构建了Xa21背景下的WRKY68-RNAi转基因水稻。与受体材料4021相比,转基因水稻中WRKY68蛋白质丰度下调,接种白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)后抗病性下降,证明WRKY68基因在Xa21介导的抗白叶枯病反应中发挥正调控作用。此外,转基因受体材料4021和感病对照TP309接种后不同时期和部位叶片中WRKY68的蛋白质丰度没有显著差异,表明WRKY68蛋白质的表达不受抗病基因Xa21和病原物Xoo诱导,推测其功能主要是调控下游基因的表达。WRKY68-RNAi转基因水稻接种后, PR1A、PR5、PR10A、PR-pha和PAL1等病程相关蛋白质表达丰度发生变化,表明相关基因可能在WRKY68基因的调控下参与下游抗病反应。     

水稻抗病蛋白质XA21的免疫纯化及双向电泳分离研究

在优化水稻叶片蛋白质提取方法的基础上,利用免疫沉淀对水稻中的XA21蛋白质进行了富集纯化,继而通过TCA-丙酮法脱盐,用尿素、硫脲溶解后进行双向电泳分离和Western检测,实现了对高分子量、低丰度表达的、可能的膜蛋白XA21的分离检测,为其翻译后修饰方式研究奠定了基础.     

Pyramiding of Xa7 and Xa21 for the improvement of disease resistance to bacterial blight in hybrid rice

‘Minghui 63’ is a restorer line widely used in hybrid rice production in China for the last two decades. This line and its derived hybrids, including ‘Shanyou 63’, are susceptible to bacterial blight (BB), caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). To improve the bacterial blight resistance of hybrid rice, two resistance genes Xa21 and Xa7, have been introgressed into ‘Minghui 63’ by marker‐assisted selection and conventional backcrossing, respectively. The single resistance gene‐introgressed lines, Minghui 63 (Xa21) and Minghui 63 (Xa7) had higher levels of resistance to bacterial blight than their derived hybrids, Shanyou 63 (Xa21) or Shanyou 63 (Xa7). Both Xa21 and Xa7 showed incomplete dominance in the heterozygous background of rice hybrids by infection with GX325 and KS‐1‐21. The improved restorer lines, with the homozygous genotypes, Xa21Xa21 or Xa7Xa7, were more resistant than their hybrids with the heterozygous genotypes Xa21xa21 or Xa7xa7. To further enhance the bacterial blight resistance of ‘Minghui 63’ and its hybrids, Xa21 and Xa7 were pyramided into the same background using molecular marker‐aided selection. The restorer lines developed with the resistance genes Xa21 and Xa7, and their derived hybrids were evaluated for resistance after inoculation with 10 isolates of pathogens from China, Japan and the Philippines, and showed a higher level of resistance to BB than the restorer lines and derived hybrids having only one of the resistance genes. The pyramided double resistance lines and their derived hybrids have the same high level of resistance to BB. These results clearly indicate that pyramiding of dominant genes is a useful approach for improving BB resistance in hybrid rice.     

水稻抗白叶枯病基因Xa14的遗传定位

Xa14是一个高抗菲律宾白叶枯病生理小种5的显性基因,Taura等将它定位在水稻第4染色体长臂末端。本研究利用中国国家基因中心的水稻第4染色体测序结果,用SSR标记对Xa14进行遗传定位,为进一步用图位克隆法克隆该基因奠定基础。利用775株IRBB14/IR24 F₂中的145株高感群体,将基因Xa14限定在SSR标记HZR970-8和HZR988-1之间的区间,与两个分子标记的距离各为0.34 cM,并找到了在该群体中与基因共分离的HZR645-4、HZR669-2、HZR669-5和HZR669-7四个SSR标记。利用763株IRBB14/珍珠矮F₂中158株高感群体,将基因Xa14限定在分子标记HZR648-5与RM280之间的区段,找到了一个与基因紧密连锁的SSR标记HZR648-5,与基因的距离为1.90 cM。将两个F₂群体的定位结果进行整合,表明Xa14位于分子标记HZR970-8和HZR988-1之间的3个BAC克隆上,并与这两个标记紧密连锁。     

不同Xa21转基因杂交稻组合的大田试验与分析

在北京、四川和江苏等地对Xa21转基因杂交稻进行了大田释放实验. 分别对转基因纯合的3个恢复系明恢63-Xa21、盐恢559-Xa21和C418-Xa21与各种不育系配组的23个杂交组合进行了抗性和农艺性状分析. 在不同的杂合遗传背景下转基因Xa21稳定遗传和高效表达, 所有杂交组合均具有对白叶枯病的广谱抗性. 转基因恢复系配制的杂交组合与     

云南高原粳稻抗白叶枯病新品系云资抗21号的选育

以高产优质的云南高原粳稻品种滇系4号为轮回亲本，以IRBB21为白叶枯病抗性基因Xa21的供体亲本，通过杂交和3次回交以及5次自交形成BC3F，代材料，并结合后代材料的白叶枯病抗性鉴定及农艺性状的评价选择，选育出高原粳稻新品系云资抗21号，对云资抗21号的21个单株采用与Xa21连锁标记RM21和RM229、以及22个独立分离的SSR标记进行检测，结果表明这21个单株在RM21位点上均为IRBB21的纯合基因型，在RM229位点上有1个单株显示为轮回亲本的纯合基因型，其余的20个单株均为IRBB21的纯合基因型，而在其余22个SSR标记位点上均显示为轮回亲本的纯合基因型。该新品系白叶枯病抗性与IRBB21相近，农艺性状与轮回亲本相似，具有很好的应用前景。     

分子标记辅助培育水稻抗白叶枯病和稻瘟病三基因聚合系

水稻的白叶枯病和稻瘟病是水稻的两大主要病害, 通过分子标记辅助选择与传统的杂交、自交相结合的方法, 将抗稻瘟病的Pi9(t)基因和抗白叶枯病的Xa21及Xa23基因聚合到同一株系中, 经多代大田或/和温室接菌鉴定、室内标记选择和田间农艺性状的筛选, 获得了4个三基因聚合且农艺性状优良的株系L17~L20。用不同国家和地区的20个稻瘟病小种、中国流行的7个白叶枯病菌系C1~C7以及安徽省流行的白叶枯病菌系进行大田或/和温室抗病性鉴定, 结果显示, 株系L17~L20对20个稻瘟病小种均表现出抗性, 抗性水平与Pi9(t)基因的供体亲本75-1-127相当, 抗谱相同; 对白叶枯病的抗性和抗谱与Xa23基因相似, 不论在苗期还是在成株期均抗白叶枯病。与Xa21、Xa23基因的供体亲本M12和CBB23相比, 成株期的抗性水平有所增强。利用多重PCR技术, 在同一PCR反应中可同时选择Pi9(t)和Xa21基因, 提高了PCR选择效率。     

水稻白叶枯病抗性基因Xa7候选基因的实时荧光定量表达分析

水稻白叶枯病抗性基因Xa7精细定位的区域包括三个与抗性相关的候选基因。为研究这三个候选基因在水稻抗性反应中的作用,本研究利用水稻白叶枯黄单胞菌SCB4-1(Ⅳ型菌)接种分别在20℃、26℃和32℃条件下栽培的感病品种IR24及其含有Xa7基因的近等基因系IRBB7,采集接种前0d(对照),及接种后0.5d、1d、2d、3d、4d、5d和6d的叶片,通过实时荧光定量PCR技术,研究在不同温度条件下Xa7三个候选基因(CG-XA7-1、CG-XA7-2、CG-XA7-3)在IRBB7和IR24中的表达情况。研究结果表明,在20℃条件下,CG-XA7-1和CG-XA7-2在IRBB7的表达量比IR24的低,CG-XA7-3的个别时间点在IRBB7的表达量比IR24的高,但并不显著;在26℃和32℃条件下,三个候选基因在IRBB7的表达量比IR24的高。对于抗病品种IRBB7,三个候选基因在26℃时的相对表达量比在20℃和32℃的高;对于感病品种IR24,三个候选基因在20℃时的相对表达量比在26℃和32℃的高。根据白叶枯病的发生适宜气温为25～30℃,而20℃以下和33℃以上该病发生受抑制的特点,测试的三个候选基因的表达量与水稻白叶枯病抗性有较高的相关性,可能在白叶枯病抗性反应中发挥一定的作用。